TRANSFORMACIN DE ESCHERICHIA COLI CON ADN PLASMIDICO T. de la Rubia y J.

Martnez

OBJETIVOS: el alumno tras realizar esta prctica aprender a: 1. Modificar el genoma de una acteria !. "ro#ocar la transformaci$n de E. coli con %&' plasm(dico ). *tilizar los anti i$ticos como agentes de selecci$n.

Contenido: I I'T+O&*,,I-'

II M.TO&OS III +ES*/T%&OS IV %*TOEV%/*%,I-'

TRANSFORMACIN DE ESCHERICHIA COLI CON ADN PLASMIDICO

I. INTRODUCCIN /as acterias pueden transmitir la informaci$n gen0tica #erticalmente mediante la di#isi$n celular 1 reparto e2uitati#o del material gen0tico o ien de forma 3orizontal entre c0lulas 2ue coe4isten /a transferencia 3orizontal de genes5 tam i0n conocida como transferencia lateral de genes5 es por tanto un proceso en el 2ue el organismo transfiere material gen0tico a otra c0lula no emparentada. Este mecanismo se considera fundamental en la e#oluci$n de los procariotas. Es el principal mecanismo por el cual las acterias diseminan genes de resistencia a los anti i$ticos.

1.

Mecanismos de transferencia de material gentico

1.1.

Conjugaci n

E4isten tres mecanismos de transferencia 3orizontal de informaci$n gen0tica: la conjugaci n la transducci n 1 la transformaci n. /a con6ugaci$n es la transferencia de material gen0tico a tra#0s del contacto c0lula7c0lula 1 mediado por factores de fertilidad 8plsmidos de fertilidad9. Es un proceso de transmisi$n se4ual de informaci$n gen0tica. Encontrar informaci$n ms completa so re la con6ugaci$n acteriana en los apuntes :on line; del "rofesor &. E. Ia<ez /a transducci$n es el proceso de transferencia de material gen0tico desde una acteria donadora a otra receptora mediada por part(culas de acteri$fagos 8#irus acterianos9 2ue contienen %&' del genomio de la acteria

1.!.

Transducci n

donadora. Encontrar informaci$n ms completa so re la transducci$n en los apuntes :on line; del "rofesor &. E. Ia<ez /a transformaci$n gen0tica es el intercam io de material gen0tico producido cuando una acteria es capaz de captar fragmentos de %&' de otra acteria 2ue se encuentran dispersos en el medio donde #i#e 1 e4presar los genes transferidos. Solo algunas acterias pueden ser transformadas. /as 2ue pueden serlo se dice 2ue son competentes. Encontrar informaci$n ms completa so re la transformaci$n acteriana en los apuntes on line del "rofesor &. E. Ia<ez 1.".1. #stado de com$etencia $ara la transformaci n "ara 2ue se produzca la transformaci$n de una acteria 0sta de e encontrarse en un estado fisiol$gico denominado :de competencia;. /as c0lulas competentes son a2uellas suscepti les de ser transformadas 15 por lo tanto5 tomar %&' e4terno e introducirlo en su citoplasma. El %&' asimilado de esta forma puede e4presar sus genes en la acteria transformada.

1.".Transformaci n

II. M%TODO& 1.Material necesario &os tu os Eppendorf con => l de c0lulas competentes de Escherichia coli ! placas de medio /B agar sin ampicilina ! placas de medio /B agar con ampicilia

1 tu o Eppendorf con 17! g de plsmido p?EM7

T 2ue es portador de un gen de resistencia a la ampilicila. Micropipetas de diferentes #ol@menes 8!5A>51>> 1 A>> l9 "untas de micropipetas est0riles Tu o con medio /B caldo Ba<o a =!B, Incu ador a )CB,

 ,ontenedor con 3ielo picado Tu os Eppendorf est0riles

!.

Caldo de '(: )'uria (ertani *rot+,

Medio l(2uido para ensa1os generales de gen0tica molecular con Escherichia coli. ,omposici$n por /itro: "eptona de case(na E4tracto de le#adura ,l'a pD C.! 1>g Ag Ag

!.1. -re$araci n de las $lacas de '( . '( con am$icilina

"ara solidificar este medio 8%gar /B9 a<adir 1A g de agar acteriol$gico por litro. %utocla#ar 1 repartir en placas "ara las placas de /B agar con ampicilina proceder igual 2ue en la anterior 1 una #ez autocla#ado el medio5 mantener a A>B, para a<adir el anti i$tico 8ampicilina9. "reparaci$n de la %mpicilina: "reparar una soluci$n madre 1>>>4 de ampicilina 8disol#er 1>>mg en 1ml de agua destilada9. Esterilizar por filtraci$n. %<adir la soluci$n de ampicilina 81 l por ml de medio9 al medio /B agar a A>B, 1 repartir en placas /a ma1or(a de las c0lulas de en ser manipuladas para 2ue se #uel#an competentes o capaces de tomar %&' de medio. ,ulti#ar E. coli en medio /B ,uando los culti#os est0n en fase e4ponencial se centrifugan. &esec3ar el so renadante 1 la#ar las c0lulas repetidamente con soluci$n de ,a,l! 1>>mM Suspender las c0lulas en un #olumen 1> #eces

".-re$araci n de las clulas com$etentes de Escherichia coli

inferior al del culti#o Mantener tu os Eppendorf en 3ielo +epartir al(cuotas en los tu os Eppendorf preenfriados %lmacenar rpidamente las suspensiones a 7C>B, 3asta 2ue las c0lulas #a1an a ser transformadas /. Tcnica de transformaci n 1. Introducir dos tu os Eppendorf est0riles en 3ielo marcar uno como E%&' 1 el otro como 7%&'

3.

%<adir a cada tu o => l de la suspensi$n de c0lulas competentes %<adir a la suspensi$n marcada como E%&' ! l de soluci$n de plsmido p?EM7T 8la otra suspensi$n se somete a la misma manipulaci$n para #erificar al final del e4perimento 2ue las c0lulas competentes son sensi les al anti i$tico9.

4.

A.

Incu ar am as suspensiones en 3ielo durante ! minutos

F.

,olocar am as suspensiones en un a<o a =!B, durante no mas de F> segundos. Demos sometido a las c0lulas a un c3o2ue t0rmico durante el cual se de e producir la entrada del %&' plasm(dico en las c0lulas competentes.

C.

Enfriar las suspensiones en 3ielo durante ! minutos

8.

%<adir =>> l de caldo /B a am os tu os

G.

Incu ar a )CB, en agitaci$n a 1A> rpm durante 1 3ora. &urante este periodo se reinicia la acti#idad meta $lica 1 se e4presarn los genes introducidos.

0. Detecci n de transformantes 1. &iseminar A> l de la suspensi$n de c0lulas transformadas 8%&'E9 en am os medios de culti#o /B agar selecti#o 8con ampicilina9 1 no selecti#o.

2.

&iseminar A> l de la suspensi$n de c0lulas no transformadas 8%&'79 en am os medios de culti#o /B agar selecti#o 8con ampicilina9 1 no selecti#o.

). Incu ar las placas a )CB, durante != 3oras

III. Resultados

/a aparici$n de colonias en el medio selecti#o %gar /B con ampicilina indica las c0lulas 2ue 3an ad2uirido resistencia a la ampicilina por transformaci$n con el plsmido de resistencia

I1. 2UTO#12'U2CIN: 1. 34u es la transferencia +ori5ontal de genes6 a. Es la transferencia de material gen0tico a la descendencia . Es la transferencia de material gen0tico a otra c0lula no

descendiente. c. %2uella 2ue ocurre durante la fase logar(tmica de crecimiento !. 3C mo $ueden o*tenerse clulas com$etentes $ara la

transformaci n6 a. Mediante la incu aci$n a a6as temperaturas . Mediante tratamiento con ,l!,a c. Mediante sonicaci$n ". 34u es la transformaci n gentica6 a. /a transferencia de material gen0tico entre acteriogafos . /a transferencia de material gen0tico por contacto f(sico de las c0lulas c. /a transferencia de materia gen0tico del medio acteria a tra#0s de