k

OFICINA ESPANOLA DE
PATENTES Y MARCAS

19

PATENTE DE INVENCION

k
kFecha de publicacin de la solicitud: 16.01.94
o

22 Fecha de presentacin: 15.06.92

o
43

Fecha de concesin: 22.06.94

o

k
kFecha de publicacin del folleto de patente:
o

45 Fecha de anuncio de la concesin: 01.09.94

o
45

01.09.94

21
51

ESPANA

12

k
ES 2 046 129
kNmero de solicitud: 9201240
u
kInt. Cl. : C07D 307/83

11 N. de publicacin:
o

B1

73 Titular/es: Consejo Superior de

Investigaciones Cient
cas
Serrano , 117
28006 Madrid, ES

72 Inventor/es: Murado, M.A.;

Pastrana, L.;
a
Gonzlez, M . P. y
a
a
Montemayor, M . I.

74 Agente: No consta

54 T
tulo: Un procedimiento para la produccin de cido giberelico, en cultivo sumergido, a partir de
o
a

euentes del procesado industrial del mejilln.

o

57 Resumen:
Un procedimiento para la produccin de cido gibeo
a
relico, en cultivo sumergido, a partir de euentes del
procesado industrial del mejilln.
o
El procedimiento objeto de la presente invencin
o
comprende la acidicacin del euente a pH = 4,5
o
con separacin espontnea de una fase slida y un
o
a
o
l
quido sobrenadante que se concentra por ultraltracin a 100 KD hasta niveles de 70-100 g/L de
o
glucgeno y un cociente carbono/nitrgeno como
o
prendido entre 40 y 64, se hidroliza con un preparado
amiol
tico de Aspergillus oryzae y el hidrolizado se
utiliza para el cultivo sumergido de Giberella fujikuroi (NRRL 2284), consiguindose una reduccin del
e
o
85% en la DQO del euente crudo y una produccin
o
de cido giberlico de 4 kg/m3 de cultivo.
a
e

Aviso:

Se puede realizar la consulta prevista por el art 37.3.8 LP.

Venta de fasc
culos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. C/Panam, 1 28036 Madrid
n
a

2 046 129

DESCRIPCION
Campo de la tcnica
e
Tratamiento de euentes de la industria del
mejilln.
o
Obtencin de acido giberlico.
o

e
Planteamiento del problema
El producto de la mitilicultura en Galicia, que
alcanza un total de 250.000 Tm/ao, los 2/3 del
n
cual se concentran en la R de Arousa, representa
a
alrededor del 45% de la produccin mundial del
o
molusco. Ms del 60% del recurso se somete a
a
diversos tipos de procesado (congelados y conservas) que se inician siempre con un tratamiento
trmico, al vapor o en agua, para la apertura vale
var y precoccin o coccin de la vianda. Dicho
o
o
tratamiento genera, en estimacin moderada, 300
o
L de euente por Tm de mejilln crudo tratado
o
(54 millones de litros al a o), con una DQO men
o
dia 25 g O2 /L y con glucgeno ( 10 g/L) como
componente mayoritario (vase Tabla 1).
e
Estado de la tcnica
e
La depuracin y posible rentabilizacin de
o
o
los euentes del procesado de mejilln (en adeo
lante EPM) constituye un tema que ha venido
preocupando desde hace casi 30 aos. Al marn
gen de ciertos mtodos aplicables al tratamiento
e
de peque os vol menes (obtencin de condimenn
u
o
tos slidos por desecacin, de componentes utiles
o
o

en cosmtica, recuperacin de glucgeno o taue

o
o
rina), de rentabilidad dudosa o con dicultades
de escala, el primer precedente que plante la
o
depuracin masiva lo constituye un trabajo de
o
FRAGA [FRAGA, F. (1963). Posible utilization
of the cooking water mussel. Proc. Gen. Coun.
Medit., 7: 325 - 27], donde se ensayaba (y se
desestimaba por motivos econmicos) la recupeo
racin de la fraccin proteica por precipitacin
o
o
o
con cido sulfrico.
a
u
Ms recientemente, se ha desarrollado un
a
procedimiento [MURADO, M.A., M.P. GONZALEZ, M.I.G. SISO, J. MIRON & L. PASTRANA
(1990). Procedimiento para la depuracin de los
o
euentes del procesado industrial del mejilln,
o
con produccin de prote unicelular y un preo
na
parado amilol
tico. Pat. Esp. N 9002051] que,
basado en la utilizacin de los EPM como meo
dio para el cultivo de microhongos amilol
ticos,
permite reducir su DQO en un 88%, con obtencin simultnea, por litro de euente, de 2 g
o
a
de prote
nas de mejilln, 8 g de prote uniceluo
na
lar microfngica de elevada digestibilidad y 0,6 g
u
de un preparado amilol
tico pulverulento de alta
estabilidad, rico en - amilasa y aplicable a la
sacaricacin de polisacridos.
o
a
Dentro de este ultimo tipo de enfoques, se pro
pone aqu un nuevo procedimiento que pretende

a adir valor econmico a la depuracin de los

n
o
o
EPM, por medio de su aplicacin a la produccin
o
o
de acido giberlico (GA3) por fermentacin. Para

e
o
ello se requieren los siguientes pasos:
1: Concentracin de los EPM por ultralo
tracin con corte a 100 KD, a n de eleo
var los niveles de glucgeno hasta 70 - 100
o
g/L, sin aumentar los de los componentes de
bajo peso molecular (particularmente importante es lograr un bajo nivel de compuestos nitrogenados).
2

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2: Sacaricacin total o parcial de los cono

centrados, para obtener medios con glucosa
como producto mayoritario de hidrlisis.
o
Este paso se resuelve por v enzimtica,
a
a
utilizando una parte del preparado que se
obtiene en el proceso ya descrito (MURADO & al., 1990).
3: Cultivo de Gibberella fujikuroi sobre los medios sacaricados, de acuerdo con diferentes
opciones operatorias.
Este procedimiento puede aplicarse de modo
alternativo o simultneo con el ya descrito, baa
sado en la utilizacin de microhongos amilol
o
ticos. En este ultimo caso, una parte del euente

se destinar al cultivo sumergido de Aspergillus

a
oryzae, con produccin de prote unicelular y
o
na
un preparado amilol
tico, a travs de un proceso
e
rpido (aproximadamente 60 horas). Otra parte
a
del euente se tratar del modo aqu propuesto
a

(gura 1), utilizando una parte del preparado amilol

tico obtenido en el anterior, en un proceso
ms lento, aunque de superior rentabilidad potena
cial.
Breve descripcin de la invencin
o
o
Para la aplicacin del procedimiento objeto de
o
la presente invencin se parte del euente l
o
quido
procedente del tratamiento trmico (al vapor o
e
en agua) que constituye el paso inicial en todo
proceso de elaboracin del mejilln y cuyas prino
o
cipales caracter
sticas son una DQO de 25 (g de
o
o
O2 )/L y una concentracin de glucgeno de 10
g/L.
La acidicacin a pH=4,5 de este euente cono
duce a la separacin espontnea de un precipitado
o
a
esencialmente proteico y un l
quido claro que supone el 95% del volumen inicial. El l
quido claro
se somete a un proceso de ultraltracin - dilisis
o
a
(con corte a 100 KD) que produce: a) un concentrado que retiene en un 20% del volumen de
entrada la totalidad del glucgeno (que alcanza
o
as niveles de 70 - 100 g/L) y 0,4 - 0,9 g/L de

nitrgeno total. b) un permeato, que se desecha,

o
con una DQO de 2,75 g/L (11% de la inicial del
euente).
El concentrado se sacarica enzimticamente
a
con preparados amilol
ticos pulverulentos obtenidos, seg n una tcnica ya descrita por los invenu
e
tores, a partir de cultivos de Aspergillus oryzae
sobre el l
quido claro antes descrito. La sacaricacin se efecta aspticamente, a 50 C y bajo
o
u
e
agitacin. Las condiciones operatorias se estableo
cen mediante una ecuacin emp
o
rica que permite
priorizar a voluntad la econom de tiempo o de
a
preparado enzimtico.
a
El concentrado sacaricado se utiliza como
medio para el cultivo sumergido de Giberella fujikuori (NRRL 2284) en rgimen discontinuo o
e
con alimentacin discontinua. Las caracter
o
sticas
del medio consideradas ptimas para esta opeo
racin son:
o
Grado de hidrlisis
o
Relacin C/N
o
Relacin C/P
o
pH inicial

50%
40 - 64
40
5

La relacin C/N se consigue, sin necesidad

o
de aportes adicionales, a partir de las propias

2 046 129

prote
nas que permanecen solubles en el medio.
La relacin C/P se obtiene mediante la adicin
o
o
de KH2 PO4 .
La fermentacin transcurre a 30 C y sin cono
trol de pH, comenzando la produccin de acido
o

giberlico cuando se inicia un dcit de nitrgeno

e
e
o
en el medio (lo que sucede a los 3 d de incuas
bacin). En rgimen discontinuo, la produccin
o
e
o
mxima es de 2,8 g/L a los 20 d de incubacin.
a
as
o
En rgimen de alimentacin discontinua, de 4,0
e
o
g/L a los 28 d
as. El acido giberlico se extrae

e
por procedimientos convencionales y la DQO del
medio postincubado representa menos del 4% de
la euente inicial.
Descripcin detallada de la invencin
o
o
Claricacin y concentracin del euente
o
o
Al acidicar el euente a pH=4,5, decanta espontneamente un precipitado esencialmente proa
teico, permitiendo la separacin de un l
o
quido
sobrenadante claricado con un volumen equivalente a los 19/20 del inicial, segn se describe
u
en la mencionada patente ES 9002051.
Dicho l
quido claricado (medio M) se concentra a continuacin por ultraltracin - dialo
o
tracin con corte a 100 KD, hasta la obtencin de
o
o
medios nM (siendo el factor de concentracin alo
canzado), con niveles de glucgeno comprendidos
o
entre 70 y 100 g/L (7M y 10M), con bajo contenido en nitrgeno (450 - 900 mg/L), proteico
o
en una proporcin del 70 - 90%. El proceso, por
o
realizarse con alto l
mite de exclusin y sobre un
o
l
quido claricado, discurre con eciencia superior
a la de otros similares (como el que se aplica al
suero lcteo) que requieren l
a
mites de exclusin
o
ms bajos. En su conjunto comprende:
a
a) Una fase de concentracin, que se mantiene
o
hasta alcanzar un volumen de retenido equivalente a 1/5 del inicial. El nivel de
glucgeno alcanza as 40 - 60 g/L, aumeno

tando ligeramente las concentraciones de

los materiales pept
dicos y permaneciendo
constantes las de los nutrientes de bajo peso
molecular.
b) Una fase de dialtracin, en la que el dreo
naje de permeado se compensa por adicin
o
en continuo de agua corriente, con lo que se
mantiene la concentracin del polisacrido
o
a
y descienden a voluntad las de los componentes de bajo peso molecular.
c) Una fase de concentracin nal para alcano
zar el nivel nal deseado de glucgeno. El
o
conjunto de los permeados, que se desecha,
representa un 11% de la DQO inicial del
euente.
La gura 2 presenta el transcurso de un
proceso de ultraltracin t
o pico, llevado a cabo
con un cartucho AMICON DC 10LA. Debe de
se alarse que la utilizacin de dos (o dos series)
n
o
de cartuchos en paralelo, al permitir la limpieza
alternativa de uno de ellos por ujo inverso, mejora notablemente la ecacia del proceso.
En la eventualidad (muy poco probable) de
operar con lotes de medio M anormalmente ricos en prote
nas de peso molecular superior a los
100 KD, y si la mezcla con otros lotes no resuelve
el problema, puede realizarse un tratamiento de

10

15

20

25

30

35

hidrlisis parcial con papa antes de la ultralo

na
tracin.
o
En la gura 3 se representa la cintica del dese
censo en el nivel de proteinas (Lowry) cuando un
medio M suplementado con prote de mejilln
na
o
hasta un nivel de 10 g/L, se trata con 3,3 mg de
papa soluble (actividad ovoalbmina=1:350)
na
u
por gramo de prote
na. Puesto que 10 g/L representa un nivel muy superior al normal en los
medios M y no requirindose la hidrlisis total
e
o
para lograr el permeado de los polipptidos ree
sultantes, es claro que proporciones an menores
u
de papa permiten eliminar el problema. Debe
na
de se alarse por otra parte que, en nuestra expen
riencia con ms de 5.000 L de EPM de diferentes
a
pocas del ao, nunca se encontraron concentrae
n
ciones proteicas que exigieran esta precaucin.
o
Sacaricacin del euente concentrado
o
Se realiza por v enzimtica, utilizando prea
a
parados amilol
ticos pulverulentos obtenidos a
partir de cultivos de Aspergillus oryzae sobre
el euente claricado, por ultraltracin (30KD)
o
y posterior liolizacin de medios postincubao
dos ltrados por papel, segn la patente ES
u
9002051. El proceso discurre en condiciones
aspticas, a una temperatura de 50C y bajo agie
tacin, aadindose el preparado enzimtico dio
n e
a
suelto en un pequeo volumen del medio a tratar
n
y ajustndose el pH inicial (que no var durante
a
a
la reaccin) con HCl o NaOH a un valor de 5,2.
o
Sobre el grado de hidrlisis alcanzado, deo
nido como la relacin entre azcares reductores
o
u
y totales, ejercen un efecto determinante las siguientes variables:
1 (S): Concentracin de glucgeno en la mezcla
o
o
a incubar.
2(GA): Relacin entre glucoamilasa y actividad
o
amilol
tica total en el preparado enzimtico.
a

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65

3 (pH): pH del sistema.

4 (t): Tiempo de hidrlisis.
o
Puesto que la actividad amilol
tica total del
preparado enzimtico utilizado se mantiene esena
cialmente constante (la contribucin de la glucoao
milasa a este valor es muy baja), la variable S
representa ms bien la relacin entre actividad aa
o
milol
tica total y sustrato: AAT/S en UE/mg.
Con respecto a la relacin glucoamilasa : actio
vidad amilol
tica total debe decirse que, si bien en
la realizacin del plan se utilizaron mezclas ad hoc
o
de a - amilasa y glucoamilasa, los preparados de
A. oryzae de la procedencia antes se alada alcann
zan sin dicultad relaciones an ms altas que la
u
a
encontrada como ptima, cayendo a proporciones
o
ms bajas slo cuando los correspondientes cultia
o
vos sufren dcits en el aporte de ox
e
geno durante
el periodo de aumento de la biomasa de la tasa
mxima.
a
La denicin de las condiciones operatorias
o
en relacin con estas cuatro variables (que en la
o
frmula se encierran entre parntesis), y dentro
o
e
del ambito experimental especicado en la Tabla

2, responde a la siguiente ecuacin emp

o
rica, en
la que H es el % de hidrlisis:
o
H = 68,04 + 5,78(GA) - 12,94(S) - 2,25(pH) +
+ 14,30(t) + 2,30(pH)(t) + 2,34(GA)(S)(t) - 2,30(S)(pH)(t)
3

2 046 129

que proporciona, dentro del citado ambito expe

rimental, resultados consistentes cuando se utiliza para la obtencin de medios con grados de
o
hidrlisis comprendidos entre 0,25 y 1,00. En la
o
gura 4 se presentan las cinticas caracter
e
sticas
de dos opciones operatorias, pudiendo apreciarse
que, de las dos representadas:

AAT/S (UE/mg)
GA
pH

Opcin A
o
0,27
7:1000
6,00

Opcin B
o
0,83
21:1000
4,40

en la primera (A) se prioriza la econom de prea

parado enzimtico y en la segunda (B) la del
a
tiempo de hidrlisis. Cuando, como en el presente
o
caso, se desean medios slo parcialmente hidrolio
zados, puede reducirse el tiempo de reaccin, el
o
nivel de enzima o ambas variables a la vez. Al
cabo, en la gura 5 se muestran los productos de
hidrlisis (determinados por HPLC) despus de
o
e
5 horas de incubacin, en un rango ms amplio
o
a
de condiciones operatorias, aprecindose como en
a
ningn caso se obtienen dextrinas de grado de pou
limerizacin superior a la maltotriosa.
o
Para la nalidad aqu descrita, el grado de

hidrlisis adecuado es del 50% (relacin az cares

o
o
u
reductores/azcares totales=0,5). El medio as
u

obtenido, con una relacin C/N=40 - 64, se suo

plementa nalmente con KH2 PO4 hasta una relacin C/P40. Ajustado el pH a 5,0 con HCl
o
o NaOH y esterilizado en autoclave a vapor uyente, queda en disposicin de ser utilizado para
o
el cultivo del microorganismo.
Proceso microbiolgico
o
Consiste en la produccin de acido giberlico
o

e
mediante cultivo del microhongo Gibberella fujikuroi (NRRL 2284) sobre medios obtenidos a
partir de los euentes segn el tratamiento previau
mente descrito de concentracin y sacaricacin.
o
o
Los cultivos pueden realizarse de acuerdo con las
cuatro alternativas operatorias que resultan de
combinar la utilizacin de dos tipos de medios
o
(total o parcialmente sacaricado) con dos modalidades de proceso (discontinuo o de alimentacin
o
discontinua).
Inuencia del grado de sacaricacin del medio
o
Cualquiera que sea su grado de hidrlisis, los
o
medios de cultivo deben de presentar las siguientes caracter
sticas de composicin:
o
Concentracin de carbohidratos=70 - 80 g/L.
o
Relacin C/N=40 - 64.
o
pH=5,0 (ajustado con HCl o NaOH).
Aunque el nivel de fsforo resulta mucho meo
nos cr
tico, se utiliza el suplemento de KH2 PO4
necesario para obtener una relacin C/P40.
o
Teniendo en cuenta que el microorganismo
es capaz de utilizar una parte sustancial de las
prote
nas de los EPM, habitualmente no es necesaria una suplementacin adicional de los meo
dios con una fuente de nitrgeno para alcanzar
o
la relacin C/N adecuada, que puede conseguirse
o
fcilmente controlando el nivel de N durante la
a
fase de dialtracin.
o
Relaciones C/N superiores o inferiores a las
se ales provocan descensos en la produccin de la
n
o
hormona. Niveles superiores de la fuente de carbono determinan el descenso de la productividad
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(relacin cido giberlico/carbohidratos consumio a

e
dos).
Los medios as preparados se esterilizan a va
por uyente y se inoculan con suspensiones de micelio procedentes de cultivos de 24 horas de edad
sobre el mismo medio. La concentracin de dichas
o
suspensiones se ajusta de tal modo que la adicin
o
de un volumen no superior al 2% del total, proporcione al cultivo una concentracin inicial de 5
o
mg (peso seco)/L. La incubacin se lleva a cabo
o
en erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de medio, sin
o
control de pH, a 30 C y con agitacin rotatoria a
200 rpm.
Por otra parte, y an no siendo G. fujikuu
roi un microorganismo fuertemente amilol
tico,
puede desarrollarse normalmente en medios derivados de los EPM hidrolizados slo parcialmente,
o
lo que, desde luego, constituye un modo operatorio claramente favorable desde el punto de vista
de la econom del proceso propuesto.
a
Segn se recoge en la gura 6, el vultivo disu
continuo en medios sacaricados promueve una
tasa constante de produccin de la hormona duo
rante aproximadamente 17 d a partir del inicio
as
del dcit de N (3 d
e
as), alcanzndose niveles de
a
2,8 g/L a los 20 d de cultivo (2,8 Kg de GA3
as
por m3 de cultivo, o 380 g por m3 de euente
crudo procesado).
En la gura 7, donde se comparan los resultados obtenidos en medios con diferentes grados
de hidrlisis y a diferentes tiempos de incubacin,
o
o
asimismo en cultivo discontinuo, puede apreciarse
como la mejor opcin (tanto en trminos de proo
e
duccin como de productividad y al margen de la
o
econom del proceso enzimtico, ya mencionada)
a
a
consiste en la utilizacin de medios con un 50%
o
de hidrlisis.
o
En cualquiera de las opciones, la DQO del medio postincubado, debida a la presencia de metabolitos f ngicos (giberelinas, bicaverinas, cidos
u
a
orgnicos) y al nitrgeno no utilizable por el mia
o
croorganismo, representa menos de un 4% de la
del EPM inicial.
Inuencia de la alimentacin discontinua
o
En esta alternativa se parte del balance proporcionado por los cultivos discontinuos en medios totalmente sacaricados (gura 6) en su fase
previa a la ca del nivel de GA3, balance que
da
muestra como, durante el periodo en que la biomasa se mantiene aproximadamente constante en
su valor mximo (168 a 264 horas), el consumo
a
promedio de carbohidratos es de 139 mg x L1 x
o
hora1 . La compensacin de este consumo por
realimentacin de los cultivos con medios derivao
dos de los EPM, presenta, en principio, el riesgo
de inhibir la s
ntesis de la hormona con el aporte
simultneo de nitrgeno que ello implica, por lo
a
o
que, para determinar la viabilidad de la operacin con alimentacin discontinua, se realiz la
o
o
o
siguiente aproximacin experimental:
o
Cuatro series de cultivos se arrancan simultneamente, por duplicado, en erlenmeyer de
a
1 L, con una carga inicial de 100 mL, utilizando
un medio 7 M (grado de hidrlisis: 50%) con 453
o
mg/L de nitrgeno y 700 m/L de fsforo, con pH
o
o
inicial ajustado a 5,0. Hasta las 288 horas todos
los cultivos se mantienen en las mismas condiciones, compensndose la evaporacin por adicin
a
o
o

2 046 129

de 1,5 mL de agua destilada estril cada 48 hoe

ras. A partir del citado periodo de incubacin, la
o
primera serie cont
nua, en calidad de control, en
rgimen discontinuo convencional. En las otras
e
tres series se inicia un proceso de realimentacin
o
con medios nM totalmente hidrolizados, a intervalos de 48 horas, de acuerdo con el siguiente esquema:
T1 : mL/48 horas de un medio 5M (lo que equivale a 400 y 2,59 mg de glucosa y nitrgeno
o
total respectivamente, por cultivo, cada 48
horas).
T2 : 8 mL/48 horas de un medio 10M (lo que equivale a 800 y 5,18 mg de glucosa y nitrgeno
o
total respectivamente, por cultivo, cada 48
horas).
T3 : 8 mL/48 horas de un medio 15M obtenido
por suplementacin de un 10M con glucosa
o
(lo que equivale a 1200 y 5,18 mg de glucosa y nitrgeno total respectivamente, por
o
cultivo, cada 48 horas).
Por otra parte, de cada cultivo se toman cada
96 horas muestras de 2,5 mL. Una vez centrifugadas, el sobrenadante se utiliza para las determinaciones anal
ticas (az cares totales, nitrgeno
u
o
total, GA3) y el sedimento, lavado y desecado
a peso constante, para la determinacin grao
vimtrica de la biomasa.
e
En las guras 8 y 9 se presentan los resultados obtenidos en esta modalidad operatoria, y
que pueden resumirse como sigue:

10

15

20

25

30

35

1: La produccin de GA3 en rgimen de alio

e
mentacin discontinua supera a la del proo
ceso discontinuo convencional en todos los
casos, incluso a la tasa de alimentacin ms
o
a
baja, que, aun suponiendo un aumento en el
total de carbohidratos consumidos, implica
un progresivo descenso de su concentracin
o
en el medio (la diferencia en la produccin
o
del cultivo discontinuo con respecto al de
la gura 6 se debe unicamente al nivel ms

a
bajo de nitrgeno utilizado en esta ocasin).
o
o
En ningn caso se presentan indicios de inu
hibicin debida al ingreso de nitrgeno.
o
o
2: El aporte de carbohidratos se consume exhaustivamente en todos los casos. La reduccin en la DQO es equivalente a la obo
tenida en rgimen discontinuo. A la tasa de
e
alimentacin ms alta, la biomasa se mano
a
tiene constante en su valor mximo (alcana
zado al iniciarse la fase de realimentacin)
o
por un periodo de 25 d
as.
3: Si el rendimiento en la produccin de GA3
o
se considera en relacin con la biomasa,
o
los valores son muy similares en las cuatro
series hasta los 24 d
as, cayendo a partir
de este momento en los cultivos discontinuos y mantenindose en los realimentados.
e
Anloga situacin se obtiene reriendo el
a
o
rendimiento al consumo de carbohidratos,
si bien aqu la mejora de los cultivos rea
limentados se aprecia ya desde el inicio de
dicho proceso.

40

45

50

55

60

65

Dada la naturaleza residual del medio utilizado, ms inters prctico tiene considerar aqu
a
e
a

las producciones por unidad de volumen de cultivo, criterio que permite apreciar como la produccin mejora al aumentar la tasa de alimeno
tacin. Con respecto el rgimen discontinuo cono
e
vencional, la alimentacin ms alta conduce a
o
a
prolongar por 16 d el periodo de s
as
ntesis de
GA3 a la tasa mxima, lo que equivale a obtener,
a
prolongando un 40% el tiempo de incubacin, una
o
elevacin del 82% en la produccin de la hormona
o
o
y del 35% en la productividad con respecto al consumo de carbohidratos.
Ejemplos
o
o
Ejemplo n 1: Claricacin y concentracin de
los EPM
500 L de euente crudo (pH=7,0), pasados a
travs de malla de nylon de 1 mm para separar
e
impurezas, se acidicaron hasta pH=4,5. Una
vez sedimentado espontneamente (5 horas) el
a
precipitado proteico formado como consecuencia
de la acidicacin, se recuperaron, mediante un
o
sifn, 462 L del l
o
quido claricado sobrenadante,
con un contenido de 9,4 g/L de glucgeno.
o
Dicho sobrenadamente se ultraltr hasta un
o
volumen de retenido de 62 L, dialtrndose a cona
tinuacin por adicin en continuo de 400 L de
o
o
agua corriente. Retirados 20 L del retenido resultante (medio 7M: 70 y 0,7 g/L de glucgeno
o
y nitrgeno total respectivamente), el resto cono
tinu concentrndose por ultraltracin hasta 30
o
a
o
L (medio 10 M: 100 y 0,79 g/L de glucgeno y
o
nitrgeno total respectivamente).
o
o
Ejemplo n 2: Sacaricacin de los EPM concentrados
30 L de medio 10M a pH=4,5 se ajustaron
a pH=5,2 con NaOH y se esterilizaron a vapor uyente 1 hora. Adicionados en condiciones
aspticas 2,98 g de preparado enzimtico de A. ore
a
yzae (que proporcionan una actividad amilol
tica
total de 0,06 UE por mg de glucgeno), la mezcla
o
o
se incub a 50C bajo agitacin suave durante 25
o
horas. el cociente az cares reductores/az cares
u
u
totales as obtenido fue de 0,51.

Para la hidrlisis del medio 7 M, partiendo

o
de 20 L, operando a la misma relacin eno
zima/sustrato y a igualdad del resto de las condiciones, el tiempo de reaccin requerido para
o
la obtencin de un cociente azcares reductoo
u
res/az cares totales=0,53 fue de 4 horas.
u
o
Ejemplo n 3: Proceso microbiolgico discontinuo
1 L de un medio 7 M con un grado de hidrlisis
o
del 50% se suplement con 3 g de KH2 PO4 ,
o
ajustndose a continuacin el pH a 5,0. Disa
o
tribu en 20 erlenmeyer de 250 mL, se esterido
liz en autoclave a vapor uyente durante 1 hora.
o
Como inculo se utiliz, por cada erlenmeyer (50
o
o
mL), 1 mL de una suspensin de micelio de 0,25
o
mg (peso seco)/mL, procedente de un cultivo de
24 horas de edad en el mismo medio.
La incubacin se llev a cabo a 30C, bajo agio
o
tacin constante a 200 rpm, sin control de pH. Too
mada de cada erlenmeyer una muestra de 2,5 mL
despus de un periodo de 25 d la produccin
e
as,
o
media de GA3 result ser de 3,141 g/L ( 0,107
o
[a=0,01]). El resto de los contenidos se trat cono
juntamente en una decantadora centr
fuga para
separar la biomasa, obtenindose 756 mL de mee
dio postincubado, con una DQO(O2 )=4 g/L.
5

2 046 129

El postincubado, acidicado a pH=3 con HCl

5N, se extrajo con volmenes sucesivos de 350,
u
150 y 100 mL de acetato de etilo. Las fases
orgnicas reunidas se evaporaron en rotavapor
a
hasta un volumen de 100 mL, que se trat dos
o
veces con 50 mL de una solucin saturada de bio
carbonato sdico. Las fases acuosas reunidas se
o
acidicaron de nuevo a pH=3 y se reextrajeron
dos veces con 25 mL de acetato de etilo cada
una. Llevado a sequedad el conjunto, se obtuvieron 4,43 g de un polvo pardo, con un contenido
de 2,06 g (46,5%) de GA3.
Ejemplo 4: Proceso con alimentacin discontinua
o
1 L de un medio 7 M de las mismas caracter
sticas que el utilizado en el proceso discontinuo, con el mismo suplemento de fsforo y pH
o
inicial igualmente ajustado a 5,0, se distribuy en
o
10 erlenmeyer de 1 L (100 mL por erlenmeyer),
que se esterilizaron en autoclave 1 hora a vapor
uyente. Cada erlenmeyer se inocul con 2 mL
o
de una suspensin de micelio de 0,25 mg (peso
o
seco)/mL, procedente de un cultivo de 24 horas
de edad en el mismo medio. La incubacin se
o
o
llev a cabo a 30 C, con agitacin a 200 rpm y
o
sin control de pH.
Despus de un periodo de 12 d en estas cone
as
diciones, se inici la fase de alimentacin discono
o
tinua, caracterizada por:
1: la adicin, cada 48 horas, del volumen de
o
medio 10M (grado de hidrlisis=50%) neo
cesario para proporcionar un incremento en
la concentracin de sustrato de 9,6 g/L.
o
2: la extraccin, cada 96 horas y precediendo
o
inmediatamente a la adicin, de una mueso
tra de 4 mL.
Dado que el proceso se realiz manteniendo
o
constantes volumen de muestra e incremento de
sustrato, los vol menes de alimentacin se estau
o
blecieron mediante la siguiente ecuacin:
o
An =

10

15

20

25

30

35

40

45

S: concentracin de sustrato (g/L) en el medio de

o
alimentacin.
o

Despus de un periodo de incubacin de 672

e
o
horas (384 de las cuales correspondieeron a la fase
de realimentacin, que implic 8 adiciones), la
o
o
produccin media de GA3 result ser de 4,036
o
o
g/L ( 0,206[a=0,001]). Reunidos los contenidos
de todos los cultivos y separada la biomasa en
6

VP:
Vr:
C:
NaCl:
P:
Nt:
N Pr:
G:
min:

euente claricado (medio M)

ultraltracin (100 KD)
o
euente concentrado
permeado de ultraltracin
o
sacaricacin
o
concentrado hidrolizado
cultivo discontinuo
cultivo con alimentacin discontinua
o
biomasa
medio postincubado
extraccin del postincubado
o
cido giberlico
a
e

vol men de permeado

u
volmen de retenido
u
caudal (C barrada: caudal medio)
salinidad
fsforo total
o
nitrgeno total
o
nitrgeno total
o
glucgeno.
o
minutos

%Pr:
H:

50

55

e
Vn1 : volumen del cultivo (L) despus de la alimentacin [n - 1] - sima.
o
Mn : volumen (L) de la muestra n - sima (4 mL en
las operaciones de muestreo - alimentacin
o
y cero en las de alimentacin).
o

M:
UF:
nM:
P:
SC:
nMH:
CD:
CAD:
B:
PI:
E:
GA3:

Figura 3: Cintica de proteolisis con papana soe

luble

o
An : volumen (L) de medio de alimentacin en la
adicin n - sima.
o
S: incremento en la concentracin de sustrato
o
(g/L) en el cultivo, como consecuencia de
la alimentacin n - sima.
o

una decantadora centr

fuga, se obtuvo un volumen de medio postincubado de 1447 mL, con una
DQO(O2 )=5 g/L.
Dicho postincubado se trat del mismo modo
o
que el obtenido en el proceso discontinuo, salvo
por los vol menes de acetato de etilo utilizados
u
en la primera serie de extracciones, que fueron de
650, 300 y 200 mL. Despus de la concentracin
e
o
en rotavapor a 100 mL, reacidicacin a pH=3
o
con HCl 5N, reextraccin con 2 x 25 mL de aceo
tato de etilo y evaporacin a sequedad del exo
tracto nal, se obtuvieron 10,70 g de un polvo
pardo, con un contenido de 5,12 g (48%) de GA3.
Leyendas de las guras
Figura 1: Diagrama del sistema que se propone

Figura 2: Cintica de la concentracin de EPM

e
o
por ultraltracin (100 KD). La lnea de puntos
o

indica el inicio de la fase de dialtracin.

o

S(Vn1 - Mn )
S-S

donde

10

60

Figura 4: Cinticas de la hidrlisis de EPM

e
o
concentrados, segn las siguientes opciones opeu
ratorias (vase texto):
e
AAT/S (UE/mg)
GA
pH
%PH

65

% de prote
nas
horas

AR:
Ga:
Ma:
H:

Opcin A
o
0,27
7:1000
6,00

Opcin B
o
0,83
21:1000
4,40

productos de hidrlisis como % del

o
nivel inicial de glucgeno
o
azcares reductores
u
glucosa
maltosa
horas

11

2 046 129
GA3/ATc:

Figura 5: Productos de hidrlisis a las 5 hoo

ras (determinados por HPLC), en las diferentes
condiciones operatorias utilizadas en el plan factorial.
%AR:
%Ga:
%Ma:
G:
AAT/GA:

%PH:

azcares reductores
u
glucosa
maltosa
glucgeno
o
relacin entre actividad amilol
o
tica total y actividad de la
glucoamilasa
productos de hidrlisis (como %
o
del nivel inicial de glucgeno).
o

Figura 6: Desarrollo de un cultivo de Gibberella fujikuroi en un medio 7M totalmente hidrolizado.

B:
Ga:
N:
GA3:
H:

biomasa
glucosa
nitrgeno total
o
acido giberlico

e
horas

Figura 7: Producciones y productividades de

a
cido giberlico, segn diversos criterios, a tres
e
u
tiempos de incubacin (1: 168, 2: 264, 3:
o
336 horas), en medios con diferentes grados de
hidrlisis.
o
t:
GA3:
GA3/ATc:
GA3/B:
%H:

tiempos de incubacin (horas)

o
cido giberlico
a
e
productividad (produccin de
o
GA3/consumo de carbohidratos)
productividad (produccin de
o
GA3/biomasa)
grado de hidrlisis como % de
o
azcares reductores con respecto
u
a los totales

Figura 8 : Desarrollo de Gibberella fujikuroi

y producciones de acido giberlico en cultivos con

e
alimentacin discontinua (smbolos negros) y en
o

proceso discontinuo convencional (smbolos blan

cos).
Tasas de alimentacin:
o
8 mL/48 horas de medio 5M
T1 :
8 mL/48 horas de medio 10M
T2 :
8 mL/48 horas de medio 15M
T3 :
Dc:
cultivo discontinuo control

H:
5

10

15

20

biomasa
az cares totales consumidos
u
a
cido gibrilico
e
productividad (produccin de
o
GA3/biomasa)

productividad (produccin de
o
GA3/consumo de carbohidratos)
horas

Figura 9: Balances de carbohidratos en cultivos con alimentacin discontinua (T1 , T2 , T3 ) y

o
en proceso discontinuo convencional (Dc).
Tasas
T1 :
T2 :
T3 :
Dc:

de alimentacin:
o
8 mL/48 horas de medio 5M
8 mL/48 horas de medio 10M
8 mL/48 horas de medio 15M
cultivo discontinuo control

AT:
D:
C:
H:

azcares totales
u
carbohidratos disponibles
carbohidratos consumidos
horas
TABLAS

25

30

35

40

45

50

55

60

B:
ATc:
GA3:
GA3/B:

12

Tabla 1
Composicin media (g/L) del euente pretratado
o
(medioM), y su rango de variacin
o
Glucgeno
o
10,00
(7,00 - 12,50)
Azcares reductores 0,15
u
(0,10 - 0,80)
Prote
nas
3,50
(2,50 - 4,00)
Taurina
2,50
(2,00 - 3,00)
Nitrgeno total
o
1,60
(1,00 - 2,00)
Fsforo inorgnico 0,09
o
a
(0,08 - 0,11)
NaCl
18,00
(17,00 - 22,00)
DQO (O2 )
25,00
(21,00 - 26,00)
Tabla 2
Dominios experimentales y codicacin de las variao
bles utilizadas en el diseo experimental aplicado a
n
la hidrlisis de euentes concentrados
o
Valores GlucoamiGluco
pH
Tiempo
codi- lasa
geno
(t, en
cados (GA/AAT) (S:mg/mL)a
horas)
- 1 0,007 (E1)
50
4,4
5
+1 0,021 (E3)
150
6,0
25
I.u. 1 0,007
50
0,8
10
Vn Valor natural
Vo Valor natural en el centro del dominio
experimental
dVn Incremento de Vn correspondiente a
un incremento unidad de Vc
a
: Alternativamente, puede considerarse esta variable como la relacin entre actividad amilol
o
tica total
y sustrato en la mezcla de incubacin (AAT/S en
o
UE/mg). De este modo, los valores extremos ser
an
0,83 y 0,27 (+1).

65

13

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REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la depuracin y vao
loracin de los euentes de la elaboracin ino
o
dustrial del mejilln, con produccin de acido
o
o

giberlico, consistente en la claricacin por

e
o
precipitacin de una fraccin proteica que seo
o
para espontneamente al acidicar el euente a
a
pH = 4,5 y utilizacin del l
o
quido sobrenadante
en un tratamiento caracterizado por su ltracin con corte a 100 KD , hidrlisis parcial del
o
o
glucgeno, suplementacin con una sal de acido
o
o

fosfrico y cultivo sumergido de una cepa de Gibeo

rella fujikuroi, preferentemente NRRL 2284, sobre el medio as obtenido, con produccin de acido

giberlico y eliminacin de ms del 80% de la

e
o
a
DQO inicial.
2. Procedimiento para la depuracin y valoo
racin de los euentes de la elaboracin industrial
o
o
del mejilln, con produccin de acido giberlico,
o
o

e
seg n la reivindicacin 1, caracterizado porque
u
o
en la concentracin del sobrenadante mediante ulo
traltracin con corte a 100 KD se obtiene un reo
tenido con niveles de glucgeno comprendidos eno
tre 70 y 100 g/L, y un cociente carbono/nitrgeno
o
comprendido entre 40 y 64.
3. Procedimiento para la depuracin y valoo

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

14

racin de los euentes de la elaboracin industrial

o
o
del mejilln, con produccin de acido giberlico,
o
o

e
seg n las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado
u
porque la hidrlisis del sobrenadante concentrado
o
se realiza con un preparado amilol
tico comercial, preferentemente el obtenido de Aspergillus oryzae, hasta alcanzar un cociente [az cares reducu
tores] / [azucares totales] comprendido entre 0,25
y 1,0 y el hidrolizado se suplementa con una sal
de acido fosfrico, tal como KH2 PO2 PO4 , hasta

o
alcanzar un cociente carbono/fsforo no mayor de
o
280, lo que constituye el medio de cultivo.
4. Procedimiento para la depuracin y valoo
racin de los euentes de la elaboracin industrial
o
o
del mejilln, con produccin de acido giberlico,
o
o

e
seg n las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
u
porque, cuando el cultivo sumergido de Giberella
fujikuroi sobre el medio obtenido segn la reivinu
dicacin 3 se realiza en rgimen semicontinuo (alio
e
mentacin regulada por adicin), a partir de un
o
o
momento comprendido entre el agotamiento del
nitrgeno y antes de que la concentracin de caro
o
bohidratos totales descienda por debajo de 5 g/L,
se a ade cada 48 horas el volumen de medio necen
sario para proporcionar un incremento no menor
de 9,6 g/L de carbohidratos totales.

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15

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16

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17

kES 2 046 129

kN. solicitud: 9201240
kFecha de presentacin de la solicitud: 15.06.92
o
kFecha de prioridad:

11

OFICINA ESPANOLA
DE PATENTES Y MARCAS

21

ESPANA

22
32

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl.5 :

C07D 307/83

DOCUMENTOS RELEVANTES
Categor
a

Documentos citados

US-A-3681196 (HERBERT H. EICHMORN et al.)

Reivindicaciones
afectadas

US-A-2842051 (PERCY WRAGG BRIAN et al.)

Categor de los documentos citados

a
X: de particular relevancia

o
O: referido a divulgacin no escrita

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la

o
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentacin

misma categor
a
e
A: reeja el estado de la tcnica

de la solicitud
e
E: documento anterior, pero publicado despus de la fecha
de presentacin de la solicitud
o

El presente informe ha sido realizado

para todas las reivindicaciones
Fecha de realizacin del informe
o
23.11.93

para las reivindicaciones n :

Examinador
M. Ybarra Fernndez
a

Pgina
a

1/1