Capitulo 06

CAPiTULO
Proteinas: conformaclen tridimensional

Nos enfrentamos ahora con un problema capital en el estudio de las proteinas y fundamental para la loqica molecular de las celulas vivas. Hemos visto que la informacion qenetica se almacena en un c6digo unidimensional en forma de una se ... cuencia especifica de bases en la larga cadena de la rnolecula del acido desoxirribonucleico. Tambien las proteinas estan constituidas par cadenas larqas, en las cuales los aminoacidos se encuentran formando secuencias lineales especificas. Sabe ... mos ademas que en cada tipo deproteina la cadena polipepti .. dica se halla plegada adoptando una conformaci6n tridimen .. sional especifica, la cual es necesaria para su fund6n bio16gica especifica 0 para su actividad. i Como se transforma la in ...

formaci6n lineal, es decir, unidimensional, inherente a la secuencia aminoacida de las cadenas polipeptidicas en la con ... formaci6n tridimensional caracteristica de las moleculas de las proteinas nativas?

La contestaci6n a esta pregunta viene dada por algunos de los progresos mas significativos de la investiqacion bioloqica moderna. Estos descubrimientos, que han sido posibles gracias a la aplicacion de medidas quimico-fisicas a las proteinas puras han dado nueva luz al estudio de la Iuncion y la biologia comparada de las proteinas.

FIGURA 6-1

Configuraci6n de esteteoisomeros. Este

tipo de isomeros no pueden ser intetconvetr tidos sin que se produzca le rupture

de los enlaces covelentes.

Is6meros qeometrlcos (cis-trans)

• • •

Configuraci6n y conform.aci6n

En primer lugar, debernos clarificar dos terminos que se confunden con frecuencia. El vocablo c~nlifluracion, siqnifica la ordenaci6n en el espacio de los grupos sustituyentes en los estereois6meros (fig. 6 .. 1); tales estructuras no pueden inter .. convertirsesin que se produzca la ruptura de uno 0 mas enlaces covalentes. El termino cO!llormacion se refiere a la or ... denacion espacial de los g.rupos sustituyentes que son libres de adoptar muchas posiciones diferentes sin que se produzca ruptura de enlaces, debido a la posibilidad de rotacion alrededor de los enlaces simples de la molecula, Par ejemplo, en el etano, un hidrocarburo, se podria esperar una lihertad del rotaci6n completa alrededor del enlace sencillo C .. C adop .. tandose un mimero infinito de conformaciones de la molecula. Sin embargo, la conformaci6n alternada (fig. 6 ... 2) es mas

Is6meros 6pticos

eOOH

•

H2N--C-H

• • • •

R

COOH

• • •

H--C---NH2

• • • •

R

127

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

estable que todas las demas, por tanto, y predomina, mientras que la forma eclipsada es menos estable.

El esqueleto covalente de una cadena polipeptidica posee, al menos formalmente, enlaces simples. Por tanto se podria esperar que las cadenas polipeptidicas tuvieran un numero infinite de con formaciones posibles y, ademas, que la confermacion de cualquier polipeptido experimentara un cambio constante a causa de los movimientos termicos. Es ahora evidente, sin embargo, que las cadenas polipeptidicas de una proteina poseen solamente una sola conformacion (0 muy pocas), en condiciones normales de temperatura y de pH. Esta confermacion . nativa (pag. 64), que confiere actividad bioloqica es suficientemente estable para que la molecula pueda ser facil~ mente aislada y retenida en su estado nativo. Este hecho implica, por tanto, que los enlaces simples en el esqueleto de Ia proteina nativa, no puedan girar libremente.

Proteinas fibrosas

Consideraremos en primer lugar la conformacion de las pro~ teinas fibrosas. No solamente son muy abundantes, sobre to do en los animales superiores, sino que ademas poseen confermaciones mas simples que las proteinas globulares, ya que sus cadenas polipeptidicas se hallan normalmente ordenadas o arrolladas a 10 largo de una sola dimension, frecuentemente en haces paralelos. La consecuencia de to do ello es que ha resultado mas facil examinar experimentalmente la conformacion de las cadenas polipeptidicas en algunas proteinas fibrosas; en realidad las proteinas Iibrosas proporcionaron las primeras claves importantes sobre las limitaciones de la libertad de rotacion de los enlaces simples en el esqueleto de la cadena polipeptldica de las proteinas.

Se consideraran aqui dos clases principales de proteinas Fibrosas: las queratinas y los ~'lagenos. El estudio de las queratinas ha sido especialmente importante al revelar las conformaciones que prevalecen en las cadenas polipeptidicas de las proteinas nativas; a saber, la helice « y la conformaci6n f3.

Queratinas

Las queratinas son proteinas insolubles de los animales, derivadas de las celulas del ectodermo (piel}. Estan incluidas en ellas los elementos proteicos estructurales de la piel (el cuero es casi queratina pura), asi como los derivados bioloqicos del ectodermo, tales como el pelo, la lana, las escamas, las plumas, y sus canones, las pezufias, las ufias, los cuernos y la seda. Hay dos clases de queratinas. Las a-quemtines, que son relativamente ricas en restos de cistina y contienen, por tanto, muchos puentes transversales disulfuro (paq. 101); contienen, ademas, la mayor parte de los aminoacidos corrientes. Entre las o-queratinas se encuentran las proteinas duras y quebradizas de los cuernos y de las ufias, que poseen un contenido elevado de cistina (hasta un 22 % ), y las queratinas mas blandas y flexibles de la piel, del pelo y de la lana, que contienen alrededor del 10 al 14 % de cistina. Por otra parte, las f3~quet'atinas, no conti en en cisteina 0 cistina, pero son ricas en aminoacidos con cadenas laterales pequefias, sobre todo glicocola, alanina y serina. Las f3~queratinas se encuentran en

128

FIGURA 6-2

Conformaciones del etano. Las diferentes formas conformacionales se inierconvierten riipidamente pot: rotaci6n alrededor del enlace sencillo; no pueden separarse

unes de otres,

Vistas superiores

H

H

H

H

Alternada

H

H

H

Eclipsada

Vistas por un extremo

H

H

Alternada

HH

Eclipsada

FIGURA 6-3

Dimensiones del enlace peptidico a partir de los datos de rayos X. Los seis

atomos de la zona sombreada se hallan

en un plano. Puesto que el enlace C - N central posee cierto cerscter de enlace doble, este plano tiende a set rigido.

Las longitudes de los enlaces vienen dadas en nan6metros. (Reproductdo de T. P. Bennett, Graphic Biochemistry, vol 1, The Mac Millan Company, Nueva

York, 1968).

Capitulo 6 Proteines: coniormecion tridimensional

las fibras hiladas por las arafias y los gusanos de seda, y en las escamas, las garras y los picos de los reptiles y los pajaros. Otra diferencia importante es que las a~queratinas se estiran cuando se calientan; el pelo, por ejemplo, casi duplica su longitud cuando se expone al calor humedo, pero se contrae a s.u longitud normal por enfriamiento. Las p~queratinas no se estiran en estas condiciones.

La microscopia electronica ha revelado que las fibras del pelo y de la lana conti en en haces de macro fibrillas , constituidas cada una de elIas por fibrillas mas delgadas inteqradas, a su vez, por haces paralelos de filamentos proteicos dispuestos a 10 largo de un eje. Este rasgo estructural permite que sean Iacilmente examinados mediante el analisis por difraccion de rayos X.

Analisis por rayos X de las queratinas

EI espaciado de unidades moleculares 0 atomicas, que se repit en regularmente, en los cristales puede determinarse estudiando los anqulos y las intensidades a que los rayos X de una longitud de onda determinada son dispersados 0 difractados por los electrones que rodean a cada atomo, Los atomos que poseen las densidades electronicas mas elevadas, tales como los metales pesados, producen la maxima difraccion de los rayos X, y los atomos de hidroqeno, que poseen la menor densidad electronica, son los que difractan menos los rayos X. El analisis mediante rayos X de los cristales de sales, como el NaCI, es bastantesencillo, puesto que en el solo intervienen dos atomos diferentes y se hallan espaciados regularmente. En principio, los cristales de moleculas orqanicas complejas, incluso las muy grandes, como las de las proteinas, pueden ser analizados tambien por metodos de difraccion de rayos X. pero el analisis matematico de los roentgenogramas es muy complicado a causa del gran numero de atom os de la molecula, que pueden originar miles de manchas de difraccion.

Al comienzo de los afios 1930, William Astbury, en Inqlaterra, llevo a cabo los primeros estudios de rayos X de las proteinas. EI pelo, la lana y ciertas proteinas fibrosas produjeron roentgenogramas bastante semejantes, 10 cual indicaba que todas elIas poseian una periodicidad principal 0 unidad repetida de 0,5 a 0,55 nm a 10 largo de sus ejes largos. Estas observaciones sugirieron que -las cadenas peptidicas en esta familia de proteinas fibrosas se hallan retorcidas 0 plegadas de modo regular, puesto que una cadena peptidica extendida totalmente no podria presentar los espaciados observados. Por otra parte, la [ibroine, la p~queratina de las Iibras de la seda, presenta una difraccion de rayos X claramente compatible con una unidad repetida de 0,7 nm. Es significativo que al estirar la lana y el pelo despues de someterlos a la accion del vapor, adoptaron un difractograma de rayos X semejante al de las p~queratinas, en una periodicidad de 0,65 a 0,70 nm. Astbury lleqo a la conclusion de que las cadenas peptidicas en la ay la p~queratina se hallan retorcidas 0 arrolladas de modo diferente.

La siguiente etapa en el desarrollo de nuestro conocimiento de la estructura de las queratinas procede del trabajo de L. Pauling y R. B. Corey en los Estados Llnidos, quienes registraron los diagramas de difraccion en rayos X de los cristales

129


FIGURA 6-4

R.otaci6n restringida alrededor de los enlaces sencillos de una cadena polipeptidice, Solamente los enlaces sencillos de los titomos de cetbono a, tienen liberted de giro; los enlaces sencillos C - N de los grupos peptidos pleruues son rigidos.

Extremo Nctermlnal

Grupo peptide planar

Extreme C-terminal

de los aminoacidos y de dipeptidos y tripeptidos sencillos, y dedujeron de ellos la estructura precisa del enlace peptidico. Descubrieron que la union C~ N del enlace peptidico es mas corta que la mayor parte de los demas enlaces C~N, y llegaron a la conclusion de que posee algiin caracter de enlace doble 10 eual no le permite girar Iibremente. Luego dedujeron que los cuatro atomos del grupo peptido y los dos atomos de carbono en a, se hallan colocados sobre un mismo plano, de tal modo que el atomo de oxigeno del grupo carbonilo y el atomo de hidrogeno del grupo - NH - estan en posicion trans uno respecto del otro (fig. 6~3). Esta ordenacion planar, que es rigida, es el resultado de la estabilizacion por resonancia del enlace peptidico.

Partiendo de estos hechos, puede describirse el armazon de una cadena polipeptidica como constituido por una serie de pIanos relativamente rigidos y separados por grupos metileno substituidos (-CHR-) (fig. 6A). En el esqueleto de una cadena polipeptidica, una tercera parte de todos los enlaces sencillos formales son enlaces C~N y 110 permiten la rotacion, ya que poseen caracter de enlace doble. El enlace peptidico impone, por tanto, restricciones significativas acerca del mimero de con formaciones que puede adoptar una cadena polipeptidica. 'Mas adelante verernos que existen restricciones ulteriores acerca del numero de conformaciones de una cadena polipeptidica, ya que aunlos enlaces sencillos carbono-carbono del esqueleto carbonado, no siempre pueden girar libremente.

Helice ,IX Y estructura de las e-querarinae

Pauling y Corey utilizaron modelos de gran precision para estudiar todos los medios posibles de retorcer 0 arrollar una cadena polipeptidica a 10 largo de un eje, en vista de las restricciones impuestas por los enlaces peptidicos planares, y con objeto de interpretar las unidades repetidas de 0,50 a 0,55 nm observadas en las a~queratinas. La dis posicion mas sencilla encontrada por ellos, es la estructura helicoidal mostrada en la Figura 6~5. En esta estructura, lIamada helice a, existen aproximadamente 3,6 restos aminoacidos por vuelta. Los grupos R de los aminoacidos se proyectan hacia el exterior de la helice, bastante compacta, formada por el esqueleto.

130

FIGURA 6-5

Helice a. (Parte superior izquierde, a la derecha y abajo a la dereche, son modelos de G. H. Haggis, D. Michie,

A. R. Muir, K. B. Roberts y P. M. B. Walker, Introduction to Molecular Biology, John Wiley & Sons, lnc., Nueva

York, 1964).

Formaci6n de una helice ,a con giro a la derecha. Los pianos de los enlaces peptidicos rigidos son parale/os el eje longitudinal de la helice,

N

Dimensiones medias de la helice a. El paso de rosce y el ascenso pot resto corresponden a las periodicidedes mayores

y menores de 0,54 y 0.15 nm, tespectivemente. [De L. Pauling y R. B. Corey, Proc, Int. Wool Text. Res. Conf .• B: 249 (1955)].

-1"--------Paso de rosca 0,54 nm (3.6 restos)

_f _

0.51 nm

---\

..... ;/ 26°

-- 1

Ascenso 0,15 nm por resto --------r aminoacido

Capitulo 6 Proteinas: conlotmacion tridimensional

Modelo de bolas y uerilles de la helice a, que muestra los enlaces de hidr6geno intracadena. (puntos coloreedos},

Modelo espacial de helice a.

r

lnm

1

131

En tal estructura la unided tepetide, que consiste en una sola helice, se extenderia cerca de 0,54 nm (5,4 A) a 10 largo del eje, en estrecha correspondencia con la periodicidad principal de 0,50 a 0,55 nm observados en el analisis por rayos X de las o-queratinas naturales. La elevacion por cada resto es de unos 0,15 nm, correspondiente a la periodicidad menor de 0,15 nm observada tambien en los diagramas de difraccion. Este tipo de helice a permite la Iormacion de enlaces de hidrogeno intracatenarios entre vueltas consecutivas de la helice, que son paralelos al eje mayor de aquella y que se extienden entre el atorno de hidrogeno unido al nitroqeno eIectronegativo de un enlace peptidico, y el oxigeno carbonilico del tercer aminoacido que Ie sucede (fig. 6~5). Los vectores electricos (pag. 42) de estos enlaces de hidroqeno estan orientados de tal modo que proporcionan casi la maxima fuerza de enlace. Resulta especialmente significativo que la ordenacion a~heli~ coidal permite participar a cada enlace peptidico de la cadena en el establecimiento de enlaces de hidroqeno intracatenarios. Aunque pueden formarse otras clases de arrollamientos helicoidales de las cadenas polipeptidicas, tales como la helice 7r (con 4,4 restos por vuelta}, estas no pueden interpretar el espaciado caracteristico de las unidades repetidas de la Iamilia de las proteinas de la a~queratina, ni serian tan estables como la helice a.

La helice a puede formarse bien con los L~ 0 con los n-aminoacidos: pero no puede formarse una helice a partir de una cadena peptidica que contenga una mezcla de restos L~ y D~. Ademas, si se parte de los r.-aminoacidos naturales pueden construirse arrollamientos helicoidales hacia la derecha 0 hacia la izquierda; sin embargo, la helice dextro es mucho mas estable. En todas las proteinas nativas examinadas hasta la fecha, la helice a de los L~aminoacidos es dextro, Partiendo de estas consideraciones estructurales, Pauling y Corey expusieron la teoria de que las a~queratinas se hallan constituidas por cadenas polipeptidicas en forma de arrollamientos a~heli~ coidales en senti do dextro. En las a~queratinas del pelo y de la lana se arrollan tres 0 siete de estas helices a unas alrededor de las otras. formando cordones de 3 0 de 7 cabos (fig. 6~6), los cuales se mantienen unidos mediante enlaces disulfuro transversales.

Volviendo a un termino definido en el capitulo 3 (pag. 62) la helice a representa la estructura secunderia de las a~que~ ratinas; es decir, la conformacion regular y arrollada de sus cadenas polipeptidicas alrededor y a 10 largo de su eje mayor.

Aminoecidos [ormedores y desestebilizedores de La helice a

La extension con que una determinada cadena pohpeptidica puede existir en forma de una helice a estable es reflejo de su composicion aminoacida y de su secuencia; no todas las cadenas polipeptidicas pueden formar una helice a estable (tabla 6~ 1 ). El estudio de los poLiaminoacidos (pag. 122), polipeptidos en los que todos los restos aminoacidos son identicos, proporciona una informacion de la mayor importancia sobre este punto. Aunque la polialanina, cuyos grupos R son pequefios y sin carga, forma espontaneamente arrollamientos «-helicoidales en disolucion acuosa a pH 7,0, la polilisina no

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FIGURA 6-6

Modelos de supererrollemiento de errollsmientos a-helicoideles de las queretines del pelo y la lana.

TABLA 6-1. Aminoacidos formadores de helice e Inestabilizadores.

Permiten helice a estable Alanina

Leucina

Fenilalanina

Tirosina

Tript6fano

Cisteina

Metionina

Histidtna

Asparagina

Glutamina

Valina

Inestabilizan la helice a Serina

Isoleucina

Treonina

Actdo qlutamico Acido aspartico Lisina

Arginina Glicocola

Rompen la helice a Prolina Hldroxiprollna

FIGURA 6-7

Efecto del pH sobre la trensicion entre las [ormes de errollemiento al ezer y de helice IX de la polilisina y del ecido poliqlutemico. El desplegamiento de la helice IX va acompafiado por un gran cambio de la rotecion 6ptica haeia un valor mas negativo. [Reprodueido de

P. Doty en f. L. Oncley (ed.}, Biophysical Science. pag. 108. John Wiley & Sons, Inc" Nueva York, 1959].

Or----------------------,

Helice IX Actdo poli-t-qlutamtco

"I

-20

Helice IX
-40 r
'"
......
~
'" -60 B
.!:! =
C. . ~
'0 a ...
'"
= e '"
:9 -80 N
'"
U ....
'" <iii
....
0
0:: -100

Polt-r.-llstna _

-120 Arrollamiento

al azar ,)

-140 0~-2~-4~-6~~8~~1~0~1~2~1~4~

pH

Capitulo 6 Proteines. coniormecion tridimensional

forma helice a al mismo pH. sino que existe en forma anarquica e irregular. con un esqueleto hidrocarbonado flexible que experimenta continuos cambios como resultado de la aqitacion termica, Ello es debido a que a pH 7.0. todos los gru~ pos R de la polilisina poseen una carga positiva y se repelen mutuamente de un modo tan fuerte que superan la tendencia a la formacion de enlaces de hidroqeno intracatenarios. Sin embargo. a pH 12. los grupos R de la lisina no son portadores de carqa, y por tanto. no se repelen entre si: a este pH. la polilisina adopta espontaneamente la forma de helice a (figu .... ra 6~7). Analogamente, el acido poliglutamico adopta una estructura al azar a pH 7. ya que sus grupos R se hallan cargados negativamente a dicho valor de pH, pero a pH 2.0. en que sus grupos R han captado un proton. forma una helice a (fig. 6~7).

La presencia de interacciones debidas a las cargas no constituye el unico factor determinante de si la cadena polipeptidica puede formar 0 no helice a: interviene tambien el tamafio o el volumen de las cadenas laterales. La poliisoleucina no consigue formar helice a porque sus voluminosos grupos R. proximos a los atomos C ~a. provocan un impedimento esterico . En la poliprolina, los atom os de nitrogeno a. forman parte de los rigidos anillos que constituyen el grupo R (pag. 75). y no es posible la rotacion ni de los enlaces N~C del anillo • ni de los enlaces peptidicos C~N. Tampoco en la poliprolina se pueden formar enlaces de hidrcqeno intracadena. Siempre que en una cadena polipeptidica aparecen la prolina 0 la hidroxiprolina, la helice a se interrumpe y se origina un pliegue rigido 0 curvatura, La poliglicina puede formar una helice a. pero prefiere otro tipo de conformacion, la conformaci6n /3. en la que las cadenas se hallan relativamente extendidas (paq. 136). Como resultado de estudios con modelos de diferentes poliaminoacidos sinteticos, se han clasificado los diversos aminoacidos por su potencial de Iormacion de arrollamientos «-helicoidales (tabla 6~ 1) .

Propiedades 6pticas de La helice a

Las proteinas nativas son significativamente mas dextrorrotatori as que la suma de las rotaciones individuales aportadas por cada atomo de carbono-o asimetrico, de los restos L~ami~ noacidos. Tal poder rotatorio extra es maximo en la forma de helice a. mientras que las cadenas polipeptidicas arrolladas al azar muestran simplemente una aditividad de poder rotatorio. Por ejemplo, la rotaci6n especifica de una determinada longitud de acido poli-r.-qlutamico a pH 2 (al cual es una helice ,0:). es de unos - 15°. mientras que su rotaci6n especifica a pH 7 (al cual es una forma al azar}, es de unos - 85° (fig. 6~7). Casi todas las proteinas globulares se tornan mas levorrotatorias cuando se desnaturalizan.

La capacidad de hacer rotar el plano de la luz polarizada la muestran no solo los compuestos que contienen uno 0 mas atomos de carbono asimetricos, sino que tambien otras form as de asimetria molecular pueden exhibir actividad optica aunque no posean ninqun atomo de carbono asimetrico. El criterio basico es de si una molecula puede existir en dos formas diferentes no superponibles que son entre si como imaqenes espe~ culares. En una helice a constituida por t-aminoacidos. la

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asimetria total de la molecule es la suma de la asimetria aportada por los atomos de carbono asimetricos mas la contribuida por el enrollamiento a~helicoidal. que es asimetrico, ya que puede existir en forma dextro 0 levo. El poder rotatorio optico, antes y despues de su desnaturalizacion, es decir, su conversion a la forma fortuita 0 anarquica, se ha empleado como medida de la cantidad aproximada de enrollamiento a~helicoidal de un determinado polipeptido.

Conformaciones posibles e imposibles de las cadenas polipeptidicas: Representacion de Ramachandran

Hemos visto (fig. 6~4) que cada tercer enlace del esqueleto de una cadena polipeptidica posee cierto caracter de enlace doble y que es inca paz de girar libremente, Hemos visto tambien que las cadenas later ales de algunos aminoacidos tales como la isoleucina 0 la lisina (a pH 7,0), no son compatibles con la forrnacion de arrollamientos a~helicoidales estables. Estas observaciones han conducido a intentos de predecir mas cuantitativamente la conforrnacion del esqueleto de una cadena polipeptidica dada, partiendo del conocimiento de su secuencia aminoacida. G. N. Ramachandran y sus colaboradores han desarrollado un con junto muy util de relaciones. La Figura 6~8 muestra el esqueleto de un tripeptide con sus dos enlaces peptidicos planares. Los enlaces C~N del esqueleto en

FIGURA 6-8

Modelo de bolas y varillas que muestte los angulos cf> y if; existentes entre dos grupos peptidicos adyacentes. Los grupos peptidicos pleneres estan separados par el Momo de carbona a, que contiene el grupo R del

testo eminoecido de la dereche, En esta represeritecion los pianos de los grupos peptidicos se hallan en el plano de la pagina; este es la forma extendida a abierta del enlace peptidico,

El enqulo 'P es el angulo subtendido cuando el plano de la dereche gira en la diteccion indicada. Ambos pueden girar independieniemente,

y tanto 'P como if; pueden alcanzar valores asci/antes entre -180· a + 180·. Par convencion, a los angulos 'P y if; en la forma extendida dibujada

se les asigna el valor maximo permitido de + 180·, 0 sea, que

'P = if; = + 180·. Cuendo el angulo 'P se acerca a O· y el angulo 'I' es de +180·, los etomos cerbonilicos de oxigeno (subrayados en trezos) ligados a los nitrogen as peptidicos se solapan. Cuando 'P tiene aproximadamente + 120· y 'I' + 180· el enlace es trans iespecto al enlace C-R, y cuando 'P tiene +180· y 'I' +120· el enlace C.-H es trans tespecto al enlace C - O.

....---- ....... ,

"

\

\

\ I I

/ I I

\

\ \ ,

,

"

<, ----_/

.......

134

FIGURA 6-9

Representacion de Ramachandran de los [mgulos </> [rente a los angulos "'.

Las areas incoloras (en blanco) indican los angulos </> y '" de las conformaciones estables posibles, Las areas pardas indican las coniormeciones de menor estabilidad. Todas las demes areas de la represeniecion corresponden a angulos

</> y '" no permisibles, Las zonas blancas o pardas situadas en el interior de las zonas anaranjadas son compatibles con las helices a dextro, y las situadas en el interior de las zonas grises con las

helices a leoo, aR = helice a dextro;

aL = helice a leoo: C = helice del coleqeno, f3A = lamina con plegamiento

f3 antiparalelo; f3p = lamina con plegamiento f3 perslelo. La tepreseniecion corresponde a un resto u-elenil.

Capitulo 6 Proteinas: coniotmeciori tridimensional

+180·

+120·

+60·

_60·

-120·

-180·

-180· -120·

-60·

o· anqulo </>

+60·

+120°

+180·

cada grupo peptidico poseen cierto caracter de doble enlace y no permiten su rotacion. Los demas enlaces del esqueleto, designados por Ca. - N y Ca. - C. permiten te6ricamente el libre giro. ya que se trata de enlaces sencillos verdaderos, pero si el grupo R que se halle unido al atomo de carbono a central. es 10 suficientemente grande. impedira la rotaci6n completa alrededor de los enlaces Ca. - N y Ca. - C. Ademas, si estos enlaces giran uno respecto al otro, se encontraran ciertos angulos en los que los dos atom os de H (0 los atom os de oxigeno) de los enlaces peptidicos se superpondran mutuamente impidiendo la libre rotaci6n. Por tanto. cad a par de enlaces pep~ tidicos sucesivos se halla sometido ados clases de restricciones sobre la libertad de rotacion de los enlaces simples Ca. - C Y Ca. -N.

El anqulo de rotaci6n del enlace Ca. - N se llama anqulo cp (fi) y el del enlace Ca. -C es el anqulo if; (psi) (fig. 6~8). A partir de calculos basados en consideraciones teoricas, 0 en modelos precisos de peptidos, Ramachandran ha confeccionado una representaci6n de los anqulos cp y if; posibles e imposibles, de los enlaces simples adyacentes Ca. - C Y Ca. - N (fig. 6~9). El numero de con formaciones estables y posibles de los enlaces simples Ca. - C Y Ca. - N es bastante limitado; solamente son est ables y permitidas las con formaciones que caen dentro de las areas blancas, relativamente pequefias, de la figura 6~9.

Por ejemplo, la helice a es una conformaci6n posible en la representacion de Ramachandran. ya que todos los pares de enlaces peptidicos sucesivos existentes en una cadena polipeptidica con helice a se hallan dentro del area permitida. Los angulos mas estables para una helice a dextro son. cp = - 570 y if; = _47°. Podemos observar, sin embargo. que si aumenta el anqulo cp siqnlficativamente, sin cambio en el anqulo if;. abandon amos la zona permitida; 0 que si el anqulo if; se incrementa 0 disminuye significamente sin que cambie el anqu- 10 CP. tambien se abandona la zona de estructuras permitidas.

135


Asi es que podemos predecirsi la conformacion es posible para cualquier par de imgulos cp y ",. Todas las conformaciones que aparecen en la naturaleza del esqueleto de las proteinas nativas se hallan dentro de las zonas permitidas por la representacion de Ramachandran (fig. 6~9).

Las ,8-queratinas: la conformacion-S y la lamina pie gada

Hemos visto que el estudio por rayos X de las a~queratinas condujo al conocimiento actual de la helice a; de modo analogo, los analisis de rayos X de las ~~queratinas han revelado elaves importantes para la conformacion f3 de la cadena polipeptidica. Recordemos (pag. 129) que cuando las fibras de la o-queratina se someten a la accion del calor humedo, pueden estirarse a una longitud que duplica la original. Cuando estan estiradas, proporcionan un diagrama de difraccion por ra~ yos X, que se parece al de la fibroina de la seda, que es un ejemplo de ,8~queratina. Pauling y Corey llegaron a la COJ1~ elusion de que la transicion desde la forma a~queratina a la estructura de la f3~queratina cuando el pelo 0 la lana se someten a la accion del vapor, se debe a la ruptura termica de los enlaces de hidroqeno intracatenarios que normalmente estabilizan la helice ,a, con el consiquiente alargamiento de la rigida helice a, cuya cadena polipeptidica adopta una confor ... macion en zig~zag, mas extendida, que es caracteristica de las f3~queratinas en generaL y a la cual designaron como con~ formaci6n /3. Las cadenas polipeptidicas paralelas de la

FIGURA 6-10

Conformaci6n /3 de la cadena polipeptidica,

R.epresentaci6n esquemiltica de tres cadenas paralelas en estructure /3, donde aparace la disposici6n en lamina plegada. Todos los grupos R se proyectan por encima 0 por debajo del plano de la pagina. [R.eproducido de T. P. Bennett, Graphic Biochemistry, vol. 1, The Macmillan Company, Nueva York, 1968].

Modelos de bolas y varillas. Obsetvese

la maxima existencie de enlaces de hidr6geno entre las cedenes, para formar una lamina, con ordenaci6n antiparalela. (Reproducido de H. D. S. Sprinqell,

The Structural Chemistry of Proteins, pag. 64, Academic Press Inc., Nueva York, 1954).

R

R

Vista por encima

136

Vista de perfil

Capitulo 6 Proteinas: con[ormaci6n tridimensional

conformacion f3 estan dispuestas en laminas plegadas, que se hallan unidas transversalmente por enlaces de hidroqeno intercatenarios (fig. 6~1O). Todos los enlaces peptidicos participan en este enlace cruzado. y asi confieren gran estabilidad a la estructura. Los gropos R se hall an par encima 0 por debajo de los planos en zig~zag de la lamina plegada. Este es el tipo de estructura secundaria que se encuentra en la fibroina segregada por el gusano de seda Bombqx moti. En la mayor parte de los tipos de Hbroina, un aminoacido si y otro no es un res to de glicina. de modo que todos los grupos R de un lado de la lamina ple gada. son atomos de hldroqeno. Dado que la alan ina constituye la mayor parte del resto de aminoacidos de la Iibroina, la mayor parte de los grupos R del otro lado de la lamina son grupos metilo. La fibroina y otras p~queratinas son ricas en aminoacidos que poseen gru~ pos R relativamente pequefios, particularmente la glicina y la alanina. Si 10s grupos R son voluminosos 0 poseen carqas, la lamina plegada no puede existir debido a las interacciones entre los grupos~R. A ello esdebido que la forma estirada de las a~queratinas sea inestable y adopte, espontaneamente, la forma a~helicoidal; los grupos R de las a~queratinas son mas voluminosos y poseen carga mayor que los de la fibroina de la seda (vease tabla 5~2. pag. 103).

Existen otras dos diferencias entre las o-queratinaa y las p~queratinas nativas. En las formas a. todas las cadenas polipeptidicas son pereleles, es decir, se desarrollan en la misma direccion Nvtermtnal a Cvterminal. mientras que en Ia Hbroina, las cadenas polipeptidicas adyacentes son entipereleles, es decir, se desarrollan en direcciones opuestas. Asimismo. las o-queratinas contienen much os restos de cistina, dispuestos de tal modo que puedan establecerse enlaces transversales - S - S - entre cadenas polipeptidicas adyacentes. En contraposicion, las f3~queratinas tales como la fibroma no poseen enlaces - S - S - transversales.

Si volvemos a la representacion de Ramachandran (fig. 6~9). observaremos que los anqulos cp y if; de los enlaces peptidicos, tanto de las laminas plegadas paralelas como de las antiparalelas, caen dentro del area de las estructuras posibles.

El colaqeno

Otro tipo principal de proteina fibrosa de los animales superiores es el colageno de los tejidos conectivos; es la mas abundante de todas las proteinas de los vertebrados superiores y constituye alrededor de un tercio, 0 mas. de la proteina total del cuerpo. Cuanto mayor y mas pesado es el animal. tanto mayor es la fraccion de colaqeno que contribuye a las proteinas totales. Se ha dicho muy adecuadamente, que una vaca, por ejemplo, se mantiene en forma de tal. principalmente gracias a las Fibrillas de colaqeno de su pellejo, tendones, huesos y otros tejidos conjuntivos. Las fib rill as de colaqeno se hallan dispuestas de modos diferentes, que dependen de la funcion bioloqica del tipo particular de tejido conjuntivo. En los tendones las Iibras de colaqeno estan dispuestas en haces paralelos que proporcionan estructuras de gran resistencia, pero de poca 0 nula capacidad de estiramiento. En el pellejo de la vaca las Iibrillas de colaqeno forman una red entrecruzada extendida en laminas. El material orqanico de la cornea del

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ojo es colaqeno casi puro. Cualquiera que sea la ordenacion de las fibrillas de colaqeno en el tejido conjuntivo, las fibrillas muestran siempre un estriamiento transversal caracteristico si las observamos con el microscopio electronico (fig. 6~ 11 ), estriamiento en el cual la distancia repetida es de un os 60 a 70 nm, segiin el tipo de colaqeno y de la especie de orqanismo. La ebullicion en agua convierte el colaqeno en gelatina, una mezcla de pohpeptidos.

Aunque los colaqenos de diferentes especies difieren algo en secuencia aminoacida, la mayor parte contiene alrededor del 35 por ciento de glicocola y 11 por ' ciento de alanina; en este aspecto se parecen a las ,B~queratinas. Los colaqenos se diferencian en que contienen alrededor del 12 por ciento de prolina (pag. 74) y 9 por ciento de hidroxiprolina (pag. 78), un aminoacido que se encuentra raramente en proteinas distint as del colaqeno.

Poseen tam bien los colaqenos un diagrama de difraccion de rayos X diferente de los de las a~ y las ,B~queratinas. De la comparacion de los diagramas de difraccion de rayos X del colaqeno y de la poliprolina (paq. 122), se ha deducido que la estructura secundaria del colaqeno es la de una triple helice de cadenas polipeptidicas (fig. 6~ 12). Cada una de las cadenas es una helice de tres restos arrollada hacia la izquierda; las cadenas se mantienen unidas mediante enlaces de hidrogeno. Los frecuentes restos de prolina determinan el tipo distintivo de ordenacion helicoidal de la cadena, mientras que los pequefios grupos R de los restos de glicina, que apa~ recen en cada tercera posicion, permit en que las cadenas se enrosquen entre si. La secuencia aminoacida completa de las cadenas de colaqeno no es todavia conocida, pero las secuencias que aparecen con mas frecuencia son Gly~X~Pro, GlyPro-X y Gly-XvfIyp, en las que X puede ser cualquier aminoacido. Ninguna otra proteina que no sea el colaqeno contiene cadenas triplo-helicoidales semejantes.

El colaqeno esta construido por estructuras subunitarias periodicas, las moleculas de tropocolageno, de triple hebra y que poseen «cabezas» distintivas. Estas subunidades estan dispuestas, cabeza con cola en muchos haces paralelos, pero las cabezas estan alternadas (fig. 6~13), 10 cual permite interpretar el espaciado caracteristico de 60 a 70 nm de la unidad repetida en las fibrillas de colaqeno de las diferentes especies. Las cadenas polipeptidicas del tropocolaqeno, se hallan unidas covalentemente por enlaces transversales mediante restos de deshidrolisinonorleucina (fig. 6~ 13), que se forman por una reaccion enzimatica entre dos restos de lisina de subunidades adyacentes de tropocolaqeno.

La estructura secundaria de las cadenas polipeptidicas de otras proteinas Iibrosas no es todavia conocida. Se estan llevando a cabo estudios sobre la elastina del tejido conjuntivo elastico de los ligamentos, y sobre la esclerotine; proteina estructural del ligero y rigido exoesqueleto de los insectos. La elastina es sumamente interesante, ya que sus cadenas polipeptidicas se hallan unidas covalentemente formando una. lamina bidimensional estirada, que se parece a una red de trampolin. Las cadenas polipeptidicas estan unidas mediante ligaduras covalentes a restos de desmosina y de isodesmosina (pag. 78). Otra proteina estructural de gran interes es la resiline, hallada en las articulaciones de las alas de algunos

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FIGURA 6-11

Microfotografia electronice de las [ibrilles de coleqeno del teiido conectivo. Observese la petiodicided de las estries trsnsverseles, las cuales muestran una distancia repetida de 70 nm.

FIGURA 6-12

Conformaci6n de las cadenas polipeptidicas en la molecule de tropocoleqeno de tres cabos. Cada cadena es un arrollamiento con muchas secuencies repetides de Gly-X-Y.

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II

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Cadena polipeptidica simple de tropocolaqeno

Molecula de tropocolaqeno de tres cabos

(280 X 1.4 nm)

FIGURA 6-13

La elinescion alterna de las molecules de tropocoleqeno, que poseen «cabezas»,

es la responseble de las unidedes repetides cada 70 nm en las [ibres de coleqeno hidreiedes. Abajo aparece la estructura de la deshidrolisinonorleucine que forma un enlace covelente transversal entre las cadenas de coleqeno pereleles.

70 nrn

I

280 nrn

L

Fibrilla de colaqeno

COOH

I

H2N-CH

I

CH2

I

CH2

I

CH2

I CH

II N

I

CH2

I

CH2

I

CH2

I

CH2

I

HC-NH2

I

COOH

Deshidrolisinonorleucina

Capitulo 6 Prateinas: coniotmecion tridimensional

insectos, notable por sus propiedades elasticas, perfecta mente reversibles.

Estructura terciaria de las proteinas globulares

Pasamos ahora de las proteinas Iibrosas, que poseen estructuras relativamente sencillas, a las proteinas globulares, mucho mas complejas, que poseen cadenas polipeptidicas apretadamente plegadas en estructuras tridirnensionales compactas, que rnuestran rnuchas clases de actividades bioloqicas especializadas.

Hasta que se hizo posible eI analisis por rayos X de las proteinas globulares cristalizadas, apenas se sabia nada acerca del modo como se hallan plegadas tridimensionalmente sus cadenas pclipeptidicas. De hecho, por otros metodos Iisicos no se puede deducir mas que un esbozo simplisimo de la forma de las proteinas globulares; por ejemplo, las medidas de viscosidad, de sedimentacion y de difusion, solo permiten calcular la relacion axial de las moleculas de proteina, pero no proporcionan informacion sobre su estructura interna.

La interpretacion de los diagramas de difraccion de rayos X resulta mucho mas dificil para las proteinas globulares que para las fibrosas. debido a que las cadenas polipeptidicas de las proteinas globulares no estan dispuestas a 10 largo de un eje, sino que se hallan plegadas de modo compacto e irreqular y adoptan formas casi esfericas. Sin embargo, la introduccion de atomos de metales pesados de densidad electronica que producen una difraccion intensa en las moleculas de las proteinas globulares para proporcionar puntos de referencia en la interpretacion matematica de los diagramas de difraccion, ha heche posible que se puedan determinar las estructuras tridimensionales de cierto numero de proteinas globulares, hasta una resolucion de 0,6 nm y, en algunos casos hasta de 0,2 nm. Entre las proteinas globulares cuyas estructuras terciarias son ahora bien conocidas, estan la mioglobina, la hemoglobina, la lisozima, la ribonucleasa, la quimotripsina, la carboxipeptidasa A, el citocromo c, la lactato-deshidroqenasa y la subtilisina, enzima proteolitico procedente de una bacteria. Aunque solo se conocen con detalle, las con formaciones de unas pocas proteinas, los resultados obtenidos ya han proporcionado al .. gunas generalizaciones importantes que, probablemente, son aplicables a muchas proteinas globulares.

Mioglobina

La primera informacion importante fue debida a los estudios con rayos X que efectuaron J, c. Kendrew y sus colaboradores en Inglaterra sobre la mioglobina del cachalote. La mioqlobina es una protein a globular relativamente pequefia, que contiene una sola cadena polipeptidica, constituida por 153 restos aminoacidos, Se conoce en la actualidad la secuencia completa de esta cadena. La mioglobina contiene un grupo hemo ferroporfirinico, 0 grupo hemo (pag. 501) identico al de la hemcqlobina y capaz, como ella, de experimentar oxiqenacion y desoxiqenacion reversible. Se halla, en realidad, emparentada funcional y estructuralmente con la hemoglobina, que contiene cuatro cadenas peptidicas y cuatro hernos, y posee un peso molecular cuatro veces superior al de la mioglobina. La mio-

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globina se halla en las celulas del musculo esqueletico, y es especialmente abundante en mamiferos buceadores tales como la ballena, foca y morsa, cuyos rnusculos son tan ricos en mioglobina que presentan una coloracion pardo oscura. La mioglobina no solamente actua almacenando oxigeno, sino que tambien aumenta la velocidad de difusion del oxigeno a traves de la celula.

Los diagramas de difraccion de rayos X de la mioqlobina cristalina, que contiene unos 2500 atomos, estan constituidos por casi 25 000 reflexiones. El analisis mediante rayos X de la estructura de la mioglobina tuvo efecto en dos etapas. En la primera, que se complete en 1957, los resultados se calcularon para una resolucion de 0,6 nm, logro que requirio el analisis preciso de 400 manchas de difraccion (fig. 6~14). Este grado de resolucion es insuficiente para revelar las posiciones exactas de los atom os individuales 0 de los grupos funcionales de la molecula, pero indica de que modo se halla plegada la cadena peptidica en la molecula de mioglobina. En una segunda etapa, el anal isis por rayos X de la mioglobina se realize hasta una resolucion de 0,2 nm. Ello requirio.el analisis de 10000 reflexiones y el empleo de metodos de computacion electronicos de gran velocidad. Este nivel de resolucion fue 10 suficientemente elevado para revelar la secuencia de la mayor parte de los grupos R, la cual concuerda con la secuencia aminoacida establecida por metodos quimicos. El esqueleto de la mioglobina esta constituido por ocho segmentos relativamente rectos, separados por curvaturas (fig. 6~ 14). Cada segmento esta constituido por una porcion de helice a; el mas largo consta de 23 aminoacidos y el mas corto de siete, todos ellos en sentido dextrorsum. Cerca del 70 % de los aminoacidos presentes en la molecula se hallan en estas regiones rectas a~helicoidales, cifra que confirrno los resultados de las medidas de rotacion optica de las disoluciones de mioglobina (pag. 133). Aunque la estructura tridimensional de la mioglobina aparece como irregular y asimetrica, no tiene nada de anarquica. Todas las moleculas de mioglobina poseen la misma conformacion, si no la mioglobina no podria cristalizar y proporcionar diagramas de difraccion por rayos X reproducibles.

Se han descubierto otros rasgos importantes de la estructura de la mioglobina:

1. La molecula es muy compacta, y en su interior solamente hay espacio para cuatro moleculas de aqua.

2. Todos los grupos R polares de los restos aminoacidos se hallan localizados sobre la superficie extern a de la molecula y estan hidratados.

3. Casi todos los grupos no polares 0 hidrofobicos R se encuentran en el interior de la molecula, y estan asi protegidos de la exposicion al agua.

4. Los restos de prolina solo aparecen en las curvaturas, que tambien contienen algunos aminoacidos, de los que se sabe que no forman arrollamientos a~helicoidales facilmente, tales como la isoleucina y la serina.

5. La macroconformacion de la cadena peptidica es sernejante en las mioglobinas aisladas de diferentes especies, a pesar de que difieren algo en la composicion en amino-

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Capitulo. 6 Proteinas: conlormacion tridimensional

FIGURA 6-14

Estructura de la mioglobina.

Diagrama de difraccion de ragos X de la mioglobina (cachalote). Extraido de

«The Three-dimensional Structure of a Protein Molecule», pot J. c. Kendrew. Scientific American, Diciembre 1961.

Estructura de la mioglobina deducida de los datos pot ragos X de alta resolucion (0.2 nm). [Reproducido de

R. E. Dickerson en H. Neureth (ed.), The Proteins. p. 64. Academic Press. Lnc., Nueva York, 1964].

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acidos. AS! los restos que se conservan, 0 invariantes (pagina 114), de la secuencia puedentestar implicados en la determinacion de la posicion de las, curvaturas y direcciones de los segmentos rectos.

Esttuctures de otres proteines globulares

EI analisis por rayos X de la estructura de cierto numero de otras proteinas globulares muestra que cada tipo de proteina tiene un modo diferente de pleqarse, a sea, una estructura terciaria distinta. Todas las proteinas globulares examinadas hasta la fecha, comparten tres denominadores comunes con la mioglobina: (1) un pleqamiento compacta, con poco 0 ningiin: espacio para las molecules de agua; (2) una localizacion exterior de casi todos los grupos R hidrofilos. y (3) una localizacion interna de casi todos los grupos R hidrofobos. Aunque casi el 70 por ciento de la cadena polipeptidica de la mioglobin a se encuentra en forma de segmentos a~helicoidales, esto constituye una Iraccion elevada no Irecuente. La mayor parte de las proteinas globulares examinadas contienen mucha menor proporcion de helice a. Algunas contienen segmentos de conformacion /3, 10 cual no ocurre en la mioglobina.

Esbozaremos los rasgos estructurales distintivos de unas cuantas proteinas globulares. La lisozima es un enzima de la clara de huevo que cataliza la hidrolisis de ciertos enlaces glucosidicos de los polisacaridos complejos presentes en las paredes celulares de algunas bacterias (paq. 274). Posee 129 restos dispuestos en una sola cadena y cuatro enlaces cruzados intracadena de cistina. La lisozima solamente tiene un 25 % de sus restos aminoacidos en forma de reqiones a~heli~ coidales. Por otra parte, la lisozima se parece a la mioglobina en que esta plegada de modo muy compacto, can casi todos sus grupos R polares situ ados en el exterior de la molecula y casi todos los grupos hidrofobos en el interior de aquella. La lisozima muestra una gran hendidura sobre su superficie que ha sido identificada como su centro activo, a la cual se adapta la molecula del sustrato (paq. 238). Esta hendidura esta forrada de arrollamientos ze-hellcoidales. El papel de la estructura tridimensional de la lisozima en su actividad catalitica, se expone en el capitulo 9 (pag. 237).

El citocromo c se ha estudiado tam bien con resultados positivos (fig. 6~ 15). Aunque es una hemoproteina, apenas muestra semejanza estructural con la mioglobina. La molecula de citocromo c, posee unos cuantos segmentos de helice ,a y cierto numero de regiones en las que la cadena polipeptidica.: tiene una conformacion extendida. Los ultimos segmentos se hallan arrollados y empaquetados alrededor del grupo hemo, que casi esta enterrado en una hendidura. Esta estructura proporciona al grupo hemo un entorno hidrofobico, excepto por un borde del hemo que se halla expuesto al medio exterior.

La ribonucleasa posee tambien una grieta superficial larqa, que es el centro activo al cual se adapta la larga molecula del substrato; tiene asimismo relativamente poca proporcion de helice a, pero la cantidad de estructura f3 es considerable. EI analisis por rayos X muestra que la quimotripsina es una molecula aproximadamente esferica, con muchos bucIes pa~ ralelos de la cadena en conforrnacion f3; solamente 18 de sus 241 restos se hallan en segmentos a~helicoidales.

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Capitulo 6 Proteinas: conformaci6n tridimensional

FIGURA 6-15

Conformaci6n del esqueleto de la cadena polipeptidica del ciiocromo c. en la que se muestra el grupo hemo en color.

[De R.. B. Dickerson «The Structure and History of An Ancient Protein» Scientific American. April 1972. -Dibujedo pot

Irving Geis, Copyright 1972 pot Dickerson and Geis J.

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La mayor parte de las proteinas globulares cuya estructura ha sido determinada por eI metodo de r~yo~ X son enzimas. ResuItaria premature formular nuevas gener~lizaciones sobre la estructura terciaria de las proteinas globulares, hasta haber analiza do algunas proteinas repl'esentativas con otras Iunciones bioloqicas, pero podemos preguntarnos ya: lConstituye la estructura tridimensional de una molecula proteica, tal como la revela eI analisis por difracci6n de rayos X de los cristales de la proteina, una imagen segura de la estructura de dicha proteina en disolucion acuosa, en cuyas condiciones es como realiza sus funciones bioloqicas?

En un intento efectuado para contestar a la pregunta,

F. M. Richards y sus colaboradores, descubrieron que cuando las moleculas aisladas de los cristales de ribonudeasa se encuentran imposibilitadas de pasar a la disolucion debido a la existencia de enlaces covalentes transversales en la red cristalina, todavia conservaban actividad catalitica. Ello constituye un indicio de que Ia cristalizacion no provoca una distorsion significativa de la molecula que Ie haya hecho adoptar una conformacion inactiva. Analogamente se ha estudiado que la quimotripsina y la carboxipeptidasa son cataliticamente activas en estado cristalino. A partir de este y otros enfoques del problema, parece probable que las proteinas globulares posean la misma conformacion general, tanto en disolucion como en estado cristalino, pero otra evidencia experimental [vease pagina 154) muestra claramente que a1gunas proteinas, particularmente los enzimas, exhiben una cierta flexibilidad en su Iuncion normal en disolucion acuosa. Asi, las moleculas proteicas en disolucion no son enteramente rigidas, sino que pueden «respirar» algo.

Especificaci6n de la estructura terciaria

de las proteinas globulares por su secuencia aminoaclda

Las protein as globulares nativas experimentan una desnaturalizacion para producir con formaciones desplegadas y al azar de sus cadenas polipeptidicas cuando se someten a calefaccion, al tratamiento con acidos 0 con bases, 0 cuando se exponen a la accion de disoluciones concentradas de urea 0 de doruro de guanidinio (pag. 153). Aunque este cambio va acompafiado de una perdida de su actividad bioloqica, alqunas proteinas desnaturalizadas recuperan espontaneamente su actividad bioloqica y por tanto su conformacion nativa original, a veces muy rapidamente. Los experimentos clasicos realizados por F. White y C. B. Anfinsen y sus colaboradores sobre la ribonucleasa rnostraron, en primer lugar, la importancia de 1a secuencia aminoacida en 1a determinacion de 1a conformacion nativa. E1 tratamiento de la ribonucleasa nativa con urea 8 M en presencia de ,8~mercaptoetanol, un agente reductor (pag. 89), provocaba el desplegamiento completo de 1a molecula de ribonucleasa y producia una forma al azar (figura 6~ 16 ). En este proceso los cuatro puentes disulfuro intracatenarios aportados por los restos de cistina de la ribonucleasa, se rompieron por la accion del ,8~mercaptoetanol, convirtiendose en ocho restos de cisteina. La combinacion de desplegamiento y tuptura de los enlaces transversales, provoce 1a perdida completa de la actividad enzimatica, pero a medida que la urea y e1 ,8~mercaptoetano1 eran Ientamente

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FIGURA 6-16

Renaturalizaci6n de ribonucleese reducide y desplegada, con resteblecimienio correcto de los puentes disuljurc transversales.

Estado 26 nativo

! Adici6n de

urea + B-mercaptoetanol

72 Estado desplegado; puentes disulfuro transversales reducidos

OJ I Eltminacton de urea t Y B-mercaptoetanol

Estado nativo

26 con disulfuros correctamente reformados

Capitulo 6 Ptoteines: conformaci6n tridimensional

eliminados de la disolucion de ribonucleasa por dialisis (pagina 162), retornaba poco a poco la actividad enzimatica de la ribonucleasa, indicando que aun despues de un despleqamiento completo, la cadena polipeptidica de la ribonucleasa contiene todavia la informacion necesaria para replegarse espontaneamente a su estructura terciaria, cataliticamente activa. En este proceso se oxidan de nuevo los ocho restos de cisteina por el oxigeno atmosferico y se restablecen los cuatro puentes disulfuro transversales. Lo que es particularmente significativo es que estos cuatro puentes disulfuro transversales son los «correctos», interviniendo los mismos pares de restos de cisteina que en la molecula nativa. Los calculos de probabilidad muestran que sobre una base estadistica, ocho restos de cisteina en una cadena polipeptidica unica pueden formar 105 conjuntos de cuatro pares disulfuro diferentes. No obstante solamente se forma el unico conjunto presente en la molecula de ribonucleasa nativa, indicando que la secuencia aminoacida de la ribonucleasa determina, con seguridad y con precision, la ordenacion en el espacio de la cadena polipeptidica en la molecula nativa, asl como la posicion exacta de losgrupos - SH adecuados para formar los enlaces disulfuro cruzados correctos.

Algunas proteinas que carecen de enlaces disulfuro cruzados, pueden replegarse espontanearnente a la confiquracion act iva y nativa, y 10 hacen rapidamente despues de su desnaturalizacion. Anfinsen y sus colaboradores han demostrado que una nucleasa de celulas de Staphylococcus pierde toda su actividad biologica y su conformacion nativa si se la acidifica a pH 3,0; cuando se restablece el pH a 7, su actividad se recupera rapidamente. A partir de estos y de otros muchos experimentos semejantes de renaturalizacion de otras proteinas globulares, podemos hoy dia dar por demostrado que la secuencia aminoacida es la que especifica la estructura terciaria distintiva de las proteinas globulares, la cual no es sino el reflejo de las diferentes clases de restricciones que experimenta la libertad de rota cion alrededor de los enlaces simples de la cadena polipeptldica. En resumen, estas restricciones comprenden la naturaleza planar rigida de los enlaces peptidicos, los anqulos cf> y '" que son permisibles en los enlaces Co; - C y Co; - N de los restos sucesivos, el numero y localizacion de los restos hidrofobos e hidrofilos en la secuencia, y el numero y localizacion de los grupos R cargados positiva y negativamente. La conformacion de la cadena polipeptidica es resultado, por tanto, del ajuste de cada enlace simple del esqueleto a las divers as restricciones locales y de gran alcance que proporcionan una conformacion terciaria caracteristica con una actividad bioloqica especifica.

Estebilizecion de fa esttucture tercierie de las proteines globulares

Una vez formada la estructura terciaria de una proteina glo~ bular, son cuatro los tipos principales de interacciones 0 de enlaces debiles, que cooperan a su estabilizacion: (1) los enlaces de hidroqeno entre grupos peptidicos, como ocurre en la helice a 0 en el plegamiento [3; (2) los puentes de hidroqeno entre grupos; (3) las interacciones hidrofobicas (pag. 45) entre grupos no polares, y (4) los enlaces ionicos entre grupos

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cargados positiva y negativamente, tales como el - COO-, el grupo R del aspartato y del glutamato, y el - NH+3, grupo R de la lisina. Gracias a los estudios realizados sobre la contribuci6n relativa de cada uno de estos cuatro tipos de enlaces debiles a la estabilidad de las moleculas de'la proteina nativa, en la actualidad se percibe claramente que las acciones hidroIobicas entre los grupos R no polares son sin duda las mas importantes. La mayor parte de las proteinas conti en en entre un 30 y un 50 % de aminoacidos con grupos R no polares (pagina 74); el analisis por rayos X muestra que casi todos estos grupos R se hallan en el interior de las proteinas globulares nativas (pag. 140), protegidos de su exposici6n al agua.

Para una comprensi6n completa del importante papel de las interacciones hidrof6bicas en la estabilizacion de la estructura de la proteina, debemos plantear primero la pregunta fundamental: L Cual es la causa de que una cadena polipeptidica arrollada al azar y desnaturalizada, tienda espontaneamente a pleqarse adoptando una conformaci6n de orden superior, biol6gicamente activa, en un proceso en el que, aparentemente, disminuye la entropia de la cadena polipeptidica? i Constituye el plegamiento de una proteina una violaci6n de la segunda ley de la terrnodinamica (pag. 400), que establece que todos los procesos se realizan en la direcci6n en que aumenta la entropia 0 el desorden? La contestaci6n a este dilema reside en un equilibrio de fuerzas. Una fuerza es la tendencia de la cadena polipeptidica a adoptar su propia conformaci6n en la que alcance el mayor grado de libertad 0 entropia. La fuerza opuesta es la tendencia de las moleculas de agua del entorno a buscar tambien su grade maximo de libertad 0 entropia. El factor critico en este equilibrio de fuerzas esta representado por los grupos R no polares. Cuando los grupos no polares se insert an en el seno del agua, se crea una nueva interfase, la cual exige que las moleculas de agua adyacentes adopten una disposici6n mas ordenada que la que tendrian en el agua llquida pura; por tanto se precisa una aportacion de energia para forzar a los grupos no polares R a permanecer en el seno del agua. Una cadena polipeptidica anarquica, con sus grupos R no polares expuestos, tendera, por tanto, a adoptar una conformaci6n en la que dichos grupos se hallen ocultos a la exposici6n al agua. Es la tendencia de las moleculas de agua del entorno a relajarse a su maximo estado entr6pico, la que provoca la transici6n de la cadena polipeptidica desde un estado de desplegamiento al azar hasta una conformaci6n terciaria de elevado grado de ordenaci6n. En el equilibrio, cuando la cadena anarquica se hall a completamente plegada, el incremento de entropia de las moleculas de agua del entorno es mayor que el decremento en la entropia de la cadena polipeptidica, que se halla ahora correctamentc arrollada. No se ha violado la segunda ley porque la combinaci6n del sistema (el polipeptido ] y su entorno (el agua) ha experimentado un incremento neto de entropia.

No obstante, la evidencia indica que la conforrilaci6n nativa plegada, si bien es mas estable que la conformaci6n desplegada 0 desnaturalizada, 10 es solamente por un margen relativamente pequefio. La estabilidad de una proteina nativa glo~ bular es,. por tanto, el resultado de un delicado equilibrio entre dos Iuerzas relativamente masivas y opuestas: 1) la tendencia de la cadena polipeptidica a desplegarse hacia una ordena-

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FIGURA 6-17

Energia libre reletioe de las cadenas polipeptidicas natives y desplegadas (desnaturalizadas). (Arriba) Una proteine cuya coniormecion native posee un contenido enerqetico menor que la forma desplegada; el polipeptido desplegado

se repliega muy repide y esponteneemente si la berrere de enerqie de ectivecion

es pequeiie. (Abajo) Una proteina cuya forma desnaturalizada posee un conienido enerqetico menor que la forma netive.

En este caso la forma netive es estable en condiciones bioloqices debido a que existe una gran berrere de enerqie de ectivecion para el desplegamiento que solamente puede superetse mediante el calor u otros agentes.

t

Barrera de energia de activaci6n baja

Capitulo 6 Proteines: coniotmecicti tridimensional

cion mas fortuita y 2) la tendencia de las moleculas de agua del entorno a buscar su maximo estado de desorden.

Hemos dado por sentado en esta discusi6n, que la conformaci6n nativa de una proteina globular es mas estable, es decir, posee menos energia libre que la forma de arrollamiento al azar, en condiciones biol6gicas pero esta suposici6n puede no ser cierta para todas las proteinas, y ello constituye objeto de mucha discusi6n y estudio. Las proteinas que se repliegan espontaneamente a su forma nativa pueden realmente ser mas estables que sus formas desnaturalizadas en condiciones especificas de pH, de fuerza i6nica y de temperatura (figu~ ra 6~ 17). Por otra parte, la forma desplegada de algunas proteinas puede tener menos enerqia libre que la forma nativa. En tales casos la transici6n des de la forma nativa hasta el estado anarquico puede presentar una barrera de energia de activaci6n muy elevada, confinando asi a la cadena polipeptidica en su conformaci6n nativa. En este caso, una vez que la forma nativa se haya desplegado, la cadena polipeptidica ya no se repleqara espontaneamente a su conformaci6n nativa.

Todas estas consideraciones son de la mayor significaci6n biol6gica. Cuando se sintetizan las proteinas por las celulas a partir de sus aminoacidos constituyentes, crecen resto a resto partiendo del extremo N -terminal (pag. 944). Sin embargo, sabemos muy poco sobre el mecanismo y caracteristicas del proceso por el que las cadenas polipeptidicas en formaci6n experimentan el plegamiento que les conduce a adoptar sus con formaciones especificas dotadas de actividad biol6gica.

Cinetice del plegamiento de las proteines

Un aspecto particularmente critico del plegamiento de las cadenas polipeptidicas a su conformaci6n nativa, es la elevadisima velocidad a la que este debe producirse biol6gicamente. Si suponemos que una molecula proteica posee n restos aminoacidos, que cada resto posee dos enlaces capaces de permitir la rotaci6n y que existen tres con formaciones posibles [angulo cf> 0 1ft), el numero maximo de con formaciones posibles para cada enlace que permite el giro en la cadena es 32n, que es, aproximadamente, igual a IOn. Ya que cada enlace sencillo puede girar completamente en unos 10-13 s, el tiempo total necesario para que gire cede enlace sen cillo formal una vez en la cadena, es de 2 X 10-13 s. Por todo ello, el tiempo que precisa una cadena polipeptidica para probar todas las con formaciones posibles, puede suponerse que es t = IOn (2n X 1013). Para una cadena polipeptidica de seis restos t el tiempo esta en el orden de los microsegundos, una de 11 restos, precisa de 0,2 s, pero una cadena de 100 restos aminoacidos precisaria de 2. X 1()B9 S, 0 mas, es decir, un intervalo de. tiempo mayor que la edad de la Tierra. Sin embargo, la nucleasa estafilococica, que posee 149 restos, precisa como maximo de 0,1 a 0,2 s para recuperar su conformaci6n nativa, activa enzimaticamente, despues de su completa desnaturalizaci6n por un tratamiento acido, En realidad, constituye una necesidad biol6gica que las moleculas de proteina se plieguen y adopten sus con formaciones nativas muy rapidamente y siguiendo alguna clase de ruta preferente, ya que la biosintesis de las proteinas en las celulas es muy rapida, y se produce

147


a una velocidad superior a la de un res to aminoacido por segundo.

L Como resulta posible entonces, que una, cadena polipeptidica larga se pliegue tan rapidamente y adopte su conformacion nativa, sin tantear todes sus con formaciones posibles? Aunque la contestacion com pl eta no se conoce aun, parece probable que este proceso se vea favorecido por el principio de la cooperatividad (pag. 44). 0 sea, que una vez que se han formado correctamente algunos enlaces debiles (enlaces de hidroqeno 0 interacciones hidrofobicas ) en una parte de la cadena polipeptidica, aumenta en gran manera la probabilidad de que se form en posteriormente enlaces correctos, sin que sea necesario que la cadena tan tee todas las con formaciones posibles (pag. 44). Es como si el polipeptido con arrollamiento anarquico experimentara un proceso de nucleacion semejante al que tiene lugar en una disolucion salina sobresaturada, let cual cristaliza instataneamente cuando se nuclea 0 siembra con un cristal minuscule, que actua como nucleo de la cristalizacion. Lo que no se sabe es si el proceso de plegamiento se inicia en uno de los extremos de la cadena 0 en medio de ella. El desplegamiento termico de las proteinas muestra curvas de «fusion» mas bien agudas (fig. 6~18), 10 que sugiere que la cadena polipeptidica existe solamente en dos estados, o bien completamente ple gada 0 completamente desplegada. Sin embargo, recientes estudios sobre el desplegamiento de las proteinas en intervalos de tiempo extremadamente cortes, indican que ciertas proteinas pueden adoptar estados de conformacion intermedios. Quizas estos puedan revelar como se inicia el plegamiento y el desplegamiento de las cadenas polipeptidicas, y como se propaga en condiciones bioloqicas.

Estructura cuaternaria

de las proteinas oliqomericas

Hemos visto que algunas proteinas globulares son oligomericas, es decir, que contienen dos 0 mas cadenas separadas 0 subunidades polipeptidicas (tabla 3~2, paq. 61). La estructura cuaternaria (paq. 62) designa el modo caracteristico mediante el cual cada una de las cadenas polipeptidicas plegadas, se acoplan entre si en la conformacion nativa de una proteina oliqornerica. Entre' las proteinas oliqomericas mas sencillas se halla la hemoqlobina, que posee 4 cadenas polipeptidicas (pag. 112).

Debido a que las proteinas oliqomericas poseen pesos moleculares relativamente elevados, y a que contienen multiples cadenas, cada una de las cuales puede tener una conformacion caracteristica, su conformacion tridimensional es mucho mas dificil de analizar mediante metodos de rayos X que la de las proteinas de una sola cadena.

H emoglobina

La hemoglobina es la primera proteina oliqomerica cuyas estructuras terciaria y cuaternaria fueron conocidas gracias al analisis por rayos X. Este logro, conseguido por M. F. Perutz y sus colaboradores en Inglaterra, fue la culminacion de 25, afios de estudio detallado sobre esta importante proteina. Debido a la semejanza de Iuncion y a la homologia de secuencia

148

FIGURA 6-18

Curva de «fusion» termice de una proteina. La etapa de trensicion a la forma despleqeda, que tiene lugar en un lntervalo mug limifado de temperetures, indica que el desplegamiento 0 desneturelizecion es un proceso cooperativo en el que la ruptura de los primeros enlaces debiles incrementa en gran

medida le probabilidad de la ruptura de los restantes.

Forma desplegada

60 80

Temperatura °C

FIGURA 6-19

Coniormecion tercierie de las cadenas

a y f3 de la hemoglobina. [De A. F. Cullis, H. Muirhead, A. C. T. North, M.

F. Perutz y M. G. Rossman, Proc. R. Soc. Land .• A 265: 161 (1962) J.

Cadenas a

Cadenas f3

FIGURA 6-20

Estructure cueternerie de la hemoglobina. (Adaptada con la eutorizecion de R. E. Dickerson y I. Geis, The Structure

and Action of Proteins. publicada pot:

W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Califomia, Copyright, 1969. por Dickerson and Geis. Las coordenedes son cortesie

de M. Perutz, Cambridge, Inglaterra).

Cadena f3

Capitulo 6 Proteinas: coniormecion tridimensional

aminoacida de las cadenas polipeptidicas de la mioglobina y la hemoglobina (pag. 113). se ha desarrollado una cantidad de relaciones extraordinaria a partir de investigaciones coincidentes sobre la estructura de ambas proteinas, realizadas en el mismo laboratorio.

La hemoglobina contiene 2 cadenas a (141 restos) y 2 cadenas f3 (146 restos}, a cada una de las cuales se halla unido un res to hemo mediante enlace no-covalente. La molecula se estudio en su forma oxigenada, la cual posee una estructura esferoidal compacta, cuyas dimensiones son 6,4 X 5,5 X 5,0 nm. La Figura 6~19 muestra el esbozo a baja resolucion de las cadenas de hemoglobina, y la Figura 6~20 muestra como se acoplan las cadenas en una ordenacion apro~ ximadamente tetraedrica. Cada cadena posee una conformacion irreqularmente plegada, en la que ciertos tramos de regiones helicoidales a puras se encuentran separadas por curvaturas. Las cadenas ,a y 13 poseen alrededor de un 70 % de caracter helicoidal. como tambien ocurre con la mioglobina. Las cadenas a y 13 son muy semejantes entre si en su estructura terciaria, la cual esta constituida por longitudes semejantes de helice a con curvaturas aproximadamente de los mismos anqulos y direcciones. Pero 10 mas notable es que la estructura terciaria de las cadenas a y f3 es muy semejante a la de la estructura de la cadena (mica de la mioglobina, en consonancia con la semejante Iuncion bio16gica de ambas proteinas, es decir, su capacidad para unir al oxigeno de modo reversible la mioglobina en el musculo y la hemoglobina en la sangre.

En la hemoglobina hay muy poco contacto entre las 2 cadenas a y entre las 2 cadenas 13. pero son numerosos los contactos de grupos R entre los pares pertenecientes a cadenas diferentes. Resulta de especial interes la localizacion de los '4 grupos hemo, uno en cad a subunidad, que unen las 4 moleculas de oxigeno. Estos grupos hemo son moleculas planas en las cuales los atom os de hierro forman complejos de coordinacion planares cuadrados y se hallan muy separados unos de otros y situados a diferentes anqulos relativos (figu~ ra 6~20). Cada uno de ellos se halla parcialmente envuelto en una bolsa forrada por grupos R no polares. El quinto enlace coordinado de cada atomo de hierro se establece con un nitroqeno imidazolico de un resto de histidina: la sexta posicion queda disponible para su coordinaci6n con una molecula de oxigeno. Existe una cavidad central dentro de la molecula de hemoqlobina, forrada con grupos R polares.

Se han comparado las secuencias aminoacidas de las cadenas de hemoglobina de much as especies. Aunque unicarnente 9 de los restos aminoacidos de cad a cadena se mantienen absolutamente invariantes. las sustituciones de aminoacidos en otra muchas posiciones indican que la cadena polipeptidica de las subunidades de las hemoglobinas de casi todas las especies poseen la misma estructura terciaria. Ademas, en casi todas las hemoglobinas hay un grupo R de histidina que se coordina con el atomo de hierro del grupo hemo (paq. 501).

La conformaci6n cuaternaria de otras proteinas oliqomericas ya ha quedado definida, particularmente la del enzima lactato-deshidroqenasa que tam bien posee 4 cadenas polipeptidicas. Su estructura y la de la aspartato-transcarbamilasa, que posee 12 cadenas, se estudiaran mas adelante (pag. 495 y 245).

149


Oxigenaai6n y desoxigenaci6n de la hemoglobina

El analisis mediante rayos X de la desoxihemoglobina muestra que la estructura terciaria de las 4 cadenas de las subunidades es identica a la de la oxihemoglobina, pero existe una variaci6n significativa en su estructura cuaternaria, es decir en el modo como se hallan orientadas las cadenas unas respecto a otras. Mediante desoxiqenacion, las cadenas a experimentan una rotacion de aproximadamente 9°, y las cadenas fJ de cerca de 7°, pero alrededor de distintos ejes, provocando un cambio en los puntos de contacto entre las cuatro subunidades y la formacion de nuevos enlaces ionicos entre ellas. Los dos hemos a se aproximan unos 0,01 nm, y los dos hemos f3 se separan aproximadamente 0,65 nm. Asi, la uni6n de las cuatro moleculas de oxigeno, cada una de ell as con un diametro relativamente pequefio, puede provocar un cambio profundo en la estructura cuaternaria de la hemoqlobina, cuya siqnificacion consideraremos seguidamente.

Equilibrios de union de fa hemoglobina

Se atribuye una considerable importancia a la manera caracteristica sequn la cual la molecula de hemoglobina se une al oxigeno en su funcion de transportador del mismo en los eritrocitos desde la fase gaseosa, rica en oxigeno, de los pulmones, a los tejidos perifericos, pobres en oxigeno.

La hemoglobina constituye, aproximadamente, el 90 % de la protein a global de los eritrocitos y se halla concentrada en el citoplasma. Debido a la capacidad de la hemoglobina de unir oxigeno, la sangre puede en conjunto, absorber 21 ml de oxigeno gaseoso por 100 ml, mientras que el plasma sanguineo solo puede absorber alrededor de 0,3 ml de oxigeno por disolucion fisica. La representacion grafica del porcentaje de saturacion de la hemoglobina frente a la presion parcial de oxigeno es sigmoidal (fig. 6~21), mientras que una representacion analoqa para la mioglobina del musculo, que solamente posee un grupo hemo y una sola cadena polipeptidica, muestra una curva hiperbolica. El caracter sigmoidal de la curva de union del oxigeno de la hemoglobina significa que esta posee una afinidad relativamente baja para captar a la primera ° segunda molecula de oxigeno, pero una vez que estas se han incorporado, la uni6n de las subsiguientes moleculas de oxigeno resulta muy aumentada. Inversamente, la perdida de una molecula de oxigeno de la hemoglobina cornpletamente oxigenada, provoca que el res to se disocie mas facilmente cuando desciende la presion de oxigeno.

La posicion del equilibrio hemcqlobina-oxiqeno se ve tambien afectada por el pH (fig. 6~21). Cuanto mayor es el pH de la disolucion de hemoglobina a una deterrninada presion parcial de oxigeno, mayor es el porcentaje de su saturacion con oxigeno. Este efecto reversible es debido a que cuando la hemoglobina se oxigena, queda ionizada y deja libre un proton por cad a molecula de oxigeno unida, de acuerdo con la ecuacion siguiente:

en la que HHb+ es una subunidad que posee protones de una molecula de desoxihemoglobina. Puesto que esta reaccion es

150

FIGURA 6-21

Curves de saturaci6n de oxiqeno de la hemoglobina y de la mioglobina. La curve de seturecion sigmoidal de la hemoglobina y su respuesta al cambio de pH permiten a la hemoglobina saturarse casi completamente en los pulmones (presion parcial 100 mm Hg y pH 7.4) y liberer casi un

30 pot: ciento de su oxigeno en los tejidos (presi6n parcial 45 mm Hg y pH 7.2).

La mioglobina, cuya curva de saturaci6n de oxigeno es una hiperbole rectangular, permitirie solamente la liberaci6n del 2 al 3 pot ciento de oxiqeno en las mismas condiciones. En los eritrocitos humanos el metabolito 2.3-difosfoglicerato se halla estrechamente unido a la hemoqlobine, peto solamente de uri modo muy debil a la oxihemoqlobine. Este liqendo ejerce el efecto de [eciliier edemes la liberecion del oxigeno al disrninuir la afinidad de la hemoglobina pot el oxiqeno. El 2,3-difosfoglicerato setae, pot tanto, como modulador de la ectivided de la hemoglobina en el trensporte del oxiqeno.

100

.g 80 'u

'"

3

10 60

'" OJ

""

Curva de saturaci6n de 12 mioglobina

20 Presi6n parcial del oxigeno, mm Hg

Capitulo 6 Proteinesi conformaci6n tridimensional

libremente reversible, el incremento de la concentracion de ion-hidroqeno provocara el desplazamiento del equilibrio a la izquierda, hacia un descenso de saturacion, mientras que la disminucion de la concentracion de hidroqeno provocara que el equilibrio se desplace a la derecha esto es, hacia un Incremento en la saturacion. Este efecto del pH sobre el equilibrio oxiqeno-hemoqlobina recibe el nombre de efecto Bohr.

La presion parcial del oxigeno y el pH son los dos Iactores mas importantes que regulan la funcion de la hemoglobina en el transporte de oxigeno. En los, pulmones, donde la presion parcial de oxigeno (aproximadamente 100 mm Hg) y el pH son relativamente altos, la hemoglobina tiende a hallarse saturada al maximo con el oxiqeno, alrededor del 96 % [vease fig. 6~21). En cambio, en el interior de los tejidos perifericos, donde la tension de oxigeno es baja (alrededor de 45 mm Hg) y el pH tambien es pequefio (debido a la elevada concentracion de CQ2! formado como producto final de la respiracion] la hemoglobina une al oxigeno menos fuertemente, y de este modo, descarqa algo de su oxigeno que cede a la masa de celulas en respiracion hasta una saturacion por parte de la hemoglobina de un 65 % aproximadamente. Asi es que la hemoglobina, en su Iuncion de transportadora del oxiqeno, obedece a un ciclo de entreel 65 y el 96 % de saturacion.

La -curva sigmoidal de union del oxigeno ha sido objeto de intensa investiqacion y especulaciones. puesto que evidentemente refleja una adaptacion bioloqica de la molecula de hemoglobina, que Ie permite funcionar con un maximo de eficiencia molecular. El equilibrio implicado en la etapa de oxiqenacion de la hemoglobina se muestra en las reacciones siguientes (con objeto de simplificar no se incIuyen los equilibrios protonicos}:

Hb+ 02:;::::::! Hb02 Hb02 + O2 :;::::::! Hb(02)2 Hb(02)2 + O2 :;::::::! Hb(02)3 Hb(02la + O2 :;::::::! Hb (02)4

El problema es explicar como las subunidades de la molecula de hemoglobina se acoplan 0 se un en de modo que la oxiqenacion de una de ellas, sea sefialada a las otras y puedan aumentar su afinidad por el oxigeno. Se han propuesto dos modelos generales para interpretar las interacciones entre subunidades durante la oxiqenacion de la hemoglobina (fig. 6~22). Ambas suponen que cada una de las subunidades de la molecula de hemoglobina pueden existir en dos con formaciones diferentes, una con una afinidad elevada, y la 'otra con una afinidad menor por el oxigeno. El primer modelo, indicado por G. Adair hace muchos afios y estudiado recientemente por D. E. Koshland, [r., y sus colaboradores, recibe el nombre de modelo secuencial (fig. 6~22). A medida que una molecula de oxigeno se une a una subunidad determinada, esta cambia su conformacion, adoptando la forma de afinidad elevada, la curl, debido a sus contactos moleculares con sus vecinas, incrementa la probabilidad de que la siguiente subunidad se desplace hacia la forma de afinidad elevada y capte la molecula de oxigeno siguiente, hasta que las cuatro se han unido, y

151


las cuatro subunidades han adoptado la conformaci6n de afinidad elevada. El punto clave del modelo secuencial es, que la molecula pase por una serie de estados de conformaci6n intermedios.

El otro modelo general, el modelo simetcico (fig. 6~22), propuesto por J. Monod, J. iWyman, y J. P. Changeux, pos~ tula que la molecula de hemoglobina existe en dos form as solamente, una con todas las subunidades en la forma de baja afinidad, y otra con todas ellas en la forma de afinidad elevada. En este modelo, la molecula de hemoglobina es siempre simetrica, es decir que todas las subunidades se hallan en un estado 0 en el otro.

Aunque ambos modelos pueden interpretar la curva de oxigenaci6n sigmoidal de la hemoglobina, la evidencia actual favorece al segundo de ellos: es decir, el modele simetrico, par~ ticularmente, el estudio mediante rayos X, que muestra las diferencias de estructura entre las form as oxiqenadas y desoxigenadas. Perutz ha postulado que los dos primeros oxigenos se unen a las subunidades a, modificando sus interacciones i6nicas con las subunidades f3 y provocando la liberaci6n de dos de los protones del efecto Bohr. Las cuatro subunidades se desplazan entonces hacia la forma de alta afinidad. Las restantes dos subunidades un en oxigeno con afinidad elevada, y entonces liberan los otros 2 protones de Bohr.

La hemoglobina constituye un modele 0 prototipo de mu~ chas proteinas oliqomericas que unen dos 0 mas moleculas de ligando a cada una de las dos 0 a mas cadenas polipeptidicas de las subunidades. Entre tales proteinas oliqomericas se halla el grupo de enzimas reguladores conocidas como enzimas elostericos, que se describen en el capitulo IX (pags. 241 a 248). La respuesta de algunos enzimas alostericos a las variaciones en la concentraci6n de su sustrato, se parece a la respuesta de la hemoglobina ante las variaciones de la presion parcial de oxigeno: es decir, cuando la concentraci6n del sustrato aumenta, puede producirse un incremento sigmoidal de la actividad enzimatica. Tanto el modele secuencial como el simetrico (fig. 6~22) se han aplicado al analisis de la Iunci6n de los enzimas alostericos: en muchos casos el modelo secuencial es el mas apropiado (pag. 247).

Conformaci6n de la hemoqlobine falciforme

En la hemoglobina de las celulas falciformes (hemoglobina S), los restos de acido glutamico en la posicion 6 de las cadenas f3 estan sustituidos por valina, cambio que provoca que los globulos rojos sanguineos de los pacientes con anemia Ialciforme adopten la forma de media luna 0 de hoz (fig. 5~ 19, pag. 118) cuando la tension de oxigeno es baja, mientras que las celulas sanguineas rojas normales retienen su forma discoidal por desoxigenaci6n. Estos hechos indican que la conformaci6n de la molecula de hemoglobina S difiere de la de hemoglobina A normal, de tal manera que es el empaquetamiento de las moleculas de hemoglobina S dentro del eritrocito falciforme el que provoca su cambio de forma durante la desoxigenaci6n.

A. Cerami y J. M. Manning han estudiado que tratando eritrocitos de pacientes con anemia falciforme con cianato sodico in vitro, se impide en gran manera la deformaci6n de

152

FIGURA 6~22

ModeLos secuenciel y simetrico para La union cooperetioe del oxigeno pot La hemoqlobine, Estos modelos no soLamente son aplicabLes a La hemoglobina, sino

que lo son tembien a otras proteinas oliqometices que exhiben union cooperativa o ligada de molecules de ligandos a sus subunidades. En ambos modelos, Los circulos indican La coniormecion de La subunidad con poca afinidad para el oxigeno, y los cuadrados La coniormecion de aLta afinidad para el oxigeno. EL modele secuenciel indica que La union de una molecule de oxigeno a La forma

de afinidad eLevada de una subunided incrementa La tendencia de las restantes subunidades para bascuLar a La forma. de gran afinidad cuando se unen secuencielmente el oxigeno. EL modelo simetrico postula que La union de una molecule de oxigeno basta para impulser el equilibria de modo que todas Las subunidedes adopten 1a forma de afinidad elevede.

Modelo secuencial

00 Forma de m afinidad baja

- 0'1lo,

Forma de afinidad elevada

Modelo simetrico

En ausencia de oxiqeno, hay dos [ormes de equilibria, y este se halla muy desplazado en el sentido de la forma de afinidad baja.

ffi

H DO

Forma de aftnidad baja

Forma de D D afintdad alta

,

En presencia de oxigeno, este se une de un modo preje rente a la forma de atinidad alta, impulsando el equilibria hacia

esta ultima.

m Formade 00 afinidad baja

1l DD DO

-o·Ho.

D DO -o~~o,

Forma de afinidad alta

Capitulo 6 Proteinas: coniormecion tridimensional

FIGURA 6-23

Formaci6n del derivedo carbamilico del resto de valina N-terminal de la

cadena f3 de la hemoglobina laleiforme.

rHa ~

CH -CH-CH-C- + H-N=C=O

a I

NH2

CHa 0

I II

----- CHa-CH-CH-CI

NH

I

C=O

I

NH2

Resto de valina Nstermtnal

Acido Isocianico

Derivado carbamilico de la valina N-terminal

las celulas cuando disminuye la tension de oxigeno; tales celulas sobreviven un tiempo mas prolongado y aparentemente funcionan mejor que las celulas Ialciformes no tratadas cuando son devueltas al paciente. El tratamiento con cianato provoca la carbamilacion (pag. 88) del grupo amino-libre en el resto de valina Nsterminai de la hemoglobina S (fig. 6~23). Esta reaccion provoca el efecto de eliminar la carga electrica positiva que se halla normalmente presente en este grupo amino. Se pone asi de manifiesto que la alteracion de un solo grupo cargado en la molecula de lahemoglobina, puede «corregir» su conformacion, de suerte que la molecula se oxigena y desoxigena otra vez normalmente sin deformacion significativa. Ademas, el cianato es muy selectivo en este efecto y no provoca alteracion de otros grupos amino en las hemoglobinas. Este efecto del cianato se esta estudiando en la actualidad para comprobar su posible utilidad en el tratamiento clinico de las crisis que se producen en la anemia Ialciforme (pag. 118).

Disociecioti y desneturelizecion. de las proteinas oliqomerices

Cuando las proteinas con dos 0 mas subunidades de cadenas polipeptidicas se someten a acciones que provocan desnaturalizacion, es decir, a acidez elevada, calor 0 concentraciones altas de urea 0 de guanidina, experimentan cambios confermacionales hacia formas mas anarquicas en dos etapas: 1) disociacion de las cadenas entre si, y 2) desplegamiento de las cadenas separadas produciendo arrollamientos al azar. Si el tratamientose realiza muy cuidadosamente, las cadenas polipeptidicas de una proteina oliqomerica pueden a veces separarse un as de otras sin alterar su estructura terciaria normal. La hemoglobina, por ejemplo, puede disociarse por accion de las sales en dos medias moleculas, es decir, dos subunidades a{3. Las subunidades separadas se reasocian para reconstituir la proteina oliqomerica plenamente activa cuando se diaIiza el exceso de sal.

Sin embargo, si se emplean condiciones mas drasticas, las subunidades polipeptidicas no solamente se separan, sino que ademas se despliegan para formar arrollamientos anarquicos, Aunque ser~ de esperar que las proteinas oliqomericas totalmente desnaturaltzadas, se replegasen espontaneamente a su forma nativa, con menos probabilidad que las proteinas sencillas de una sola cadena pclipeptidica, cierto mimero de pro-

153


teinas oliqomericas son capaces de experimentar desnaturalizaci6n completamente reversible. Por ejemplo la acidificaci6n del enzima aldolasa (pag. 435) provoca que sus cuat~? subunidades se separen y se desplieguen; cuando el pH se~leva a alrededor de 7.0. las subunidades se repliegan espontaneamente y adoptan sus estructuras terciarias nativas reasociandose a continuaci6n para formar el enzima oliqomerico cataliticamente activo. Estos hechos indican que las secuencias aminoacidas de las cadenas polipeptidicas en una proteina oliqomerica especifican no solamente sus estructuras secundaria y terciaria, sino tambien la geometria de los locus de contacto que hacen posible el acoplamiento exacto de las cadenas de las subunidades polipeptidicas, y por en de una asociaci6n cuaternaria muy firme. entre ellas. De este modo estos rasgos dotan a algunas proteinas oliqomericas tales como la aldolasa y la hemoglobina de la capacidad de autoensamblarse.

Sondas de la conformaci6n proteica

Las moleculas de proteina experimentan. con frecuencia cambios de conformaci6n durante el curso de su funci6n bioloqica, especialmente los enzimas. Tales cambios pueden detectarse mediante ciertas medidas fisicas. Hemos vis to (pag. 133) que las mediciones de rotaci6n 6ptica de los polipeptidos pueden decirnos si se hallan presentes en forma de arrollamientos anarquicos 0 de helices a. ya que la helice a posee una asimetria intrinseca. En otro tipo de medidas opticas, la de dispersian aptiea rotatoria, la rotaci6n 6ptica de una molecule de proteina se determina sobre un amplio intervalo de longitudes de onda de luz incidente. En la figura 6~24 aparece una representaci6n grafica tipica de la dispersi6n 6ptica rotatoria de una proteina nativa; se observa una profunda depresi6n en las proximidades de 234 nm. Este agudo cambio de magnitud de la rotaci6n 6ptica en funci6n de la longitud de onda se conoce como eleeto Cotton; la mayor parte de las proteinas muestran un efecto Cotton en las proximidades de 225 a 235 nm. La rotaci6n 6ptica de una proteina en las proximidades 0 en el mismo punto de inflexi6n es un indicador sumamente sensible de los cambios de su conformacion. Otra prueba sensible de los cambios conformacionales es la

Longitudes de onda en nm

154

FIGURA 6~24

Curve de dispersion optice rotatoria de una proteine tipice, mostrendo el eiecto Cotton a 234 nm, Se producen tembien electo« Cotton cuando las proteines captan molecules de ligandos; normalmente se producen a longitudes de onda mayores que las del electo Cotton itttrinseco que aqui

se muestre.

FIGURA 6-25

Representaciones obtenidas mediante ordenedor electronico de fa esttucture del esqueleto de una cadena polipeptidice,

a medide que el modelo se hece qirer elrededor de su eje vertical. Tomado de C. Levinthel, Scientific American. Noviembre 1966.

Capitulo 6 Proteinas: coniormacion tridimensional

155

PARTE 1 cOMPoNENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

medida del dicroismo circular de las proteinas. Cuando la luz polarizada circular 0 elipticamente atraviesa lW-? disolucion de proteinas, la luz transmitida puede estar polarizada en un plano por la desigual absorcion de los componentes dextro y leva de Ia luz incidente.

Otro metodo sensible de deteccion de los cambios de conformacion tridimensional de una proteina en disolucion, se basa en la medida de los cambios de fluorescencia. Cuando los tres aminoacidos aromaticos [fenilalanina, tirosina y triptofano] se excitan por la Iuz visible 0 la ultravioleta, exhiben fIuorescencia, es decir, emiten luz a una longitud dis tint a de la luz incidente. La relacion de la luz fluorescente emitida con la luz incidente absorbida, Hamada rendimiento cuimtico, es muy sensible a los cambios de corto radio de accion en el entorno que rodea a los grupos R de los aminoacidos aromaticos. En un metodo descrito, Ham ado poladzacion por fluores~ cencie, la proteina se excita con luz polarizada y el grado de polarizacion de la luz fluorescente emitida, se mide, proporcionando una informacion valiosa acerca del tamafio, la forma y el movimiento rotacional de la proteina.

La espectroscopia de resonancia nuclear magnetica (NMR) se ha convertido tambien en un instrumento poderoso para determinar cuales son los restos aminoacidos de una molecula proteica nativa que participan en los cambios de conformacion. La proteina se situa en un campo maqnetico oscilante de intensidad variable. Parte de la radiacion electromaqnetica resulta absorbida por los nucleos atomicos que poseen momentos angulares de spin distintos de cero, especialmente los de los atomos de hidrogeno y de deuterio. Puesto que los protones de diferentes tipos de los grupos funcionales (- OH, = CH -, - CH-:j-, - CH3) poseen resonancias maqneticas diferentes y caracteristicas, los cam bios en el entorno local de tales gru~ pos pueden ponerse de manifiesto mediante medidas de NMR. Es de especial importancia, un refinamiento de la espectroscopia NMR. que permite poner de manifiesto el momento an~· gular del isotope BC, presente en pequefias cantidades en el carbono natural de las proteinas. Con este poderoso metodo es posible la determinacion de cambios en el entorno de los atomos de carbono en enlaces peptidicos, atom os de carbono a y grupos R no saturados y aromaticos. Con estos nuevos metodos pueden ponerse de manifiesto las porciones especificas de la cadena polipeptidica que experimentan cambios de conformacion.

Pueden construirse esquemas de las con formaciones tridimensionales del esqueleto de la cadena polipeptidica de las moleculas proteicas mediante ordenadores electronicos (figu~ ra 6~25).

Predicci6n de la estructura terciaria

Si las con formaciones secundaria y terciaria de las moleculas de proteina son reflejo del ajuste resto a res to de la cadena polipeptidica para producir estados locales de energia libre minima, podria considerarse como teoricamente posible, predecir la estructura terciaria completa de una proteina determinada a partir de su secuencia aminoacida, partiendo de consideraciones tales como las restricciones impuestas por los anqulos cf> y '" en cada enlace peptidico. Se han realizado

156


intentos para Ilevar a cabo este tipo de calculos con la ayuda de com put adores electronicos, Puede calcularse para cada res to aminoacido la conformacion de energia libre minima a partir de datos de interacciones electrostaticas, de van der Waals y de las interacciones est eric as de los grupos R adyacentes. Aunque no es posible todavia predecir con formaciones proteicas completas a partir de la secuencia aminoacida, debido ala gran complejidad de los factores de corto y largo radio de accion que deben tenerse en consideracion, se han conseguido ya avances significativos en est a direccion.

Resumen

Cada proteina posee al menos una conformaci6n tridimensional en la que es estable y activa en condiciones biol6gicas de temperatura y de pH: es la conformaci6n nativa. El analisis por rayos X de las a-queratinas, proteinas Iibrosas del pelo y de la lana, muestra que sus cadenas polipeptidicas son arrollamientos a-helicoidales dextro, que poseen 3,6 restos arninoacidos por vuelta y que se mantienen unidos por formaci6n del maximo numero posible de enlaces de hidr6geno intracatenarios. Cada atomo de oxigeno del carbonilo peptidico en la helice a se halla unido mediante enlace de hidr6geno al -NH- del enlace peptidico situado tres restos mas alia. En las a-queratinas, los enlaces disulfuro transversales de la cistina mantienen unidos los arrollamientos a-helicoidales paralelos. La Hbroina de la seda que es una ,8-queratina posee una estructura de lamina plegada en la que los esqueletos polipeptidicos se hallan en conformaci6n ,8 extendida de la cadena polipeptidica y se hallan unidos transversalmente mediante enlaces de hidr6geno intercatenarios. Las tres cadenas del colaqeno, que es una proteina fibrosa, estan constituidas por tres helices en sentido levo, las cuales se entrelazan para formar la unidad repetida basica de tropocolaqeno de una fibrilla de colaqeno. El colaqeno es rico en glicocola, prolina e hidroxiprolina.

EI analisis por rayos X de proteinas globulares tales como la mioqlobina muestra que sus cadenas se hall an plegadas muy compactamente, dejando poco espacio en el interior para moleculas de agua. Todos 0 casi todos los grupos R polares de las proteinas globulares se hallan sobre la superficie y estan hidratados; los residuos hidrofobicos permanecen ocultos enel interior. En funci6n de su secuencia arninoacida, las proteinas globulares contienen cantidades muy variables de helice a 0 de conforrnaci6n ,8. Los restos de prolina dan lugar a curvaturas en los arrollamientos a-helicoidales.

La conformaci6n del esqueleto de la cadena pollpeptidica viene automaticamente determinada mediante: 1) los grupos peptidicos plana res riqidos, 2) limitaciones acerca de los anqulos de rotaci6n (los anqulos cf> y 1/1) de los enlaces sencillos C.-C y C.-N y 3) el tamafio, la polaridad y la carga de los grupos R. AIgunas proteinas desnaturalizadas 0 desplegadas espontanearnente vuelven a adoptar su conformaci6n nativa con mucha rapidez, a pesar del hecho de que el tiempo necesario para comprobar 0 seleccionar todas las conformaciones posibles es casi infinito. En el replegamiento espontaneo intervienen interacciones cooperativas.

La estructura cuaternaria de protein as oliqomericas tales como la hemoglobina, viene tambien determinada por la secuencia aminoacida primaria de los componentes de las cadenas polipeptldicas. La hemoglobina puede unir a cuatro moleculas de oxigeno en una relaci6n que indica que las subunidades interaccionan de modo cooperativo. La union del oxigeno va acompafiada por cambios de conformaci6n de las subunidades. Los cambios de estado conformacional por la union de ligandos se producen en muchas proteinas oliqomericas. Puede explicarse bien por transiciones secuenciales de sucesivas subunidades 0 por transiciones simetricas todo o nada de la molecula oliqornerica completa.

Bibliografia Libros

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Articulos

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Problemas

1. Calculese la longitud (en nan6metros) de una cadena polipeptidica que contiene 105 restos arninoacidos, si a) se encuentra totalmente en forma de helice 01. b) se halla extendida por complete.

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2. En el polipeptido siguiente: a) lQue secciones podria esperarse que tuvieran configuraci6n a-helicoidal a pH 7.0? b) lEn que lug ares podrian aparecer puntos de curvatura? c) lD6nde podrian formarse enlaces cruzados?

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

He-Ala - His - Thr- Tyr-Gly -Pro -Phe -Glu -Ala -Ala -Met-Cys-Lys- 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Trp-Glu-Glu-Glu-Pro-Asp-Gly-Met-Glu-Cys-Ala-Phe-His-Arg

3. La cubierta proteica del virus del mosaico del tabaco contiene 2130 subunidades identic as. cadenas polipeptidicas de 130 aminoacidos cada una. Si cada error de inserci6n de un aminoacido origina una subunidad defectuosa, que se desecha, estirnese la frecuencia maxima de errores posible (numero por 1 000 000 de restos) si el rendimiento final de particulas virales activas intactas debe ser el 50 % de todo el polipeptido viral confeccionado. Repitase el calculo suponiendo que la cubierta esta construida por una sola cadena polipeptidica,

4. La cadena polipeptidica de una determinada protein a es a-helicoidal en algunos segmentos y posee conformaci6n f3 en otros. La proteina tiene un peso molecular de 240 000. y la longitud de su contorno es de 5.06 X 10-5 em. Calculese la fracci6n de la molecula que existe en configuraci6n a-helicoidal.

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