N 140

Pg. 1: Reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real

Pg. 4: Agenda de congresos

Boletn del Servicio Bibliogrfico de Wiener Laboratorios S.A.I.C.

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Ao XLII - Junio 2008

Director: Gustavo A. Capriotti - Redactor: Cristina M. Crepaldo - Editor Responsable: Wiener Laboratorios S.A.I.C. - 2000 - Rosario - Argentina

REACCION EN CADENA DE
LA POLIMERASA EN
TIEMPO REAL
La Real Time PCR (del ingls: Reaccin en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real) es un mtodo
revolucionario basado en la PCR tradicional desarrollada por Kary Mullis en los aos 80. Esta tcnica original
permite amplificar secuencias especficas de cido desoxirribonucleico (ADN) ms de un billn de veces.
Muchas tcnicas alternativas se han desarrollado en los ltimos aos a partir de la PCR, facilitando la
manipulacin del ADN y permitiendo avances importantes a nivel cientfico.
Capriotti, G. A.; Gariglio, R.C.
Centro de Investigacin y Biotecnologa, Wiener lab., Rosario, Argentina.
rgariglio@wiener-lab.com.ar

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iguchi y colaboradores consiguieron en el ao 1992 la primera demostracin de la Real

Time PCR, la cual representa otro salto
tecnolgico importante ya que ha abierto la posibilidad de nuevas y poderosas
aplicaciones para la investigacin a nivel mundial. Esta reaccin es un proceso de amplificacin por PCR y deteccin
simultnea del ADN amplificado en
tiempo real, pudiendo realizarse dicha
deteccin por medio de diferentes qumicas.
En los ltimos aos, el nmero de compaas que ofrecen instrumentos y reactivos para Real Time PCR, sumado a la
inmensa cantidad de trabajos cientficos
publicados, ponen en evidencia la importancia y competitividad de mercado que
produjo esta tecnologa.
La Real Time PCR generalmente envuelve sondas fluorognicas que iluminan

o fluorescen mostrando la cantidad de

ADN presente en cada ciclo de amplificacin. Otros trminos con que se conoce la tecnologa son: PCR cintica
refirindose al proceso antes mencionado o PCR cuantitativa, ya que la metodologa permite cuantificar una secuencia especfica de ADN presente en
la muestra biolgica en estudio.
Por otra parte, el ADN complementario (ADNc) generado bajo condiciones
adecuadas a partir de la retrotranscripcin de un templado de cido ribonucleico (ARN), puede ser utilizado tambin como ADN blanco en la Real Time
PCR, reaccin que se conoce como RTReal Time PCR, ampliamente utilizada en
el trabajo con retrovirus, en la investigacin de la expresin de genes, etc.
Durante la amplificacin, la rapidez con
que la seal fluorescente alcanza el nivel umbral (Threshold level), se correla-

ciona con la cantidad inicial de ADN

blanco, permitiendo de esta manera poder cuantificarlo. El nmero de ciclos
necesarios para que la seal fluorescente alcance el nivel umbral, se conoce
como Threshold cycle (CT) y es el parmetro en el cual se fundamenta la cuantificacin segn veremos ms adelante.
A mayor CT, menor ser la cantidad de
ADN blanco o templado inicial.
La Figura 1 muestra curvas tpicas de
amplificacin, donde se grafica en el eje
de las ordenadas el aumento de fluorescencia producido durante el transcurso
de la reaccin (1a: graficado en escala
lineal y 1b: en escala logartmica) y en el
eje de las abscisas, cada ciclo de la PCR.
La lnea horizontal de color rojo est indicando dicho valor umbral de fluorescencia a partir del cual se definen los CT,
siendo este umbral fijado en la fase
exponencial de la reaccin.

 Reaccin en cadena de la polimerasa...

Figura 1b

Figura 1a
Figura 1: Curva de amplificacin
Una de las ventajas fundamentales de
la Real Time PCR en relacin a la PCR
tradicional de punto final, es que en la
primera las mediciones se realizan en la
etapa exponencial de la reaccin donde
en teora, por cada ciclo de amplificacin se acumula el doble de producto
respecto al ciclo anterior, asumiendo
una eficiencia del 100%. Por el contrario, en la PCR de punto final la deteccin del producto de amplificacin se
realiza en la fase plateau de la reaccin,
donde la misma ya se detuvo y hay degradacin de producto. Por lo tanto,
medidas realizadas en esta fase, no ofrecen resultados muy confiables en cuanto a la cantidad inicial de templado de
la muestra (Figura 2).
Otras ventajas de la Real Time PCR son:
- Sistema homogneo que evita la manipulacin de amplificado, evitando el
grave problema de contaminaciones
con el mismo.
- Rapidez en la obtencin de resultados.
- Amplio rango dinmico de cuantificacin.
- Permite monitorear la eficiencia de la
reaccin.
- Mnima variabilidad en los resultados,
dando una cuantificacin confiable y
precisa.
La habilidad que posee la Real Time PCR
para monitorear el progreso de la amplificacin del ADN blanco en tiempo real,
se logra mediante diferentes qumicas e
instrumentacin especficas. Generalmente, las qumicas consisten en diferentes compuestos fluorescentes o fluorforos que pueden proporcionar una

deteccin de tipo no especfica (como

son los colorantes fluorescentes) o especfica (como el caso de los cebadores y
sondas fluorescentes).
Dentro de los colorantes fluorescentes,
el ms utilizado es el SYBR Green I que
tiene la propiedad de unirse al ADN
doble hebra de manera inespecfica,
emitiendo hasta 1000 veces ms fluorescencia cuando se encuentra unido al
ADN que cuando est libre en solucin
(absorbe luz de 480 nm de longitud de
onda y emite a 520 nm) (Figura 3). Por
lo tanto, el incremento de la seal de
fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN doble hebra presente en el
tubo de reaccin y la misma se mide al
final de la fase de extensin de la PCR.
Su principal desventaja es la inespecifi-

cidad, ya que se une independientemente de la secuencia del ADN, pudiendo

generar resultados falsos positivos al detectar ADN espurios como son por ejemplo los dmeros de cebadores de la reaccin.
Una forma de asegurar en estos casos la
especificidad de la deteccin, es analizando las curvas de disociacin o de
melting (Figura 4). Se puede lograr una
mejor caracterizacin del producto de
amplificacin, sometiendo el mismo a un
aumento de temperaturas para determinar la temperatura de disociacin o
melting point, caracterstica para cada
producto, ya que depende de la longitud y composicin nucleotdica del mismo. La presencia de dos o ms picos, sugiere que se ha obtenido ms de un am-

Figura 2: Etapas de la reaccin de amplificacin

 Reaccin en cadena de la polimerasa...

Figura 3: Fundamento del colorante fluorescente SYBR Green I

plificado y que el proceso de amplificacin no fue especfico para el ADN blanco.
Por otra parte, estn los sistemas de sealizacin basados en cebadores fluorescentes. Estos varan considerablemente
desde el ms simple llamado LUXTM
primers (Light Upon Extension) a los ms
complejos como ScorpionTM primers. Si
bien no se detallarn aqu sus respectivos fundamentos, ambos tipos de cebadores poseen en solucin, una secuencia corta auto-complementaria que hace
que los mismos estn apagados
(quenched) y no emitan fluorescencia.
Cuando se produce la hibridizacin del
cebador al ADN blanco y su estructura
se despliega, se observa un incremento
importante en la fluorescencia, el cual es
medido justamente durante esta etapa.
La tercera categora de sistemas de sealizacin para Real Time PCR, es aquella que envuelve un tercer oligonucletido fluorescente localizado entre los
cebadores, denominado comnmente
sonda. A diferencia de los sistemas anteriores, ste agrega especificidad a la
reaccin, al intervenir un tercero y a
veces hasta un cuarto oligonucletido o
sonda. Hay varios sistemas basados en
sondas fluorescentes, los ms conocidos
son: TaqMan probes, Molecular
Beacons, Hybridization probes, Locked
Nucleic Acid (LNA) probes, LightUp
probes, etc. En cada caso, mltiples colorantes fluorescentes (ej. Fluorescein,
6-FAM, JOE, VIC, Cal Fluor, etc.), pueden ser utilizados con una variedad de
quenchers (ej. TAMRA, DABCYL, BHQ,
etc) que produzcan eficientemente el
necesario efecto FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfer). Dicho efecto se basa en que la excitacin electr-

nica de uno de los colorantes fluorescentes, es transferida al colorante aceptor

cuando ambos se encuentran en posiciones cercanas, impidiendo la emisin de
fluorescencia del primero. Cuando ambas molculas se alejan, por diferentes
mecanismos segn el caso, los colorantes fluorescentes emiten fluorescencia
libremente.
Es importante cuando se disea el sistema de amplificacin a utilizar, tener en
cuenta las ventajas y desventajas que
presentan las diferentes opciones descritas. Utilizando sistemas basados en sondas fluorescentes, se suma la posibilidad
de llevar a cabo reacciones multiplex, que
tanta relevancia tienen a nivel diagnstico por su practicidad.

Adems es imprescindible que el instrumento est acoplado a una computadora que posea un software apropiado para
la recoleccin y anlisis de los datos generados.
Las curvas de amplificacin graficadas
por dicho software determinan el nmero de ciclo en el cual la fluorescencia
alcanza el valor umbral (CT). Este valor
de CT es inversamente proporcional a la
cantidad inicial de la secuencia especfica del cido nucleico a cuantificar, en
la muestra original. A partir del mismo,
el software realiza los clculos de cuantificacin.
Un tipo de cuantificacin es la absoluta,
que se utiliza para cuantificar muestras
desconocidas por interpolacin a partir
de una curva estndar, generada a partir de diluciones en serie de una muestra de concentracin conocida del ADN
blanco. Un caso en donde se utiliza este
tipo de cuantificacin, es la determinacin del nmero de copias de un virus.
En la Figura 5 se muestra un ejemplo de
cuantificacin absoluta, donde se grafican los respectivos CT correspondientes
a cada muestra de la curva estndar,
versus el logaritmo de las concentraciones conocidas de las mismas.

Figura 4: Curva de disociacin

Hay una amplia variedad de instrumentos para Real Time PCR, que consisten
en una parte ptica y otra de termociclador para realizar la reaccin. La qumica elegida y el instrumento estn ntimamente relacionados. Hay tres formas bsicas en que los instrumentos pueden aportar la energa de excitacin para
los fluorforos: mediante lmparas, diodos o lser, combinados con distintos tipos de fotodetectores para medir la fluorescencia emitida.

El nmero de copias de la muestra de

ADN desconocida, puede calcularse a
partir de la regresin lineal de la curva
estndar de la siguiente manera:
Log10 N de copias = CT - y-intercept / slope
Siendo: y-intercept: la ordenada al origen
que da la sensibilidad y slope: la pendiente de la curva que da una medida de la
eficiencia de la amplificacin.
La cuantificacin relativa es utilizada
para analizar cambios en la expresin de

 Reaccin en cadena de la polimerasa...

Agenda de congresos

Agenda de Congresos
Argentina
XVII Jornadas Bioqumicas
del NOA
Jujuy, 7 al 9 de Agosto de 2008
Organiza / Informes
Colegio de Bioqumicos de Jujuy
infocbj@cobiju.com.ar
V Congreso Argentino de la
Calidad en el Laboratorio Clnico
CALILAB 2008

Figura 5: Cuantificacin Absoluta

un gen en una dada muestra en relacin
a otra muestra de referencia, por ejemplo en respuesta a un tratamiento. Esas
muestras de referencia contienen genes
invariables, llamados Housekeeping genes,
los cuales normalmente no sufren cambios bajo las condiciones experimentales, sirviendo por lo tanto como estndares internos. Por lo tanto, las aplicaciones ms importantes de esta tecnologa, adems de incluir las de la PCR
convencional, son entre otras:
- Cuantificacin absoluta y relativa de
la expresin gnica (mediante RT- Real
Time PCR).
- Deteccin y cuantificacin de microorganismos (bacterias, virus, hongos, etc).
- Identificacin de mutaciones o polimorfismos de base simple (SNP) y genotipificacin (mediante el anlisis de
curvas de melting).
- Inestabilidad genmica: identificacin
de deleciones/inserciones que resultan
en trisomas, monosomas, etc.
- Validacin de datos de expresin gnica generados por anlisis de microarrays.
- Medicin del nmero de copias de
ADN en general.
- Inmuno-qPCR.
- Anlisis cuantitativo de metilacin de
ADN.
reas como la Microbiologa, Gentica
y Farmacogentica, Oncologa y Trans-

plante se han visto beneficiadas por la

implementacin de la Real Time PCR.
Otros campos de aplicacin de esta tecnologa de gran potencial, son: Agricultura, Veterinaria, Alimentos y Medicina Forense.
Cualquier necesidad de medicin rpida y precisa de pequeas cantidades de
cidos nucleicos, representa un futuro
potencial para innovaciones basadas en
Real Time PCR.
La evolucin de los instrumentos, el desarrollo de nuevas qumicas de deteccin, la estandarizacin en la puesta a
punto de sistemas basados en esta tecnologa, dispararn seguramente nuevas
aplicaciones y el surgimiento de procesos relacionados, tiles en el campo de
las Ciencias Biolgicas.

Bibliografa
- Valasek MA, et al. The power of real-time
PCR. Adv Physiol Educ 2005, 29:151-9.
- Dorak MT. Real-time PCR 2006, Edit.
Taylor & Francis Group.
- Kubista M, et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine 2006, 27:95-125.
- Bustin SA, et al. Real-time reverse
transcription PCR (qRT-PCR) and its
potential use in clinical diagnosis.
Clinical Science 2005, 109:365-79.

Buenos Aires, 10 al 12 de
Setiembre de 2008
Organiza / Informes
Fundacin Bioqumica Argentina
www.fba.org.ar/calilab
calilabV@fba.org.ar

Chile
XIV Congreso Chileno de
Tecnologa Mdica
Calidad sin Fronteras
27 al 30 de Agosto de 2008
Organiza / Informes
Colegio de Tecnlogos Mdicos
Regional Arica
www.congresotmarica.cl

Brasil
42 Congreso Brasileiro de
Patologia Clnica y Medicina
Laboratorial
San Pablo, 2 al 5 de Julio de 2008
Organiza / Informes
Sociedade Brasileira de Patologia
Clinica (SBPC)
www.sbpc.org.br

Estados Unidos
2008 AACC Anual Meeting
and Clinical Lab Expo
29 al 31 de Julio de 2008
Convention Center, Washington
DC, USA