Estacin de Viticultura e Enoloxa de Galicia

Microorganismos en la industria enolgica y su relacin con la calidad del vino

Pilar Blanco Camba

Las levaduras y el vino

CARACTERSTICAS GENERALES Hongos microscpicos unicelulares Clulas eucariotas Morfologa variada: esfricas, elpticas , ovaladas, alargadas, apiculadas Reproduccin vegetativa o asexual por gemacin (algunas por biparticin) Reproduccin sexual. Formacin de esporas Responsables de la fermentacin alcohlica (transformacin de azcar en alcohol +CO2) Alteraciones (flor, refermentaciones)

Organizacin de una clula procariota (A) y eucariota (B)

Principales levaduras vnicas Nombre: Saccharomyces cerevisiae

Caractersticas: Morfologa elpticas u ovoides Alta capacidad fermentativa Formadora de esporas (ascosporas con 4 esporas) No asimila nitratos ni escinde arbutina Crecimiento en presencia de etanol Fermenta y asimila glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa y rafinosa. No fermenta ni asimila lactosa

Principales levaduras vnicas

Nombre:

Kloeckera apiculata Hanseniaspora guillermondii

Morfologa: apiculadas (forma de limn) Aparece al inicio de la fermentacin Fermenta la glucosa Bajo poder fermentativo (4%) Fuerte produccin de cidos voltiles No esporula (Hanseniaspora si esporula) No asimila nitratos No escinde la arbutina

Principales levaduras vnicas

Nombre: Metschnikowia pulcherrima Morfologa: clulas ovoides aisladas o en parejas. A veces clulas grandes con un grueso grnulo central de grasa. Fermenta la glucosa Bajo poder fermentativo (1%) No asimila nitratos Escinde la arbutina Crece bien en presencia de alcohol No esporula En placa colonias blancas, brillantes con ligera coloracin rojiza

Principales levaduras vnicas Nombre: Schizosaccharomyces pombe

Morfologa : Clulas alargada o cilndricas aisladas o en parejas (3-5 X 6-16) m Divisin por fisin Esporulada No asimila nitratos ni escinde la arbutina Buena capacidad fermentativa Capacidad para degradar cido mlico a etanol y CO2 (fermentacin maloalcohlica)

Otras levaduras vnicas

Brettanomyces Torulaspora Cryptococcus Debaryomyces hansenii Rhodotorula Levaduras formadoras de velo Saccharomyces (flor) Candida Pichia Hansnula Zygosaccharomyces Debaryomyces hansenii

Requerimientos nutricionales de las levaduras Fuente de carbono: azcares Fuente de nitrgeno Sustancias minerales Factores de crecimiento (vitaminas)

El mosto rene los requisitos adecuados para el desarrollo de las levaduras (Excepciones: maduracin inadecuada, el ataque por botritisfalta de nitrgeno, etc). pH cido-impide el desarrollo de muchas bacterias

Origen de las levaduras de vinificacin Uva (flora epiftica)

Material de bodega

Inculo (LSA)

Sucesin de la poblacin de levaduras a lo largo de la fermentacin

Fase inicial Predominio de levaduras apiculadas y de otras morfologas con baja produccin de alcohol y elevada produccin de cidos voltiles (actico) Ex: Kloeckera apiculata, Metschnikowia pulcherrima, Candida sp,etc. Fase tumultuosa Saccharomyces invade el medio, acaba dominando la fermentacin y desaparecen las levaduras de la fase inicial Fase final Predominio de especies del gnero Saccharomyces. Produce ms alcohol y menos productos secundarios

Albario
1150 1100

Densidad

1050 1000 950 900 1 3 5 7 9 11 13 15

Tiempo (das)

Evolucin de la poblacin de levaduras viables durante la fermentacin

10,00 9,00

Log NLV

Fase inicial :

104-105 107-108

8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 0 5 10 15 Tiempo (das)

Fase tumultuosa: Fase final: 105

La fermentacin alcohlica Glucolisis

Glucosa

Acido pirvico

Piruvato descarboxilasa CO2 Acetaldehido Alcohol deshidrogenasa Etanol

NADH2 NAD+

Fermentacin alcohlica: Influencia del temperatura y O2

Rango de Temperatura para fermentacin en blancos: 14-20C Rango para fermentacin en tintos: 25-30C Temperatura crtica >35C
TREIXADURA
1120 1100 1080 1060 1040 1020 1000 980 0 10 20 nTT16 nTT19 nTT22

Densidad

Tiempo (Das)

O2: Las levaduras requieren O2 para su multiplicacin ya que interviene en la sntesis de AG y esteroles, constituyentes de la membrana celular y responsables de su permeabilidad (prctica de remontado)

Productos secundarios originados durante la fermentacin alcohlica

Glicerina suavidad y aterciopelado Fermentacin gliceropirvica glucosa Glicerina + pirvico

Succnico- es el cido que ms impresiona el gusto (sabor a bebida fermentada, entre salado y amargo) cidos orgnicos (mlico, ctrico, lctico, cidos voltiles Actico y su ster, acetato de etilo- producido por las levaduras de la 1 fase y levaduras oxidativas. Efecto negativo sobre el vino Metabolitos del ciclo diacetilo-acetonico (a concentraciones elevadas son negativos)

BACTERIAS LCTICAS
Gram +, catalasa -, no esporuladas, no mviles Divisin por biparticin Microaerfilas o anaerobias facultativas y fermentadoras de azcares Morfologa: cocos y bacilos Segn el metabolismo de la glucosa pueden ser: -Homofermentativas- c. lctico -Heterofermentativas-c. lctico, actico, CO2 , etanol, acetaldehido, acetona, diacetilo,etc Responsables de la fermentacin malolctica Bajo ciertas condiciones pueden causar alteraciones Metabolismo de aminoacidos-origina sustancias peligrosas para la salud
Oenococcus oeni

BACTERIAS LCTICAS

aldolasa

Metabolismo homofermentativo de la glucosa (va glucoltica de Embden-Meyerhof)

BACTERIAS LCTICAS

Metabolismo heterofermentativo de la glucosa (ruta de Warburg-Dickens)

Clasificacin de las bacterias lcticas

Forma Cocos Gnero Pediococcus Leuconostoc Metabolismo de la glucosa Homofermentativos Heterofermentativos Especies
P. damnosus P. pentosaceous L. oeni (O.oeni) L. mesenteroides (ssp. mesenteroides)
No descritas en vino

Bacilos

Lactobacillus I. Homofermentativos estrictos

(No fermentan pentosas Glucosa- 2 c. Lctico)

II. Heterofermentativ. facultativos

(Fermenta las pentosas y la glucosa)

L. casei L. plantarum

II. Heterofermentativ. obligatorios

(No poseen el enzima aldolasa, fermentan la glucosa mediante la va de las pentosa fosfato)

L. brevis L. hilgardii

Caractersticas de los principales gneros de bacterias lcticas

Caracterstica Morfologa de las clulas Leuconostoc Esfricas o un poco alargadas En pares o en cadenas 0,5-0,7 m Pediococcus Esfricas Divisin en dos planos-ttradas 1-2 m DL L lctico No carbnico No 34-42% Sin cido teicoico Lactobacillus Alargadas en pares e en cadenas 0,5-1,2 X 1,0-10 m lctico, etanol, actico, CO2 No 36-47% Algunas sp contienen cidos teicoicos

Tamao

Metabolismo de CO2, lctico, la glucosa etanol Hidrlisis de la arginina (G+C)% Pared celular Algunas cepas 38-44% Sin cido teicoico

BACTERIAS LCTICAS: ecologa

Origen Uva Material de bodega Inculo (Cultivos iniciadores de Oenococcus oeni. Se trata de cultivos puros o mezclas de 2-3 cepas) Evolucin durante la fermentacin En uva- poblacin muy baja Mosto- 102-104 UCF/ml. Disminuyen por proliferacin de las levaduras durante la fermentacin alcohlica Fase final Empieza a aumentar la poblacin de bacterias lcticas (lisis de las levaduras), desaparecen los bacilos homofermentativos, luego los heterofermentativos y acaba predominando O. oeni, mejor adaptado a las condiciones de bajo pH y elevada concentracin de etanol La fermentacin malolctica se inicia cuando las UFC/ml= 106

FERMENTACIN MALOLCTICA
Mlico Enzima malolctica (Bacterias lcticas) Lctico + CO2

Repercusiones en el vino
Desadificacin biolgica del vino Disminuye la acidez total y el mlico (sabor astringente) Aumenta el cido lctico (suavidad) Protege al vino de las enfermedades por bacterias lcticas Otras: Produccin de diacetilo (aroma a mantequilla) A bajas concentraciones bouquet A elevadas concentraciones - rancio

Posibles rutas del cido mlico

BACTERIAS LCTICAS: fermentacin malolctica

Factores que influyen en la fermentacin malolctica Caractersticas de la variedad (relacin tartrico/mlico), residuos fitosanitarios pH del medio (Actan mejor a pH> 3.5; T ptima 4.2-4.5). El pH condiciona el crecimiento bacteriano y los sustratos que van a metabolizar (*enfermedades del vino). A mayor pH mayor facilidad para que se desarrolle la FML pero tambin mayor peligro de que aparezcan enfermedades. temperatura (19-25) Aireacin (la presencia de una pequea proporcin de O2 es favorable) Etanol (< 13%) SO2 (no superior a 50 mg/L) Prcticas de vinificacin (El tiempo de contacto del vino con los hollejos, contacto con las las, trasiegos, etc. determinan la poblacin de bacterias lcticas al final de la fermentacin alcohlica) Interaccin de las bacterias con otros microorganismos

BACTERIAS LCTICAS: fermentacin malolctica Aplicacin de la fermentacin malolctica

En tintos Mejora gustativa Color menos rojo vivo Aroma evolucionado (menos a uva y ms a vinosidad) En blancos Puede ser deseable: Repercute en el equilibrio grado/acidez Disminuye la sensacin de dureza y verdor Peligroso en vino dulce

BACTERIAS LCTICAS: fermentacin malolctica

Ventajas e inconvenientes de la fermentacin malolctica

Ventajas
Reduccin de la acidez y suavizacin organolptica Garanta de estabilidad Incremento aromtico Reduccin de amargor y astringencia Mayor complejidad y atributos de envejecimiento

Inconvenientes
Reduccin del color Reduccin de aromas varietales Incremento de acidez voltil Aparicin de olores y sabores anmalos Formacin de aminas bigenas y carbamato de etilo

Metabolismo del ctrico

Bacterias acticas
Gram negativas, Catalasa positivas, no esporuladas Morfologa variable (clulas elpticas o con forma de bastn corto agrupadas en pares o en cadenas) Tamao: 0.6-0.8 x 1-4 m Inmviles o mviles por flagelos: polares (G. Gluconobacter) peritricos (G. Acetobacter) Aerobias estrictas*(sobrevive en barrica) Oxidan el alcohol a cido actico e incluso a CO2 y H2O Produccin de polisacridos extracelulares filtrabilidad del vino) y pigmentos Formacin de velo En el vino pueden dar lugar al picado actico y su desarrollo es indeseable en todas las etapas de vinificacin (celulosa-afecta la

Tolerancia a la acidez, al etanol y moderada al SO2

Bacterias acticas
ECOLOGA DE LAS BACTERIAS ACTICAS Muy extendidas en la naturaleza, especialmente en bebidas fermentadas alcohlicas como el vino, la cerveza o la sidra En uva la poblacin de bacterias acticas depende del estado sanitario de la vendimia. En uva sana: 102-103 UFC/mL (G. oxydans) En uva atacada por Botrytis: 105-106 (mezcla de Guconobacter y Acetobacter) Durante la fermentacin alcohlica la adicin de sulfuroso y el desarrollo de las levaduras no afecta la poblacin de bacterias acticas. Existe una sucesin de bacterias acticas: G. oxydans predomina al inicio y va siendo reemplazado por A. pasteurianus y A. aceti. Durante la fermentacin malolctica se mantiene la poblacin Durante la conservacin la poblacin de bacterias acticas puede aumentar y causar enfermedades.

Clasificacin de las bacterias acticas

Caracterstica Flagelacin Crecimiento a pH 4.5 Oxidacin de etanol a actico Oxidacin de actico hasta CO2 (G+C)% Especies Gluconobacter polar + + 56-64 G. oxydans Acetobacter peritrica + + + 53-65 A. aceti A. pasteurianus A. liquefaciens A. hansenii

Metabolismo de las bacterias acticas

Oxidacin del etanol a cido actico (Gluconobacter y Acetobacter) etanol
Alcohol deshidrogenasa

acetaldehido
Aldehido deshidrogenasa

cido actico

Oxidacin del cido actico a CO2 (Acetobacter) cido actico TCA CO2+H2O

*Gluconobacter carece de algunos enzimas del TCA, la -cetoglutarato deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa

Metabolismo de las bacterias acticas

Metabolismo de los azcares Oxidacin de los azcares va hexosas monofosfato Oxidacin de azcares a cetonas Glucosa cido 2-5 dicetoglucnico Fructosa-cetofructosa Xylosa-cetoxylosa Metabolismo del cido lctico Oxidacin a pirvico, acetaldehido y actico Metabolismo del glicerol Oxidacin a dihidroxiacetona

ALTERACIONES DEL VINO DE ORIGEN MICROBIANO

Introduccin Alteraciones microbianas Bacterias lcticas Picado lctico Amargor Vuelta Grasa o ahilado Bacterias del cido actico: Picado actico Levaduras Flor Refermentaciones Brettanomyces Sustancias txicas de origen microbiano

INTRODUCCIN
Las alteraciones microbianas del vino pueden aparecer durante la elaboracin y/o durante la conservacin del vino Se producen por el ataque de componentes del vino y/o formacin de sustancias indeseables Evidencias: Turbidez, Gas, Transformacin del color Factores a favor: Composicin del vino (cidos orgnicos, azcares, factores de crecimiento y sales minerales) Factores en contra: Grado alcohlico elevado pH bajo Baja temperatura

Las bacterias lcticas

Producen alteraciones graves porque atacan la totalidad de la masa del vino aunque haya sido bien elaborado Microaerfilos o anaerobios facultativos Importancia de la higiene en la bodega Alteraciones producidas Picado lctico- fermentacin de azcares residuales Amargor- fermentacin del glicerol Vuelta fermentacin del tartrico Grasa o ahilado formacin de polisacridos en el vino

Bacterias lcticas: PICADO LCTICO PICADO LCTICO

Fermentacin de azcares residuales con formacin de actico y lctico Puede aparecer en vinos con azcares residuales por cese de la fermentacin alcohlica (Ex. Por altas temperaturas) Efecto en el vino: sabor agridulce (por el actico y el azcar) y aumento de la acidez voltil Tambin tiene lugar la fermentacin mantica formacin de manitol a partir de fructosa (Vuelta mantica) Prevenir las paradas fermentativas y envasado apropiado, sulfitado racional control de la temperatura

Bacterias lcticas: AMARGOR AMARGOR

Fermentacin del glicerol formando lactico, actico, cidos grasos y acrolena (reacciona con compuestos fenlicos como los taninos dando sabores amargos) Efecto en el vino: sabor amargo Muy rara, aparece e casos de mala cosecha Afecta a vinos con poco grado y pH bajo (3.2-3.3); La fermentacin de tartrico (vuelta) afecta a vinos de pH alto (3.5-3.3)

Bacterias lcticas: VUELTA VUELTA

Origen: Fermentacin del cido tartrico para dar lctico, actico y CO2 Efecto en el vino: No apto para el consumo Disminuye la acidez fija y aumenta la acidez voltil y el pH Pierde sabor (inspido, flojo) Color apagado Turbidez Formacin de gas, vino con aguja olor a ratn (vuelta + otras causas-formacin de 2acetiltetrahidroxipridina ) Ataca a vinos poco cidos, los mejores vinos son los ms propensos No suele darse.

Bacterias lcticas: GRASA GRASA O AHILADO

Causa: formacin de polisacridos en el vino que le dan aspecto oleoso. Efectos en el vino: aspecto de aceite, vino pesado que se desliza sin ruido. La acidez voltil no siempre es elevada. Peligro: puede ir seguido de otras alteraciones Prevencin: empleo racional de sulfuroso que no impida la Fermentacin Malolctica pero s la formacin de grasa Correccin: con sulfuroso y agitado

Bacterias lcticas: Otras alteraciones Alteracin

Olor a mantequilla Olor a ratn Olor a geranio Formacin de aminas bigenas Formacin de carbamato de etilo

Causa
Produccin de diacetilo a partir del ctrico o del piruvato Formacin de 2-acetil-tetrahidropiridina Formacin de 2-etoxi-3,5-hexadieno a partir del cido srbico Metabolismo de los aminocidos del mosto Metabolismo de la arginina

Bacterias acticas: PICADO ACTICO

PICADO ACTICO O AVINAGRAMIENTO Oxidacin del alcohol a cido actico- Necesitan O2 Causado por las bacterias acticas o del vinagre que constituyen parte de la microflora de la uva y pernanecen durante todo el procesado. Desaparecen tras el embotellado por las condiciones de anaerobiosis Picado- inicio del proceso , solo afecta a las capas superficiales Avinagramiento- afecta a ms volumen Efecto en el vino: En cata- olor a acetaldehido Enturbiamento y formacin de velo Aumento de la acidez voltil (Mxima permitida 0,65 g/L) Producen actico (retrogusto, final de boca spero y agrio) y acetato de etilo (indicativo de mala calidad)

Bacterias acticas: PICADO ACTICO

Enfermedad muy corriente, perjudicial y difcil de corregir Prevencin: Relleno de los depsitos y cierre hermtico Evitar trasiegos en perodos clidos (la elevada temperatura aumenta la probabilidad de picado actico) Sulfitado a dosis adecuadas (25-30 mg/l) Higiene de la bodega y los depsitos Aparece con mayor frecuencia en uvas atacadas con Botritis

LEVADURAS: Flor FLOR

Enmohecimiento de la superficie del vino, velo Causado por levaduras que requieren O2 Candida mycoderma Pichia membranifaciens Hansenula anmala Zygosaccharomyces Crecen en vino con alcohol < 13 y no tienen capacidad fermentativa Saccharomyces-flor til para crianza biolgica de los vinos Diferenciacin: morfologa al microscopio, aspecto del velo, capacidad fermentativa

LEVADURAS: Flor

Caracterstica
Observacin a microscopio (forma y agrupacin) Aspecto del velo

Levaduras de velo
Clulas cilndricas, alargadas. A veces forman cadenas ramificadas Velo delgado, blanco o grisaceo, liso o poco plegado

Saccharomyces Flor
Clulas elpticas-ovoides En parejas o flculos Velo grueso, color crema y rugoso

Capacidad fermentativa

Nula o muy baja. En mosto Buena. En mosto dan forman velo turbidez y carbnico

LEVADURAS: Flor
Efectos en el vino: Disminuye la acidez fija y voltil Disminuye el alcohol en caso exagerado da lugar a un sabor soso u acuoso del vino y origina turbidez La aparicin de flor no es grave Recomendaciones para su prevencin: Filtracin amicrbica Cerrar bien los depsitos Sulfitado adecuado

LEVADURAS: Refermentaciones
Refermentaciones Provocan enturbiamiento y formacin de gas No se forma velo Causadas por Saccharomyces, va anaerobia Ocurren cuando hay azcares residuales (<2 g/L) Control microbiolgico: observacin directa a microscopio En vinos con pocos azcares residuales puede aparecer sedimentos en el fondo de la botella. Metabolismo de otros componentes del vino.

LEVADURAS: Brettanomyces
Brettanomyces (forma asexual)/Dekkera (esporgena) Frecuente en barrica y vinos de crianza (rara en uva y fermentacin) Se desarrolla en vinos de elevado grado alcohlico con o sin azcares Especie ms frecuente: Brettanomyces bruxellensis Origina fenoles voltiles p-cumrico
descarboxilasa

4-vinil-fenol

4-etil-fenol

VPR
4-vinil-guayacol 4-etil-guayacol

p-ferlico
*VRP-vinil fenol reductasa

LEVADURAS: Brettanomyces
Afecta las caractersticas organolptica del vino Defectos causados por Brettanomyces: Olores fenlicos (cuero, sudor de caballo) *Debido al metabolismo de bacterias y levaduras 4-etil-fenol: bajo contenido- complejidad Alto contenido-defecto Gusto a ratn (ms raro)- derivados de la tetrahidropirina. *Tambin originados por bacterias lcticas Lactobacillus y Pediococcus Produccin de aminas bigenas Puede causar acidez voltil elevada Prevencin: limpieza y desinfeccin de las barricas

Sustancias txicas de origen microbiano Origen de sustancias txicas en el vino Contaminantes (fungicidas, pesticidas, etc) Aditivos (SO2) Metabolismo microbiano Etanol Metanol Aminas bigenas (descarboxilacin de aminocidos) Carbamato de etilo (Metabolismo de la arginina) Ocratoxina A Peligrosas para la salud humana

Aminas bigenas
Se originan por descarboxilacin de los aminocidos Principales aminas bigenas en el vino: Histidina-Histamina Ornitina-Putrescina (diaminobutano) Tirosina-Tiramina Etilamina Feniletilamina Cadaverina Origen de las aminas bigenas: Bacterias lcticas Levaduras

Aminas bigenas Efectos sobre la salud: Dolor de cabeza Problemas respiratorios Problemas de corazn (Palpitaciones) Hipertensin, hipotensin Cuadros de alergia La sensibilidad a estos compuestos depende de cada individuo y puede alterarse con el consumo de alcohol y/o drogas. La histamina es la ms txica.

Aminas bigenas: papel de las bacterias lcticas

Histamina, tiramina y putrescina son las principales aminas bigenas presentes en el vino. Baja concentracin despus de la F. Alcohlica El contenido aumenta durante la FML El contenido de aminas en vino vara de unas zonas a otras Depende de la microflora (vara con la cepa bacteriana) y de la presencia de aminocidos en el vino (composicin del mosto, metabolismo levaduras, prcticas enolgicas-contacto con las las) La microflora es ms compleja cuanto ms alto es el pH Pedioccocus, Oenoccocus, Lactobacillus , La descarboxilacin de aminocidos tiene lugar en condiciones de estrs, como va alternativa para obtencin de energa

Carbamato de etilo
Se forma en el vino por reaccin entre: Etanol+compuesto carbamlico El precursor en el vino es la urea que procede del metabolismo de la arginina, relacionado con la actividad arginasa de las cepas de levaduras que conducen la fermentacin. Las bacterias lcticas tambin degradan la arginina Tambin se forma urea a partir de la degradacin de cidos nucleicos o de componentes de la uva Prevencin Limitar el contenido de nitrgeno en los mostos (evitar abonos nitrogenados y terrenos muy frtiles) Limitar activadores de fermentacin y controlar las levaduras utilizadas Control de la temperatura durante las fermentaciones Eliminacin de la urea con ureasa cida Baja acidez y alta temperatura inducen aumento de carbamato de etilo

Alteraciones causadas por mohos

Los mohos atacan el grano de uva, especialmente durante la maduracin Botrytis cinerea, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Cladosporium, otros Efectos causados en el mosto y/o vino: Reduccin de la cosecha Afecta el contenido de nitrgeno
Aspergillus niger

Presencia de enzimas como la lacasa (oxidasas)-quiebra oxidsica Alteraciones organolpticas Afecta la estabilidad fisico-qumica del vino Olor y sabor a moho
Penicillium citroviride

Ocratoxina A
Micotoxina producida por sp de Aspergillus y Penicillium (A. ochraceous, P. verrucosum, A. carbonarum) Efectos sobre la salud: Persistencia en sangre- 35 das Nefrotxico Cancergeno (Grupo 2B-IARC International Agency for Research on Cancer Nivel tolerado establecido OMS: 100 ng/Kg peso y semana (1995); 5 ng/Kg dia (1998). Contenido mximo en vinos para el 2005 (2g/L). (Propuesto en la 82 asamblea de la OIV) Deteccin : ELISA HPLC Incidencia: Mayor en los pases calidos, mediterrneos que en zonas fras Mayor en vinos tintos que blancos

Ocratoxina A
Presencia de Ocratoxina A en mostos y vino

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS EN ENOLOGA Toma de muestras Tratamiento de las muestras Siembra en medios de cultivo adecuados Recuento de clulas viables Aislamiento de microorganismos en cultivo puro Identificacin de los microorganismos aislados

Controles microbiolgicos: Toma de muestras

Via (de uva, suelo, madera...) Bodega (suelo, paredes, material de bodega, agua...) Mosto (antes y despus de sulfitar) Fermentacin (diariamente o en las distintas fases) Vino (despus de la estabilizacin, clarificacin, filtrado, embotellado...) NOTA: Utilizar un recipiente estril y manipular todo lo ms aspticamente posible

Tratamiento de las muestras Uva-Incubacin en medio lquido apropiado durante 1h y siembra en placa para el recuento de clulas Mosto- Recuento al microscopio y clculo de la dilucin adecuada para siembra en placa y recuento de clulas Muestras de fermentacin-Recuento, dilucin apropiada y siembra Vino-filtracin

Recuento del n de clulas viables por mL

Medios de cultivo
Generales (YEPD, Agar mosto, WL) Selectivos- suplementados con compuestos que inhiben el crecimiento de los distintos grupos microbiano Bacterias-antibiticos como el cloranfenicol Bacterias lcticas- estreptomicina, penicilina, nisina Levaduras-cicloheximida, pimaricina Hongos- propionato sdico Microorganismos viables, no cultivables (Seguimiento mediante microscopa con epifluorescencia) Conservacin de las cepas (a -80C) Bacterias: (medio de cultivo+ 40% glicerol) Levaduras: YEPD+15% glicerol

Aislamiento de levaduras
Toma de muestras Uva Mosto (sulfitado y sin sulfitar) Fermentacin
Fase inicial Fase tumultuosa Fase lenta o final

Recuento y dilucin adecuada de la muestra Siembra en un medio de cultivo (suplementado con un inhibidor de crecimiento bacteriano y de hongos)
YEPD Agar malta Agar Mosto WL nutrient agar

Aislamiento en cultivo puro y conservacin

Aislamiento: YEPD // Conservacin: YEPD+15% glicerol

Identificacin de levaduras
Pruebas de identificacin: Morfolgicas (en placa, medio lquido y al microscopio) Esporulacin Fisiolgicas y Bioqumicas (dependen del estado fisiolgico y del medio de cultivo) Asimilacin y fermentacin de azcares Asimilacin de compuestos nitrogenados Produccin de enzimas Requerimiento de factores de crecimiento Resistencia a cicloheximida,etc

Identificacin de levaduras
Pruebas de biologa molecular: Anlisis del cariotipo Anlisis de DNA mitocondrial Secuenciacin y anlisis de restriccin del rDNA PCR Mtodos rpidos de deteccin y cuantificacin: (Especialmente tiles para microorganismos de crecimiento lento o para clulas viables pero no cultivables) Bioluminiscencia: (actividad metablica; Ex. luciferasa) Epifluorescencia: (tincin con un colorante fluorescente, Ex. Naranja de acridina) PCR a tiempo real: seguimiento de mRNA mediante RTPCR Hibridacin in situ con sondas especficas marcadas con un fluorocromo

Anlisis del cariotipo

Mediante electroforesis de campo pulsante Detecta polimorfismo del DNA genmico Diferenciacin entre especies y cepas, mediante diferencias de nmero y tamao de los cromosomas (S. cerevisiae- 16 cromosomas de tamao entre 250 y 2500 Kpb) Equipamiento especfico, costoso y largo Requiere personal especializado y cepas aisladas Ms discriminante que la tcnica de PCR y DNA mitocondrial
Schuller et al. 2003

Anlisis del DNA mitocondrial

Anlisis del polimorfismo del DNA mitocondrial (muy polimorfo y estable) Requiere poca infraestructura de laboratorio Relativamente rpida y econmica Diferenciacin entre especies Diferenciacin entre cepas de S. cerevisiae Requiere cepas aisladas y personal especializado
EVEGA 2004

Anlisis de restriccin del rDNA

Implica la comparacin de secuencias de genes que codifican el rRNA y de los espaciadores entre ellos (ITS Comparacin de secuencias Comparacin de fragmentos de restriccin (PCR-RFLP) Requiere previa amplificacin mediante PCR

PCR
Amplificacin de secuencias especficas utilizando un termociclador Equipamiento costoso, personal especializado Tcnica rpida que permite actuar en caso de necesidad Seguimiento de implantacin de levaduras inoculadas en fermentacin (Permite diferenciar LSA)
Schuller etal. 2003

RAPDs- amplificacin de regiones genomicas al azar utilizando primers cortos e inespecficos (poco reproducible) ITS Amplificacin de secuencias delta- flanquean el retrotransposn Ty

Aislamiento e identificacin de Brettanomyces

Filtracin de la muestra Siembra en un medio especfico (crecimiento lento, en medios convencionales las otras levaduras crecen ms rpido) Medio DBDM Crecimiento 25 C, 2 semanas Identificacin : mtodos convencionales Mtodos moleculares: PCR, hibridacin in situ con fluorescencia, PCR a tiempo real

Aislamiento e identificacin de bacterias acticas

Medios de cultivo Suplementados con inhibidor del crecimiento de levaduras y de bacterias lcticas WL+ 2% etanol ( 10% de vino estril). Colonias color verde GYC (Glucosa 5%, extracto de levadura 1%, , CaCO3 3%, agar %) Mannitol medium (manitol 2,5%, extracto de levadura 1%, agar 1,5%) MRS + 2% etanol Temperatura de incubacin: 25-28 C (5-7 das) Condiciones aerbicas

Aislamiento e identificacin de bacterias acticas

Pruebas de identificacin Gram +, Catalasa Oxidacin del etanol, glicerol y lactato Formacin de compuestos cetnicos Crecimiento en acetato sdico o etanol como nica fuente de carbono Crecimiento en dulcitol Produccin de pigmentos marrones en GYC Produccin de celulosa (filtrabilidad del vino) Mtodos moleculares (PCR y secuenciacin de rRNA 16S)

Aislamiento e identificacin de bacterias lcticas

AISLAMIENTO Medios de Cultivo AGB (acidic grape broth, pH4,8) (O. oeni) MRS Incubacin en estufa de anerobiosis Temperatura y tiempo de incubacin. 30 durante 48 h Pruebas de Identificacin Gram + Morfologa (coco o bacilo) Homofermentativa o heterofermentativa Fermentacin de azcares Crecimiento en determinadas condiciones de pH, T Tcnicas moleculares PCR especfica (primers del gen-enzima malolctica) (O. oeni)

Aislamiento e identificacin de bacterias lcticas

Caractersticas identificativas de Oenoccocus oeni

Control microbiolgico de vinos embotellados

Filtracin de una cantidad de vino conocida utilizando un sistema adecuado Colocacin de la membrana en un medio de cultivo adecuado Crecimiento a temperatura adecuada Recuento de microorganismos viables presentes en la muestras Identificacin de los microorganismos encontrados Evaluacin del riesgo

Como prevenir las enfermedades microbianas de los vinos Mantener unas condiciones higinicas adecuadas en la bodega Procurar que la uva entre en buenas condiciones Evitar paradas fermentativas procurando obtener vinos con una concentracin de azcar < 2g/l Sulfitado adecuado (25-30 mg/L) Conservacin adecuada: Mantener los depsitos llenos y cerrados y a baja temperatura Filtracin amicrbica de los vinos antes del embotellado

Seleccin de levaduras y bacterias en enologa

Papel en la calidad del vino Bacterias Criterios de seleccin Uso de bacterias seleccionadas Levaduras Criterios de seleccin Levaduras seleccionadas Levaduras autctonas: ventajas e inconvenientes

Seleccin de bacterias
Caractersticas deseables para cultivos iniciadores de bacterias lcticas Elevada degradacin de cido L-mlico Resistencia a grado alcohlico elevado (en torno al 15%) Resistencia a SO2 (a concentracin 50 mg/L) Capacidad de crecimiento a bajo pH (Resistencia a la acidez) Capacidad de crecimiento a bajas temperaturas Baja produccin de acidez voltil Buenas propiedades organolpticas (ausencia de caracteres sensoriales -) Metabolismo limitado de azcares Resistencia al ataque de bacteriofagos No produccin de polisacridos extracelulares No produccin de compuestos txicos (Ej: aminas bigenas) Fcil obtencin de biomasa y resistencia a los procesos de congelacin y liofilizacin

Seleccin de bacterias
Obtencin de cultivos iniciadores de bacterias Obtencin de biomasa, centrifugado y liofilizacin Utilizacin de bacterias comerciales Siembra directa o con rehidratacin y/o reactivacin Control de calidad de las cepas comerciales Caracterizacin de la especie Viabilidad (UFC/g) Determinacin de la actividad malolctica Verificacin de la ausencia de contaminantes (coliformes, estreptococos, sulfitoreductores, leavduras y mohos) Verificacin de caracteres fisiolgicos sobre medios sintticos y vinos Verificacin de la ausencia de fagos previa

Seleccin de levaduras autctonas

Criterios generales: Ser autctona Buena capacidad fermentativa (rpido arranque y acabado) Alta produccin de etanol y regularidad fermentativa Alta tolerancia al etanol Produccin baja de acidez voltil No formacin de espuma Resistencia a sulfuroso Baja produccin de sulfhdrico Otras: fenotipo killer

Seleccin de levaduras autctonas

Levaduras seleccionadas para elaboracin de blancos Tolerancia a bajas temperaturas Potenciacin de aromas varietales y expresin de aromas secundarios Capacidad de acidificacin y desacidificacin biolgica Crecimiento disperso en medio lquido Levaduras seleccionadas para tintos Alta produccin de acetaldehido y pirvico-estabilizacin del color Baja capacidad de adsorcin de antocianos a la PC Produccin de glicerol- suavidad Degradacin del cido mlico

Seleccin de levaduras autctonas Uso de levaduras comerciales (LSA)

Ventajas Calidad ms uniforme, garantiza repetitividad Ayuda a resolver problemas de posible arranque, ralentizacin o paradas de fermentacin Homogeneidad en los vinos Inconvenientes Prdida de complejidad en el vino final No son propias de la regin Pueden no implantarse por competencia entre las levaduras presentes en el mosto

Seleccin de levaduras autctonas

Ventajas de las levaduras autctonas Especficas del rea Totalmente adaptadas a las condiciones climticas de la zona Totalmente adaptada al tipo de mosto Responsables de caractersticas nicas de los vinos (tipicidad)

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