EXPRESIN EN E.

coli DEL DOMINIO AMINO-TERMINAL DEL

NEURORRECEPTOR GABA
C
-1
Leija Izaguirre T. E.
(1)
, Martnez Torres A.
(2)
(1)
Facultad de Qumica
Universidad Autnoma de Quertaro
(2)
Instituto de Neurobiologa
Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Campus Juriquilla

RESUMEN
La inhibicin del sistema nervioso central (SNC) durante la transmisin sinptica est
mediada principalmente por el cido -aminobutrico (GABA), responsable de la activacin
de receptores especficos que reducen la excitacin neuronal. Los receptores GABA
c
estn
formados por tres subunidades distintas: 1, 2 y 3, las cuales se localizan en la membrana
plasmtica formando complejos homomricos y heteromricos.
El presente trabajo pretende la expresin del dominio amino terminal de la subunidad 1 de
H. sapiens en E.coli utilizando un plsmido diseado para este fin (pET28b) el cual porta
dicha regin del gen GABA 1 bajo la regulacin del promotor transcripcional del fago T7
(Mora Jurez y col., 2007). Se transformaron bacterias de la cepa ER2566 por medio de
choque trmico y se verific la identidad del plsmido por electroforesis en gel y anlisis con
enzimas de restriccin. Las bacterias transformadas fueron expuestas a IPTG para la
activacin transcripcional del promotor y se colectaron 24h despus para su anlisis por
PAGE. Los resultados mostraron que el plsmido es sumamente inestable en la cepa de
expresin utilizada, ya que no se encontr en las bacterias inducidas. En contraste, en otras
cepas de E. coli que no tienen el gen de la RNA polimerasa T7 (tal como la cepa XL1-blue) el
plsmido es estable. En conclusin, la aparente inestabilidad del DNA de pET281 en
ER2566 ha impedido su expresin adecuada. Sin embargo, se deber intentar su expresin en
otras cepas de E. coli para optimizar su produccin.

INTRODUCCIN
Los receptores a GABA se han clasificado segn sus propiedades farmacolgicas en GABA
A
,
GABA
B
y GABA
C
(Kusama y col., 1993). Los receptores GABA
A
y GABA
C
son canales
ionotrpicos selectivos a cloro pertenecientes a la familia de receptores nicotnicos; mientras
que GABA
B
pertenece a la familia de receptores acoplados a la protena G, cuya accin es
mediada por la apertura/cierre de otros canales. Por otro lado, los GABA
A
son blanco para
muchos frmacos que ayudan a modular la accin directa de GABA sobre el SNC, tales como
benzodiacepinas o barbitricos.
Los receptores GABA
C
se expresan en gran cantidad en la retina de los vertebrados adultos en
los axones terminales de las neuronas bipolares, sugiriendo un papel importante en los
procesos de sealizacin en esta zona (McCall y col., 2002). Adems, se cree que median
respuestas lentas y sostenidas de inhibicin y son insensibles a bicuculina, compuesto
antagonista competente para los receptores GABA
A
(Kolb H., 1996).
Actualmente, se han clonado tres subunidades distintas de GABA
C
: 1, 2 y 3 (Johnston
G.A., 2002) de retina de mamfero. Algunos estudios farmacolgicos (Kusama y col, 1993)
sugieren que la subunidad 1 es responsable de la resistencia de GABA
C
ante la bicuculina,
mientras que estudios moleculares sugieren que sea probablemente la responsable de la
expresin adecuada del receptor completo en las neuronas bipolares de la retina (McCall y
col., 2002).
Poco es lo que se sabe de la estructura tridimensional de protenas de membrana y
particularmente de neurorreceptores. Esto se debe a la dificultad que se encuentran para
producir a gran escala protenas de membrana. Una estrategia para comenzar a comprender su
estructura es la expresin de mdulos funcionales de las protenas. Por ejemplo, la regin
1
aminoterminal del receptor GABA 1 contiene el sitio de unin al agonista as como otros
sitios importantes de modulacin. Por tanto el objetivo de este trabajo se centr en expresar en
E. coli la regin extracelular del receptor, a la cual corresponde el dominio amino-terminal del
mismo.

EXPERIMENTAL
1. Transformacin bacteriana a partir del plsmido recombinante pET281
1
Se transformaron por shock trmico (Sambrook y col., 2001) 50L de bacterias E. coli 2566
en estado competente con 0.5L del plsmido pET281, sembrando 200L en una placa de
agar-LB con kanamicina [10mg/mL]. Como controles negativos se usaron clulas
competentes transformadas con el plsmido pET28b y clulas competentes sin plsmido;
ambas sembradas en placas LB con kanamicina. Todas las placas se incubaron por 14 horas a
37C.
2. Induccin de la expresin de 1- NH
2
La induccin de la expresin se realiz en medio LB, usando IPTG como promotor siguiendo
el protocolo (Sambrook y col., 2001) y con Magic Media
TM
(Invitrogen) un medio de
expresin que no necesita adicin de promotor ni monitoreo de densidad ptica.
Se inocul un tubo con 4mL de medio LB y kanamicina [10mg/mL] a partir de una colonia de
las clulas transformadas con NH
2-
1
,
repitiendo la operacin para una colonia transformada
con pET28b. Los tubos se incubaron por 12 horas a 37C en agitacin constante.
Posteriormente se resuspendieron 2mL de cada cultivo en un matraz con 98mL de medio LB
y kanamicina [10mg/mL] y se incubaron a 37C en agitacin constante hasta registrar una
DO
600
entre 0.4-0.5. Una vez alcanzado este rango, se aadi IPTG a una concentracin final
de 0.1mM incubando posteriormente por 24 horas a 37C en agitacin constante.
Aparte, se tom una colonia de la transformacin de pET281 para inocular un matraz con
100mL de MagicMedia
TM
, dejando incubar en las condiciones mencionadas.
3. Precipitacin de protenas
Una vez terminadas las 24 horas de incubacin se registr la DO
600
y se tom un duplicado de
muestras de 2mL de cada cultivo, que posteriormente se centrifugaron a 13krpm a 4C por
2min y se congelaron a -20C. Despus de tomar las muestras, el contenido de cada matraz se
centrifug a 9500rpm a 4C durante 20min. Las pastillas celulares obtenidas se
resuspendieron en 10mL de agua destilada y se almacenaron a -80C
4. Extraccin de DNA plasmdico por lisis alcalina y electroforesis en gel de agarosa.
Las pastillas celulares obtenidas de los 2mL tomados como muestras se colocaron en hielo y
se sigui el protocolo para Miniprep por lisis alcalina (Sambrook y col.,2001), resuspendiendo
la pastilla obtenida en 20L de agua miliQ estril. Una vez obtenidas las muestras, se
corrieron 2L de cada una en un gel de agarosa al 0.8% durante 40min a 100V y 85mAmp
usando como marcador de peso molecular DNA/pst.
5. Anlisis de protenas con SDS-PAGE
Se sigui el protocolo (Sambrook y col., 2001) para la elaboracin de un gel Tris-Glicina de
SDS- poliacrilamida al 15% para tincin con azul de Coomassie e identificacin de protenas.
Una vez elaborado el gel, se cargaron 25L de cada muestra procesadas como se indica a
continuacin: El segundo lote de pastillas celulares obtenidas de los 2mL tomados como
muestras de los cultivos fueron resuspendidas respectivamente en buffer de carga (Tris-HCl
pH=6.8 60mM, Glicerol 25%, SDS 2%, 2-mercaptoetanol 14.4mM, azul de bromofenol 0.1%,
agua) de acuerdo a la DO
600
registrada por cada cultivo al trmino de las 24horas de
incubacin. Una vez resuspendidas, se colocaron en bao mara a punto de ebullicin durante

1
Nota: pET281 es el plsmido construido en pET28b que porta el dominio amino-terminal del gen GABA1
bajo la regulacin del promotor transcripcional del fago T7 (Mora Jurez y col., 2007).
2
5min para finalmente cargarse en el gel. Como marcador de peso molecular se emple Protein
Ladder (Invitrogen). El gel se corri durante dos horas a 100V y 40mAmp. Una vez
terminada la electroforesis, se ti con Azul de Coomassie por una hora y despus se desti
con la solucin correspondiente (metanol, agua, cido actico) para observarlo en el
transiluminador.
6. Caracterizacin del plsmido recombinante 1- NH
2
en la cepa XL1-blue

Debido a que en la primera induccin
no se encontr la presencia de
plsmido despus de la induccin
(Resultados, Fig.1) se realiz una
transformacin (siguiendo el protocolo
mencionado en el paso 1) de la cepa
de E.coli XL1-blue, para observar la
estabilidad del plsmido pET281 en
una cepa sin el gen de la RNA
polimerasa T7. Posterior a la
transformacin se levant una colonia
para inocular un tubo de 4mL que se
dej incubar por 12hrs. Despus se
realiz una extraccin de DNA
plasmdico con miniprep por lisis
alcalina (Sambrook y col.,2001) y se
corri un gel de agarosa al 0.8%.
Finalmente, para la identificacin
total del plsmido (caracterizacin)
se realiz una digestin (Sambrook
y col.,2001), usando como enzimas de restriccin NCoI y XhoI, obtenidas a partir del mapa
de restriccin (Fig. 1) La digestin se incub 1hr a 37C y se corri en gel de agarosa al 1.2%
usando como marcador de peso molecular DNA/pst.


RESULTADOS
Despus de 24hrs de induccin, se verific la presencia
del plsmido (Fig.2) en el cultivo, sin embargo no se
obtuvo un resultado favorable ya que no apareci
indicio alguno de DNA plasmdico despus del
miniprep.
Por tanto, se realiz una transformacin en la cepa
XL1-Blue, para observar la estabilidad del plsmido en
una cepa distinta. Despus de realizar el miniprep, se
puede observar que en la Fig.3, aparecen las bandas
que sealan la presencia del plsmido despus de la
transformacin, indicando la estabilidad del plsmido
en esta la cepa.
Para asegurar la identidad del plsmido y descartar
problemas del mismo en futuras transformaciones, se
realiz una digestin usando enzimas de restriccin.
La Fig. 4 muestra los fragmentos esperados para
pET281 despus de ser tratados.
6 ApoI (2)
78 CfrI (2)
78 MscI (1)
105 HpaII (2)
138 Cac8I (2)
163 TatI (2)
164 RsaI (2)
167 MslI (2)
245 XmnI (1)
248 AlwNI (2)
249 AluI (2)
287 BsiYI (2)
291 MwoI (2)
359 HincII (1)
388 Bsu36I (1)
456 BceAI (1)
457 BsiEI (1)
457 CfrI (2)
457 EagI (1)
459 Cac8I (2)
459 Cfr10I (1)
459 NaeI (1)
459 NgoMIV (1)
460 HpaII (2)
474 BglII (1)
474 XhoII (2)
475 DpnI (2)
480 PpuMI (1)
480 SanDI (1)
489 AflIII (1)
489 BspLU11I (1)
489 NspI (1)
500 ApaLI (1)
500 BseSI (1)
553 MwoI (2)
559 BstXI (1)
580 BfmI (1)
596 HpyCH4III (1)
597 AlwNI (2)
636 StyI (1)
645 MslI (2)
645 OliI (1)
671 AluI (2)
702 TatI (2)
703 RsaI (2)
728 MseI (1)
)
742 TspGWI (1)
744 XhoII (2)
745 DpnI (2)
763 BsiYI (2)
763 EcoNI (1)
773 ApoI (2)
773 EcoRI (1
AMINO TER Rho-1.ape from 1 to 779
Fig. 1: Mapa de restriccin del plsmido 1- NH
2
que indica el
sitio donde cortan las distintas enzimas. Las seleccionadas para la
digestin fueron la NCoI y XhoI.
Fig. 2: Gel de agarosa al 0.8% que
muestra el DNA plasmdico obtenido
despus de 24hrs de induccin de
E.coli 2566 transformadas.
3
















Una vez que se obtuvieron los resultados anteriores, se realiz nuevamente la
transformacin de la cepa ER2566 y se verific la presencia del plsmido despus de
24hrs de induccin. (Fig. 4) Una vez que se observaron las bandas esperadas, se
analiz la presencia de la protena de inters con electroforesis en gel de
poliacrilamida (Fig. 5) en condiciones desnaturalizantes (SDS), en la cual se observan
las bandas esperadas (~35KD) para am

Fig. 4: Digestin del plsmido pET281.
Gel de agarosa al 1.2%. En otros carriles
aparecen como controles positivos los
plsmidos ERW y Cwii.
Fig. 3: Gel de agarosa al 0.8% con muestras de
DNA plasmdico obtenido de la transformacin de
E.coli XL1-Blue con el plsmido pET281. El
rectngulo muestra la aparicin de las bandas
esperadas (~1920pb), sealando la presencia del
plsmido despus de la transformacin.
bos medios.



ONCLUSIONES
var en los resultados, el plsmido es altamente inestable en la cepa de
EFERENCIAS BIBLIOGRFICAS










CONCLUSIONES


Fig. 5: Gel de agarosa al 0.8% con muestras de
Fig. 6: SDS-PAGE al 15% que muestra la banda
DNA plasmdico obtenido despus de 24hrs de
induccin. El recuadro marca las bandas
esperadas de aprox. 1920pb para el plsmido
pET281.
que indica la presencia de la protena esperada de
aproximadamente de 35KD.

C
Como se pudo obser
expresin utilizada inicialmente pues no se encontr su presencia en las bacterias inducidas en
un principio. En cambio, en cepas de E. coli que no tienen el gen de la RNA polimerasa T7
(XL1-blue) se observa estabilidad del plsmido. En conclusin, la aparente inestabilidad del
DNA del plsmido pET281 en ER2566 ha impedido su expresin adecuada, siendo
necesario intentar su expresin en cepas de E. coli distintas a la ER2566 para optimizar su
produccin y mantener estabilidad.

R
4
Artculos:
Hanley J., Koulen P., Bedford F., Gordon-Weeks P., y Moss J.S. The proteinMAP-1B links
GABAC receptors to the cytoskeletonat retinal synapses Nature 397 66-69, 1999.
Johnston GA. Medicinal chemistry and molecular pharmacology of GABA
(C)
receptors
Curr Top Med Chem. (8):903-1003, 2002
Kusama T., Spivak C.E., Whitingn T.P., Dawson V.L. y Schaeffer J.C. Pharmacology of
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Pharmacol. 109, 200-206, 1993
McCall M., Lukasiewicz P.D., Gregg R. G., Peachey N.S., Elimination of the 1 Subunit
Abolishes GABA
C
receptor expression and alters visual processing in the mouse retina
The Journal of Neuroscience, 22(10):41634174, 2002.

Libros:
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Edition, Cold
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Otros:
rez, A., Lpez Salas, E.; Martnez Torres, A., Miledi, R. Expresin del dominio Mora Ju
amino terminal del receptor humano GABAc rho1 en E.coli Memorias del Programa Verano
de la Ciencia 2007, disponible en:
http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-2007/










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