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2 TECNICAS UTILES PARA ELCONTROL MICROBIOLGICO DE LOS ALIMENTOS

3.2.1 CULTIVO DE MICROORGANISMOS

3.2.1.1 Fundamento El cultivo de microorganismos tiene por objeto su estudio e identificacin, que se efecta mediante las caractersticas que presentan las bacterias. Dichas caractersticas dependen del comportamientode las poblaciones, ms que de los organismos individualmente, de ah que sean importantes los materiales y mtodos para conseguir el desarrollo y la multiplicacin. 3.2.1.1.1 Cultivo en medios lquidos

Material:

Caldo nutritivo en tubos, estril. Alimento problema o dilucin de ste. Asa de siembra. Mechero. Estufa de 37 C.

Mtodo:

Sembrar en tubo con caldo nutritivo un asa del alimento problema o de la dilucin. Llevar a la estufa a 37 C. Observar a las 48 horas el tipo de crecimiento.

3.2.1.1.2 Cultivo en medios slidos Material:

Tubos de ensayo con Agar triptosa (inclinado ). Agar triptosa estril. Placas de Petri estriles. Asa de siembra. Pipetas de 1 mL, estriles. Estufa a 37 C.

Material:

Tubos de ensayo con Agar triptosa (inclinado). Agar triptosa estril. Placas de Petri estriles. Asa de siembra. Pipetas de 1 mL, estriles. Estufa a 37 C.

Tipos de siembra Siembra en tubo con Agar inclinado: Sembrar sobre la superficie del Agar inclinado un asa del alimento problema o de la dilucin. Incubar los tubos a 37 C. Observar a las 48 horas la forma de crecimiento. Siembra en placa en estra: Poner 15 mL de Agar triptosa, en una placa de Petri estril, dejar solidificar. Sembrar en estra un asa de alimento problema o de la dilucin. Incubar las placas, en posicin invertida, a 37C durante 48 horas. Observar el tamao, forma y aspecto de las (plana, convexa, umbilicada...etc.; brillante, seca..etc.). Siembra en placa por homogeneizacin en masa: Poner 1, 0.5 y 0.1 mL de alimento (o dilucin) problema en placas de Petri estriles. Aadir 10-15 mL de gar nutritivo a cada una de las placas, atemperado a 45C. Realizar movimientos circulares y devaivn para que el inculo se distribuya uniformemente. Dejar solidificar. Incubar las placas invertidas a 37C durante 48 horas. Contar las placas que tienen entre 30-300 colonias. Siembra en placa por superficie: Poner 15 ml de Agar Triptosa en una placa de Petri estril. DEjar solidificar. ADicionar 0.1 ml de la muestra o de las diluciones del alimento y distribuir de forma homognea por la superficie con ayuda deun asa de siembra estril

Siembra en placa por superficie

3.2.2 RECUENTO DE GRMENES POR DILUCIN EN TUBO

DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) DE GERMENES EN UN ALIMENTO El recuento por dilucin proporciona una idea del nmero de organismos vivos presentes en una muestra que son capaces de multiplicarse en un medio lquido determinado. Se elige un medio lquido capaz de mantener el crecimiento de las bacterias que se estn estudiando.Este mtodo se utiliza cuando se sospeche un nmero muy bajo de grmenes.

3.2.2.1 Material

Tres series (o ms) de cinco tubos (cada serie) con el medio de cultivo adecuado, segn microorganismo. Botes de dilucin con 90 mL de agua de peptona al 0.1% y pH= 6.8-7, estril. Material diverso segn el tipo de alimento a analizar.

3.2.2.2 Mtodo

Hacer diluciones del alimento al 1/10. 1/100. 1/1000 o ms si fuera necesario. (ver protocolo de diluciones). Poner 1 mL de la ltima dilucin en cada uno de los tubos de la ltima serie. Hacer lo mismo con las dems diluciones de manera ascendente . Incubar el tiempo necesario y a la temperatura adecuada segn el que queramos investigar. Pasado el tiempo de incubacin hacer la lectura y anotar el nmero de tubos positivos de cada serie. Consultar las tablas de probabilidad con el nmero de tubos positivos, Estos resultados se expresarn como nmero ms probable de microorganismos por gramo o mililitro de alimento.

Ejemplo :

Tubos positivos en la 1 serie (1/10) = 5 Tubos positivos en la 2 serie (1/100) = 5 Tubos positivos en la 3 serie (1/1000) = 4

Lectura en las tablas NMP 5-5-4 = 1600 microorganismos/g o ml

TABLAS DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 1 1 1 2 2 3 0 0 0 0 1 1 1 2 2

0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 0 1

0 2 4 2 4 6 4 6 6 2 4 6 8 4 6 8 6 8

1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3

2 3 3 4 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 0 0

2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1

10 8 10 11 5 7 9 12 7 9 12 9 12 14 12 14 15 8 11

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4

0 1 1 1 1 2 2 2 3 3 4 4 5 0 0 0 0 1 1

2 0 1 2 3 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 3 0 1

13 11 14 17 20 14 17 20 17 20 20 25 25 13 17 20 25 17 20

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 0 0 0 0 0 1

2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 4 0

25 20 25 30 25 35 40 35 40 45 40 50 55 25 30 45 60 75 35

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4

1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2

45 65 85 115 50 70 95 120 150 175 80 110 140 175 200 250 130 170 225

5 5 5 5 5 5 5 5 5

4 4 4 5 5 5 5 5 5

3 4 5 0 1 2 3 4 5

275 350 425 250 350 550 900 1600 mayor 1800

3.2.3 RECUENTO DE GRMENES EN FILTROS DE MEMBRANA

3.2.3.1 Fundamento El recuento de grmenes en filtros de membrana, se basa en la propiedad que tienen estos filtros de permitir el paso rpido de grandes volmenes de soluciones acuosas y de retener las bacterias existentes en stas. Las bacterias retenidas en el filtro pueden cultivarse posteriormente colocando ste sobre un disco de papel absorbente, el cual ha sido saturado con un medio de cultivo lquido. Los nutrientes del medio de cultivo, pasan a travs de los poros de membrana, permitiendo de esta forma, el crecimiento de las bacterias, y la formacin de colonias visibles.Normalmente se utiliza esta tcnica en el anlisis bacteriolgico de aguas y bebidas, y cuando se sospeche un nmero bajo de grmenes.

3.2.3.2 Material

Equipo de filtracin Millipore estril. Bomba de vaco. Filtros de membrana tipo IIA, de 0.45 micrmetros de dimetro de poro, estriles. Placas de Petri y pipetas, estriles. Pinzas. Medo de cultivo segn microorganismo (caldo de triptosa soja, caldo MacConkey, caldo para Enterococos..etc.). Tienen frmulas especiales. Solucin Ringer al 0.25. estril. Estufa a 35-37C.

Filtro de mebrana tipo AII

3.2.3.3 Mtodo

Montar el equipo de filtracin aspticamente. Colocar un filtro de membrana, con la rejilla hacia arriba, entre las dos Poner la muestra en el embudo y conectar la bomba de vaco.

Cuando haya pasado toda la muestra adicionar solucin Ringer al 0.25, con objeto de lavar. Desconectar la bomba de vaco. Poner un disco de papel absorbente en placa de Petri estril y adicionar con una pipeta el medio de cultivo hasta saturacin. Levantar la parte superior del embudo y retirar el filtro aspticamente. Colocar el filtro, con la rejilla hacia arriba, sobre el disco que tiene el medio de cultivo, procurando que no queden bolsas de aire entre ambos. Incubar a 35-37C. Contar las colonias crecidas sobre la superficie del filtro. Expresar el resultado como unidades formadoras de colonia colonias (ufc)/mL.

Equipo de filtracin

3.2.4 VALORACIN TURBIDIMETRICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

3.2.4.1 Fundamento La valoracin turbidimtrica del crecimiento microbiano en un medio de cultivo se basa en que un cultivo bacteriano acta como una suspensin coloidal, bloqueando y reflejando la luz que pasa a travsde l. Por tanto, al aplicar la turbidimetra, es decir la medida del porcentaje de absorcin de luz, a una suspensin bacteriana, se puede estimar el nmero de clulas presentes. La turbidez se suele expresar como densidad ptica (D. O.), la cual es directamente proporcional a la concentracin de clulas.

D. O. = log 100 - log de la lectura en el espectrofotmetro.

3.2.4.2 Elaboracin de la curva patrn, para un determinado microorganismo relacionando la turbidez (D. O.) con el nmero de clulas. 3.2.4.2.1 Material

El necesario para hacer diluciones del cultivo hasta la 10-8 Agar para recuento en placa (cantidad suficiente para sembrar de 10-6, 10-7 y 10-8) Cinco tubos de ensayo con 5 mL de caldo nutritivo estril. Fotocolormetro, pipetas y placas de Petri.

3.2.4.2.2 Mtodo

Hacer un recuento en placa, sembrado de las diluciones 10-6, 10-7 y 10-8 e incubando a la temperatura ptima del microorganismo. Hacer diluciones al 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16 del medio de cultivo en los tubos con caldo nutritivo. El quinto tubo se utilizar despus.

Con el caldo nutritivo del quinto tubo se ajusta el fotocolormetro a 100 por 100 de transmisin. Determinar la densidad ptica del cultivo puro y de las otras cuatro diluciones. Representar en unos ejes de coordenadas las densidades pticas de las diversas diluciones y relacionarlas con el recuento en placa obtenido.

Espectrofotmetro de absorcin molecular