PRCTICA # 2 TCNICAS DE TINCIN Objetivo El alumno aprender y aplicar las tcnicas bsicas de tincin ms frecuentes.

Generalidades La coloracin es el proceso de teir artificialmente los microorganismos con colorantes o reactivos para facilitar su estudio microscpico forma, agrupacin y estructuras !n colorante es un compuesto orgnico "ue consta de anillos bencnicos y grupos cromforos # agrupacin de tomos "ue da color a ciertos compuestos y au$ocromos # sustituyentes como el grupo o$idrilo o el amino "ue mejoran las caracter%sticas de absorcin del cromforo En el laboratorio de microbiolog%a se pueden usar los colorantes de varias formas como& a 'ara teir bacterias y (acerlas visibles al microscopio b 'ara mostrar estructuras del organismo estudiado. c 'ara la identificacin de microorganismos en base a sus caracter%sticas de tincin, por ejemplo, si son o no alco(ol)cido resistentes, si son Gram positivas o Gram negativas. d En los medios de cultivo para in(ibir el desarrollo de algunas bacterias y as% poder estudiar selectivamente a los microorganismos "ue si crecen. *+,-+., /E 01-*E2+13 La clula bacteriana intacta se tie fcilmente con colorantes bsicos como el cristal, a4ul de metileno y fucsina bsica, pero relativamente mal con colorantes cidos como la eosina. !n colorante bsico es a"uel constituido por un agrupamiento de tomos orgnicos con carga positiva "ue ser la parte activa del colorante ya "ue tendr afinidad por los cidos nucleicos. !n colorante cido es a"uel "ue se encuentra constituido por tomos orgnicos con carga neta negativa por lo cual tiene afinidad por el citoplasma. *+'O3 /E *+,-+., 5. *incin simple. -onocida con ese nombre ya "ue solo nos sirve para (acer ms fcilmente visibles a las bacterias sin resaltar ninguna caracter%stica en especial. !na tincin simple se lleva a cabo cubriendo con colorante bsico un frotis seco y fijado al calor. El frotis se deja reaccionar con las clulas por un minuto y se lava suavemente con agua. El frotis se puede dejar secar o usar papel secante para "ue "uede listo para observarse. 6. *incin negativa. Este mtodo de tincin utili4a colorantes neutros o cidos ya "ue tienen poca afinidad por la clula bacteriana por lo tanto como no se absorben se colorea el fondo en el "ue estn las bacterias pero la clula "ueda incolora y transparente, as% pues las bacterias aparecen como pe"ueas reas iluminadas en un fondo oscuro. La tincin ac%dica con nigrosina, o neutral # con tinta c(ina son las ms usadas.

7. *incin diferencial. Las bacterias se diferencian unas de otras tanto f%sica como "u%micamente, por lo cual su reaccin ante algunos colorantes tambin ser diferente dando lugar as% a grupos tintoreales caracter%sticos. Entre estos grupos estn los "ue se originan por la tincin descubierta por 8ans -(ristian Gram, esta tincin divide a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas lo cual no solo sirve para diferenciarlas sino a9n para elegir la terapia adecuada en algunos casos. E$isten otras tinciones diferenciales de utilidad en microbiolog%a cl%nica como la de :ie(l) ,eelsen. ;. *incin estructural. E$isten diferentes tipos de colorantes "ue de acuerdo a su afinidad se utili4an para teir y detectar ciertas estructuras de la clula bacteriana como son las esporas, los flagelos y las cpsulas. TINCIN SIMPLE <1*E2+1L 6 portaobjetos 1sa bacteriolgica 1ceite de inmersin <icroscopio <ec(ero 14ul de metileno de L=effler -epa de Escherichia coli *>-,+-1 5. 'reparar un frotis de E. coli de acuerdo a las indicaciones de la figura 5 y fijarlo al calor. 6. -ubrir el frotis con a4ul de metileno y dejar en reposo por un minuto. 7. Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar. ;. Observar con el objetivo de inmersin. TINCIN NEGATIVA <1*E2+1L ? E@!+'O ; portaobjetos 1sa bacteriolgica 1ceite de inmersin <icroscopio Aaso de precipitado de 6BB ml con fenol al CD ,igrosina o tinta c(ina 'uente de tincin -epa de Klebsiella pneumoniae *>-,+-1 5. 8acer una suspensin ligera en solucin salina de K. pneumoniae y me4clar una gota de esta suspensin con una pe"uea gota de nigrosina o tinta c(ina en el borde central del portaobjetos. 6. -on el e$tremo de otro portaobjetos e$tender la gota a lo anc(o del primer portaobjetos. 'repare un frotis delgado y otro grueso. 7. /eje secar al aire. ,O 3E /E0E E+F12 1L -1LO2. ;. Observe con el objetivo de inmersin.

TINCIN DE GRAM <1*E2+1L ? E@!+'O 7 portaobjetos 1sa bacteriolgica 1ceite de inmersin <icroscopio <ec(ero 'uente de tincin -epas de Gram negativos # Escherichia coli) y de Gram positivos #Staphylococcus aureus). -ristal violeta ?odo de Gram Etanol al GCD 3afranina *>-,+-1 5. /e acuerdo a la figura 5 preparar un frotis de E. coli, uno de S. aureus y uno con una me4cla de ambos microorganismos. 6. /ejar secar y fijar al calor como se indica. 7. *eir con cristal violeta por un minuto. ;. Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir. C. -ubrir el frotis con ?odo de Gram y dejar reposar por un minuto. H. Enjuagar con agua corriente y escurrir I. /ecolorar con etanol al GCD. 'ara esto, incline el portaobjetos sobre la c(arola de tincin y aada goteando el etanol, dejando "ue corra por todo el frotis. 'ara un frotis delgado es suficiente con 5B a 6B segundos. J. /etener la accin decolorante lavando con agua. G. -ontrastar con safranina por 6B a 7B segundos, enjuagar y dejar secar el frotis. 5B. E$aminar con el objetivo de inmersin. TINCIN DE ESPORAS <1*E2+1L ? E@!+'O 6 portaobjetos 1sa bacteriolgica 1ceite de inmersin <icroscopio <ec(ero 'apel filtro Lmpara de alco(ol -epa de Bacillus subtilis Kcido actico al CD 14ul de metileno de L=effler *>,+-1 5. 8acer un frotis, secar y fijar al calor como se describe en la figura 5. 6. -ubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar con la lmpara de alco(ol (asta la emisin de vapores. Es importante "ue su puente de tincin est bien nivelado para "ue la fucsina no se escurra y el frotis no se se"ue al calentar.

7. /ejar en reposo por C minutos ;. Lavar con agua corriente C. /ecolorar con cido actico al CD (asta "ue el frotis tome un ligero color rosa H. Lavar con agua corriente I. *eir durante 7 minutos con a4ul de metileno de L=effler J. Lavar nuevamente con agua corriente, dejar secar y observar con el objetivo de inmersin

FIGURA 1 '2E'121-+., /E !, E2O*+3 01-*E2+1,O

'resentacin de resultados 5. /ibuje y coloree sus observaciones, indicando en cada caso& a *ipo de tincin b ,ombre de la bacteria c -aracter%stica observada 6. -onteste el cuestionario 7. -onclusiones ;. 0ibliograf%a