BREVE RESUMEN HISTRICO DE LA RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

Francisco Snchez Ferrando Departament de Qumica, Universitat Autnoma de Barcelona 08193 Bellaterra, Barcelona

La resonancia magntica nuclear (RMN) es una tcnica transversal, cuyos fundamentos y/o aplicaciones abarcan todo el mbito de las ciencias experimentales clsicas (matemticas, fsica, qumica, biologia, geologia), las tecnologas (informtica, ciencia de materiales) y las ciencias de la salud, en especial la medicina. Ahora bien, en este ltimo mbito es frecuente que los facultativos se refieran a la resonancia magntica (denominacin incompleta con que es conocida incluso por el gran pblico), sin el adjetivo nuclear, conscientemente omitido por la profesin mdica (y en consecuencia por los medios de comunicacin), posiblemente por temor a que el pblico desinformado pueda asociar esta tcnica a eventuales radiaciones potencialmente peligrosas producidas por desconocidos procesos radiactivos. Permtanme tranquilizarles inmediatamente: la estabilidad del protn, ncleo mayoritariamente utilizado para la obtencin de las espectaculares imgenes mdicas por RMN a que estamos habituados, es muy elevada. La vida media del protn es de unos 1031 aos, mucho mayor que la edad del Universo desde el Big Bang. nicamente gracias a su gran abundancia se espera poder detectar en alguna ocasin la desintegracin espontnea de un protn, y las probabilidades de que ello ocurra durante los pocos minutos que dura una exploracin mdica por RMN son realmente muy, muy pequeas. Bromas aparte, la supresin injustificada del adjetivo nuclear debe ser enrgicamente rechazada por toda la comunidad cientfica. Veamos someramente las interrelaciones entre las ciencias bsicas y la RMN. La matemtica, por ejemplo, ha proporcionado herramientas como la transformacin de Fourier en una o varias dimensiones, o la teora estocstica, que son imprescindibles para la obtencin de espectros a partir de mediciones primarias de magnetizacin. La fsica, por supuesto, se encuentra en la raz misma del fenmeno de la RMN, a partir de estudios del momento angular intrnseco (o spin) de ciertos ncleos. La informtica ha permitido el control rpido, fiable y reproducible de las muy diversas variables experimentales involucradas en la obtencin de espectros RMN, tales como pulsos de radiofrecuencia de unos pocos microsegundos, con fases predeterminadas hasta una precisin de menos de medio grado sexagesimal, perodos de evolucin de micro- a milisegundos, potencias de irradiacin,

control de temperatura, etc. Tambin la informtica ha permitido la digitalizacin de la seal, as como la transformacin de Fourier numrica. La qumica ha sido, desde hace ms de cincuenta aos, la gran beneficiaria de las aplicaciones de esta tcnica, que permite descifrar detalles muy sutiles de la estructura molecular de los compuestos, as como estudiar su comportamiento dinmico y sus reacciones. La biologa, especialmente la fisiologa, la bioqumica y la biologa molecular, ha podido investigar con gran detalle las biomolculas, tanto en estudios estructurales de biopolmeros como en el seguimiento dinmico de rutas metablicas y, ms recientemente, empleando la espectroscopa localizada in vivo. La geologa, por su parte, ha podido aprovechar las tcnicas de RMN en fase slida en estudios estructurales de minerales o de nuevos materiales, e incluso se han descrito aplicaciones de antenas RMN para la determinacin del contenido en aceites minerales (petrleo) de las rocas. Dado que los fundamentos de la RMN son sobradamente conocidos, no se repetirn aqu. Bastar con enumerar los conceptos de spin nuclear I y el momento angular P asociado, su cuantizacin (en magnitud y en orientacin respecto al campo magntico B0), su relacin con el momento magntico (de la forma = P), que introduce la constante magnetogrica como caracterstica de cada istopo, y la frecuencia de Larmor, 0, a la que precesionan los spins, y que lleva a la bien conocida expresin

que para el protn, 1H, cuya constante magnetogrica vale H = 26.75 x 107 rad T-1 s-1 , operando con un campo magntico B0 = 2.35 T (23500 gauss), da una frecuencia de Larmor de 100.00 MHz, dentro del rango de la radiofrecuencia. Como es bien sabido, la irradiacin de la muestra, por medio de radiacin electromagntica polarizada circularmente en el plano perpendicular a B0 y cuya frecuencia sea precisamente la de Larmor, lleva a la resonancia del sistema, producindose transiciones entre los niveles energticos. La deteccin de la absorcin de esta radiofrecuencia en un espectrmetro RMN no es inmediata, ya que las cantidades de energa involucradas (h0) son muy pequeas, alrededor de unas pocas milicaloras por mol. Ello impide el uso de tcnicas tradicionales en las espectroscopas pticas (UV-vis, IR), en las que se comparan las intensidades de dos haces de radiacin, uno de los cuales ha atravesado la muestra mientras que el otro constituye el haz de referencia. As, a causa del pequeo valor de las energas involucradas, la RMN es una tcnica espectroscpica de muy baja sensibilidad. En condiciones ptimas, en un espectrmetro moderno de alto campo magntico, se requiere un mnimo de 1015 spins de una determinada especie isotpica (de las "fciles" de medir) para poder detectar seales tiles en un perodo de una hora. Y, a pesar de estas limitaciones, la RMN es la tcnica ms ampliamente utilizada en investigaciones estructurales o dinmicas de compuestos qumicos en fase condensada, tanto desde el punto de vista de los fsicos como, en especial, del de los qumicos, y ms recientemente de los bilogos o los mdicos. A diferencia de otras tcnicas de investigacin estructural, la RMN no se limita al caso de pequeas molculas de bajo peso molecular y alta simetra, sino que proporciona datos precisos y muy tiles incluso con biopolmeros de peso molecular relativamente elevado (protenas), sin requerir la previa cristalizacin de la muestra.

Esta gran utilidad de la RMN se puede describir usando las palabras de Richard R. Ernst, Premio Nobel de Qumica 1991: Los sistemas de spins nucleares presentan caractersticas singulares que los predestinan para el estudio de las molculas: 1) Los ncleos atmicos empleados como sensores se encuentran perfectamente localizados, con dimetros de unos pocos femtometros, y pueden proporcionar informacin sobre la situacin de su entorno inmediato, haciendo as posible una exploracin muy detallada de las molculas y de la materia. 2) La energa de interaccin de los sensores con el entorno es pequesima, inferior a 0.2 J mol-1, equivalente a la energa trmica a 30 mK. De este modo, la observacin y la medicin de propiedades moleculares se puede realizar prcticamente sin perturbaciones. No obstante, las interacciones presentan una elevada sensibilidad respecto del entorno local. 3) La informacin sobre la estructura de las molculas puede obtenerse a partir de las interacciones entre pares de ncleos. As, las interacciones magnticas dipolo-dipolo proporcionan informacin sobre las distancias internucleares. Por su parte, los acoplamientos escalares J permiten la determinacin de ngulos de torsin. Este conjunto de propiedades es el que ha hecho que la RMN sea hoy una herramienta imprescindible en todos los laboratorios de qumica preparativa y de bioqumica estructural o dinmica. En otro contexto, los instrumentos de imagen por RMN son tambin imprescindibles en los hospitales. Pero para llegar a la situacin actual ha sido preciso superar las dificultades asociadas a la baja sensibilidad caracterstica de la RMN. De hecho, la historia de la RMN es una sucesin de brillantes avances experimentales que han permitido ir aumentando con los aos la sensibilidad de la tcnica.

Un poco de prehistoria: la gestacin de la RMN Un resumen de los acontecimientos que llevaron al descubrimiento de la RMN en fase condensada sera incompleto sin la inclusin de su prehistoria, caracterizada por notables esfuerzos experimentales destinados a demostrar primero y a detectar despus la existencia de un momento angular de spin asociado a los ncleos, con su correspondiente momento magntico. Los conceptos de spin electrnico y del momento magntico del electrn fueron experimentalmente confirmados al comienzo de los aos veinte por medio del famoso experimento de Stern-Gerlach, en el cual se separaron haces de tomos en un campo magntico inhomogneo de acuerdo con la orientacin del momento magntico de sus electrones desapareados. Hacia finales de los aos veinte, Pauli demostr claramente que muchas de las caractersticas de la estructura hiperfina de los espectros atmicos nicamente se podan explicar si determinados ncleos atmicos presentaban tambin spin y su correspondiente momento magntico. Posteriores refinamientos del experimento de Stern-

Gerlach lo confirmaron en el ao 1933, y proporcionaron unos primeros valores aproximados del momento magntico del protn. Se haba formulado, as, la prediccin de la existencia de un spin nuclear para ciertos tomos, incluyendo el hidrgeno, que era preciso medir con exactitud. En 1936 el fsico C.J. Gorter intent medir la resonancia magntica de ncleos de 7Li en LiCl slido mediante tcnicas microcalorimtricas, pero sin resultado. Tampoco consigui detectar la resonancia de 1H en cristales de alumbre potsico hidratado. Posteriormente lo volvi a intentar con LiF slido, nuevamente sin xito. Hoy sabemos que una posible causa de su fracaso es que el LiF cristalino de gran pureza presenta una relajacin longitudinal anormalmente lenta, de modo que se requieren tiempos anormalmente elevados para que se polarice la muestra una vez sumergida en el campo magntico y se pueda, as, medir su resonancia magntica nuclear. Fu precisamente Gorter el primero en usar por escrito la expresin Nuclear Magnetic Resonance en el ttulo de uno de sus artculos, publicado en 1942, pero siempre atribuy esta expresin a I.I. Rabi. En 1937 B.G. Lasarew y L.W. Schubnikow demostraron que, a bajas temperaturas, los momentos magnticos nucleares contribuyen apreciablemente a la susceptibilidad magntica esttica observada en el hidrgeno slido. El experimento crucial en la prehistoria de la RMN lleg en 1939, cuando I.I Rabi y colaboradores disearon y probaron una importante mejora de las tcnicas de haces que permiti, por primera vez, la observacin de resonancia magntica nuclear, aunque en haces moleculares (carentes de spin electrnico), y que constituy la primera medicin del momento magntico del protn. Adems de hacer pasar un haz de molculas por un campo magntico inhomogneo (para deflectarlas) y por un segundo campo tambin inhomogneo pero de signo opuesto (para reenfocarlas), Rabi intercal entre ambos campos inhomogneos un tercer campo, variable pero homogneo. Al irradiar la regin central (campo homogneo) con radiacin electromagntica de frecuencia constante, dentro del rango de la radiofrecuencia, y realizar un barrido del campo magntico central homogneo, el haz result inalterado excepto para un muy estrecho rango de valores del campo central homogneo. Para los valores de este estrecho rango el haz diverga y ya no se produca el reenfoque sobre el detector. Haba nacido la resonancia magntica nuclear, aunque Rabi la denomin espectroscopa de radiofrecuencia. Por este importante descubrimiento se concedi a Rabi el Premio Nobel de Fsica de 1944. Poco despus de este brillante experimento, y usando el mismo tipo de instrumento, lvarez i Bloch midieron el momento magntico del neutrn, pero la guerra mundial introdujo un parntesis en estas investigaciones fundamentales sobre RMN. No fu sino en 1945, acabada la guerra, que dos grupos de Estados Unidos, trabajando independientemente, intentaron nuevamente medir resonancia magntica nuclear en materia condensada, pese a la falta de xito anterior de Gorter. Uno de estos dos grupos, dirigido por E.M. Purcell, trabajaba en la Universidad de Harvard, Massachusetts. El otro, dirigido por Felix Bloch, lo haca en la Universidad de Stanford, California. Ambos investigadores no se conocan personalmente, pese a que F. Bloch haba pasado los aos de la guerra trabajando en proyectos militares precisamente en Harvard. Segn el relato de W.G. Proctor, discpulo de Bloch que descubri el fenmeno del desplazamiento qumico, fu justamente durante los aos de guerra pasados en Harvard cuando Bloch desarroll tranquilamente (en casa, trabajando de noche) sus ideas

sobre RMN en fase condensada. Por este motivo fu posible efectuar con xito el experimento a los pocos meses de su retorno a Stanford, acabada la guerra.

RMN en fase condensada: el nacimiento de la RMN La primera deteccin de resonancia magntica nuclear en materia condensada fu conseguida por el equipo de Purcell, Torrey y Pound en Harvard, poco antes de las Navidades de 1945 (su artculo se recibi en Phys. Rev. el da de Nochebuena). El experimento consisti en situar un bloque de parafina slida, de 850 mL, en una cavidad resonante de radiofrecuencia, alimentada a 29.8 MHz por medio de un circuito apropiado. Este conjunto se hallaba dentro de un electroimn de campo magntico variable. La seal de salida del resonador se equilibr con una parte de la seal procedente de la fuente de radiofrecuencia, y al proceder a un barrido del campo magntico se observ una aguda absorcin por resonancia para un valor del campo de 7100 gauss. Este experimento de deteccin directa de la absorcin resulta equivalente a los intentos infructuosos de Gorter unos pocos aos antes. Es interesante sealar que al planificar su experimento Purcell desconoca el fracaso anterior de Gorter. Cuando Rabi supo lo que Purcell quera hacer, le hizo notar que Gorter no lo haba conseguido, pero Purcell decidi que los preparativos estaban ya demasiado avanzados para renunciar, y sigui adelante con lo que, en definitiva, acabara siendo la primera deteccin de RMN en materia condensada. De manera completamente independiente, el equipo de Felix Bloch en Stanford consigui, a fines de diciembre de 1945, detectar tambin seales de RMN de protn, utilizando un equipo experimental muy diferente y sobre una muestra de agua. En lugar de un nico circuito de radiofrecuencia, en el experimento de Bloch se utilizaron dos bobinas, mutuamente ortogonales, una para la excitacin y la otra como detector. Tambin en este caso, las dos bobinas se hallaban dentro de un fuerte campo magntico variable, perpendicular a ambas bobinas, y la elegante aproximacin de Bloch prevea detectar sobre la segunda bobina la fuerza electromotriz inducida por la precesin de la magnetizacin nuclear de la muestra, provocada por la primera bobina al producirse la absorcin. Por este motivo, en Stanford el fenmeno se denomin inicialmente induccin nuclear. Resulta interesante seguir el relato de uno de los investigadore participantes. Dice M.E. Packard: Hacia el cuarto trimestre de 1945, en Stanford, bajo la direccin del Prof. Bloch, nos habamos propuesto la tarea de detectar las seales de induccin nuclear (nombre que en aquella poca dbamos a la RMN) de los protones en fase condensada. A este fin Russell Varian, que tambin perteneca al Departamento, construy un electroimn con una cavidad que, llena de agua, era nuestra muestra de protones en fase condensada. La bobina de excitacin y la de deteccin eran mutuamente ortogonales entre s, y tambin lo eran con el campo magntico. La fuente de radiofrecuencia era muy parecida a uno de los radares utilizados durante la guerra. Pero el campo magntico era demasiado inhomogneo. Pese a todos nuestros esfuerzos, no conseguamos ver la seal de induccin nuclear en la pantalla del osciloscopio, de modo que propuse un mtodo consistente en realizar un barrido rpido de la corriente del imn con la esperanza de que, en algn instante, el campo magntico y la radiofrecuencia tendran la relacin precisa para dar la seal esperada. Tras diversos intentos, unos das despus de Navidad, hallndome solo en

el subterrneo del laboratorio, consegu ver la seal deseada al apagar la corriente del electroimn (ciertamente, el ms rpido barrido imaginable). Como es de suponer, la excitacin en Stanford fu mxima, y rpidamente se escribi un artculo describiendo el nuevo fenmeno, sin tener conocimiento del artculo de Purcell sobre el mismo tema. El artculo de F. Bloch, W. Hansen y M.E. Packard lleg a Phys .Rev. el 29 de enero de 1946, y ambos artculos se publicaron en el mismo nmero de la revista. Pocos aos despus, en 1952, Purcell y Bloch recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Fsica por su descubrimiento, ya definitivamente conocido como resonancia magntica nuclear (RMN). Resulta interesante indicar que, a diferencia de Purcell, Bloch conoca perfectamente los trabajos infructuosos de Gorter, pero crea tener una explicacin para su fracaso. Bloch supona que el experimento de Gorter haba fallado porque el tiempo de relajacin T1 era mucho ms largo de lo que se imaginaba. Para superar esta dificultad, Bloch propuso a sus colaboradores que pusieran su muestra de agua dentro del fuerte campo magntico del electroimn durante unos cuantos das, antes de intentar las mediciones, para permitir que el sistema de spins nucleares llegara al equilibrio trmico. As se hizo, y tras poner la muestra Bloch se march a esquiar durante unos das. Al regresar al laboratorio, tras diversos intentos infructuosos, finalmente se logr medir la seal de resonancia, pero tambin se pudo determinar que el tiempo de relajacin era mucho ms corto de lo supuesto. En realidad, slo eran precisos unos segundos, en lugar de das, para establecer el equilibrio! La brillante concepcin de Bloch sobre la resonancia magntica nuclear, tanto desde el punto de vista terico como desde el experimental, ha sido confirmada por sus numerosas aportaciones durante el resto de la dcada de los aos cuarenta. Pero uno de los aspectos ms importantes le pas por alto: la gran disminucin de la anchura natural de las seales RMN en lquidos causada por sus movimientos trmicos, convincentemente demostrada por Bloembergen, Purcell y Pound en Harvard, en su artculo publicado en 1948. Hasta conocer en Stanford el contenido de este artculo, la gran anchura de banda de las seales RMN observadas por el equipo de Bloch se atribuy, errneamente, a su anchura natural, causada por las interacciones dipolo-dipolo descritas por Bloch en slidos. En realidad, para muestras lquidas, esta gran anchura de banda era debida a la gran inhomogeneidad de campo magntico de todos los imanes disponibles en Stanford durante aquellos aos iniciales.

Descubrimientos de gran significacin qumica: la primera infancia de la RMN El perodo 1945-1955 est marcado por el gran ritmo de los descubrimientos efectuados por los fsicos dentro del campo de la RMN. Inicialmente, tras el descubrimiento de Purcell y Bloch, tanto sus grupos como otros investigadores se dedicaron a medir los momentos magnticos (o, ms precisamente, las constantes magnetogricas) de todos los elementos (o istopos) todava no estudiados, con el objetivo de buscar relaciones entre la magnitud medida y la estructura nuclear. Subyacente en este mtodo se encontraba la hiptesis de que el momento magntico de un determinado ncleo (o istopo) presentara siempre el mismo valor, independientemente de cul fuera el compuesto utilizado para la determinacin. Al mejorar la calidad de los dispositivos experimentales fu posible aumentar la resolucin de las seales. Esto condujo al descubrimiento del desplazamiento qumico, de evidente trascendencia en qumica, y consistente en que las seales de una determinada

especie isotpica presentan frecuencias que dependen de la especie qumica sobre la cual se efectan las determinaciones. Este descubrimiento fu efectuado en Stanford por Proctor y Yu, dos jvenes estudiantes postdoctorales del grupo de Bloch. Sigamos el relato de W.G. Proctor: Tras haber diseado y construido un espectrmetro RMN de campo muy homogneo, que constituy mi tesis doctoral en Stanford, el Prof. Bloch nos encarg a Yu (recin graduado en Ohio State University) y a m la tarea de localizar las resonancias y medir los momentos magnticos y los spins de cuantos istopos estables fuera posible, con el objetivo de completar la tabla peridica en un ao, aproximadamente. En el curso de estos trabajos, al tocarle el turno al nitrgeno como ncleo de referencia, nos propusimos medir su momento magntico con gran precisin (creo recordar que la resonancia de 14N haba sido medida el ao anterior por Pound en Harvard). Recuerdo que fu al almacn de qumica y anduve rebuscando un compuesto que diera la resonancia ms fuerte posible. Pronto eleg el frasco marcado NH4NO3, ya que obviamente haba de ser muy soluble en agua y, adems, al tener dos nitrgenos haba de dar una seal muy fuerte. Tras preparar una solucin concentrada e introducirla en el imn, Yu y yo aguardbamos expectantes junto al imn, esperando que el pequeo motor de reloj que cambiaba gradualmente la frecuencia del espectrmetro hiciera aparecer la resonancia. As fu, y apareci una magnfica seal de resonancia en la cinta que registraba el espectro. Pero mientras mirbamos, para nuestro asombro, apareci una segunda seal de igual amplitud que la primera. Incrdulos, repetimos el experimento diversas veces para descartar cualquier posible error instrumental, siempre con igual resultado. Subimos los registros al despacho del Prof. Bloch, que se mostr muy interesado, e inmediatamente nos pusimos a discutir posibles causas para este fenmeno. Seleccionamos dos posibles explicaciones, una mucho ms interesante que la otra. La ms interesante era la posible existencia de ismeros nucleares estables, de la misma masa, con propiedades ligeramente distintas. Creamos haber hecho un descubrimiento fsico trascendental. Pero era preciso descartar la segunda posible causa, sin ningn inters para nosotros, consistente en algn fenmeno qumico, tal como un apantallamiento diamagntico del ncleo, dependiente de su entorno qumico, que pudiera afectar la densidad electrnica del ncleo de nitrgeno. Para descartar esta segunda y poco interesante hiptesis, Bloch pidi al Prof. Segra una pequea muestra de 15N. Si las dos resonancias no aparecan en una muestra de nitrato amnico preparada a partir de 15N, obviamente la explicacin haba de ser nuclear, como nosotros desebamos, y no simplemente qumica. La conversin de la muestra de 15N en nitrato amnico tard tres semanas, muy angustiosas para todos nosotros. Finalmente la muestra lleg y, a las pocas horas, habamos vuelto a observar las dos seales de igual intensidad, proporcionalmente con la misma separacin entre ambas. Por tanto, nos vimos forzados a admitir que se trataba de un enojoso efecto meramente qumico, que poda llegar a impedirnos progresar rpidamente en nuestra carrera. Nuestro artculo se public en 1950 en forma de carta, y por casualidad en el mismo nmero de Phys. Rev. que contena un artculo de W.C. Dickinson, de MIT, que describa el mismo fenmeno para el ncleo de 19F. De este modo se descubri el desplazamiento qumico, sin el cual la RMN no tendra hoy gran utilidad analtica. Y fu precisamente durante sus estudios para clarificar las causas del

desplazamiento qumico cuando Gutowsky, a principios de 1950, descubri el acoplamiento escalar spin-spin. Sigamos su relato: A comienzos de 1950 nos interesaba investigar desplazamientos qumicos en lquidos, y seleccionamos el ncleo de 19F. Inicialmente probbamos cualquier compuesto fluorado que nos cayera en las manos, hasta que el 26 de abril de 1950 conseguimos resolver las seales de un trifluorometilbenceno fluorado tambin en el ncleo aromtico. Esto nos motiv mucho, y nos llev a pensar de qu modo podramos correlacionar los desplazamientos qumicos con la estructura molecular. Influenciado por el libro de Linus Pauling, The Nature of the Chemical Bond, pens que el desplazamiento qumico, como fenmeno elctrico, debera estar relacionado de algn modo con la naturaleza del enlace qumico. ste, a su vez, depende de la naturaleza de los tomos que se enlazan, de modo que decid estudiar los fluoruros binarios sencillos, eleccin que result ser muy afortunada. El da 8 de septiembre de 1950, en nuestro laboratorio, C. Hoffmann observ por primera vez una lnea doble en la resonancia de 19F de una pequea muestra de PF3 que l mismo haba sintetizado como parte de nuestro estudio de los desplazamientos qumicos del flor. Como la sntesis se efectu por fluoracin de PCl3, decidimos que la doble lnea era debida a la presencia de impurezas de PClF2 o PCl2F. Pero, tras purificar la muestra, el par de seales permaneca inmutable. El mismo resultado se obtuvo con una muestra de PF3 preparada por otra ruta. Tambin en una muestra de PF5 se observaron dos bandas, y en este caso la explicacin que pareca ms razonable era que se trataba de desplazamientos qumicos diferentes para los F ecuatoriales y los apicales. Finalmente, en marzo de 1951, al examinar el espectro de 31 P de POCl2F, se observ un doblete 1:1 que me convenci de que habamos hallado un nuevo tipo de interaccin internuclear relacionada con los estados de spin de ambos ncleos. En efecto, el espectro de 31P de CH3OPF2 present un triplete 1:2:1, tal como yo haba predicho. As se descubri el segundo gran parmetro de la RMN, sin el cual carecera de la gran utilidad analtica que ha alcanzado. Las mejoras instrumentales de aquellos primeros aos permitieron muy pronto la observacin de diferentes desplazamientos qumicos de protn en compuestos orgnicos (el primero fu el etanol), en forma de lo que por aquel entonces se conoca como seales "bien resueltas", de intensidad proporcional al nmero de protones. El procedimiento habitual para la observacin de lneas de RMN en aquellos tiempos consista en variar la frecuencia (o, ms a menudo, el campo magntico) a travs de la condicin de resonancia, recoger las seales de deflexin en un osciloscopio y registrarlas. Este mtodo, denominado de onda continua (CW, continuous wave) ha sido el generalmente utilizado durante muchos aos, porque permite la observacin secuencial de cada una de las muchas lneas de absorcin de multipletes complejos, pero se requiere que el barrido sea muy lento para permitir el registro sin distorsiones de las bandas, y ello ha exigido considerables mejoras en la estabilidad de los instrumentos, ya que cada registro de un espectro suele requerir unos diez minutos. Bloch sugiri desde el inicio un procedimiento alternativo de excitacin mediante un muy corto pulso de radiofrecuencia. En 1949 E. Hahn demostr que este procedimiento, efectivamente, era capaz de inducir una seal (FID, free induction decay) correspondiente a la

libre precesin de la induccin nuclear. Adems demostr que empleando secuencias de pulsos se generaban ecos de spin que contenan informacin adicional sobre el sistema. Los mtodos de pulsos desarrollados por Hahn, que son la base de la RMN actual, se convirtieron en los preferidos por los fsicos para el estudio del comportamiento dinmico de la relajacin de sistemas sencillos, a menudo de una nica lnea en el espectro RMN, talos como, p.ej., las muy anchas bandas de absorcin de muestras slidas. Por otra parte, en el estudio de la relajacin, en 1953 se descubri el efecto nuclear Overhauser (NOE), si bien sus aplicaciones qumicas tuvieron que esperar algunos aos. De este modo, hacia principios de los aos cincuenta, toda la teora de la RMN haba sido completamente desarrollada por los fsicos, que progresivamente fueron perdiendo inters por un fenmeno ya tan bien conocido en sus principios fundamentales como la RMN. Y, de modo casi natural, el inters por la RMN se desplaz de la fsica a la qumica, gracias a sus numerosas aplicaciones. En palabras de M.E. Packard, "chemists got the point very quickly, thanked the physicists, and took over".

Primeras aplicaciones qumicas: la preadolescencia de la RMN El grupo de fsicos dirigido en Stanford por los profesores Bloch y Hansen estaba constituido, entre otros, por personas como Russell Varian, Martin Packard, W.G. Proctor, W.A. Anderson y otros que en 1948 fundaron una nueva empresa, denominada Varian Associates, en Palo Alto, California, no muy lejos del campus de Stanford. Para fundarla se vieron obligados a dejar la Universidad de Stanford, olvidar sus cmodos salarios e incluso vender sus casas. La segunda lnea de productos comercializados por la nueva empresa era el espectrmetro de RMN. Russell Varian estaba convencido de su gran valor, pero nadie en la empresa saba demasiado bien para qu podra servir. Era el ao 1953, y Varian hizo insertar anuncios del nuevo producto en revistas de qumica, como por ejemplo JACS, con el ttulo "NMR at work". Es interesante resear que en 1955 Varian ya haba vendido tres espectrmetros RMN de alta resolucin, a 40 MHz para protn, precisamente a tres empresas del ramo de la qumica (Humble Oil, Texas; DuPont, Delaware; y Shell Development, California). Investigadores de la talla de M.E. Packard, J.N. Shoolery o H.E. Weaver, aparte de sus funciones como directivos de Varian Associates, proporcionaban nuevas aplicaciones en un nmero creciente de campos de la qumica, entre los que no tard en aparecer la qumica orgnica. En contraste con el casi medio siglo transcurrido desde el descubrimiento de la espectroscopa infrarroja (1900) hasta la introduccin del primer espectrmetro IR comercial (1946), la rapidez del desarrollo de la RMN es muy chocante. Sin duda, uno de los motivos es el clima de base tecnolgica y la aceptacin de innovaciones que haba en aquellos aos postblicos. Pero tambin tuvo gran importancia la fuerte interaccin entre una industria electrnica de gran base tecnolgica (Varian) y el grupo puntero de investigadores de la RMN comandado por Bloch en la Universidad de Stanford. Aquellos primeros espectrmetros RMN a 40 MHz para protn eran aparatos muy primitivos. Era preciso registrar el espectro protnico entre 0 y 10 ppm durante unos 5-10 minutos, pero no era posible efectuar registros ms lentos a causa de la deriva aleatoria del campo magntico, que podia llegar a ser dominante incluso bajo el control de los denominados superestabilizadores de campo. Especialmente crtico era el proceso de ajuste de la homogeneidad del campo magntico (field shimming), que era preciso efectuar para cada muestra al objeto de obtener la mxima resolucin. Entre unas cosa y otras, la obtencin de

espectros RMN era una tarea larga y delicada, reservada a buenos especialistas instrumentales. Pero la recompensa por la obtencin de buenos espectros era muy importante. Los qumicos orgnicos pronto comprobaron que la espectroscopa RMN era la tcnica ideal para la elucidacin o comprobacin estructural de molculas de peso molecular moderado. Casi todos los compuestos de la poyata daban nuevos e interesantes datos espectrales de utilidad general. En 1958 apareci el clsico artculo de Shoolery y Rogers sobre el estudio de esteroides por RMN, en el que se demostraba que incluso a 40 MHz los desplazamientos qumicos de los metilos angulares eran de gran valor diagnstico. Tambin en aquellos aos se publicaron numerosos datos de biomolculas, tales como alcaloides, azcares, porfirinas y otros compuestos. Pronto Karplus demostr que las constantes de acoplamiento vicinales a tres enlaces se podan correlacionar con los ngulos de torsin, y esto di origen a numerosos estudios conformacionales, especialmente en el campo de los azcares. Hacia finales de la dcada, en 1959, aparecieron el clsico libro de Jackman, en el que se correlacionaban los datos de RMN con la estructura molecular, y el pequeo opsculo de Roberts, en el que se efectuaba una breve introduccin de los principios tericos bsicos con argumentos sencillos, al alcance de los qumicos orgnicos. Aparecieron en el mercado instrumentos comerciales de imn permanente, a 60 MHz para protn, con mucha ms estabilidad y resolucin que los primeros aparatos comerciales, y con los cuales los espectros eran mucho ms reproducibles. En 1961-1962 se instalaron en Espaa los dos primeros espectrmetros RMN. El primero de ellos se instal en Madrid, bajo la supervisin del Prof. Manuel Rico, de cuyo magisterio nos hemos venido beneficiando todos cuantos nos hemos dedicado a la RMN en Espaa. El segundo se instal muy poco despus en Barcelona, bajo la supervisin del Prof. Josep Castells, introductor de la RMN en Catalunya y que fu mi director de tesis. Recuerdo bien que durante mi tesis utilic intensivamente este segundo instrumento, un Perkin-Elmer R-10, a 60 MHz, que requera un mnimo de 60-100 mg de muestra slida, disuelta en CCl4, para compuestos de peso molecular inferior a 300, a menos que la muestra fuera lquida, en cuyo caso se usaba el lquido puro para maximizar las seales. O tempora, o mores!

Tcnicas de pulsos y transformacin de Fourier: la adolescencia de la RMN La estabilidad y la fiabilidad de la electrnica fueron mejorando la calidad de los espectrmetros RMN durante toda la dcada 1955-1965. Especialmente importante fu el establecimiento de campos estables (con electroimn) de 23.5 kG, que permitieron medir protn a 100 MHz empleando cantidades de muestra inferiores a los 100 mg. La tecnologa de los imanes superconductivos, refrigerados por helio lquido, hizo posible finalmente la construccin de imanes permanentes de solenoide superconductor con campos estables mucho ms elevados (primeros espectrmetros de protn a 220 MHz, Varian HR-220, en 1966). Con estos espectrmetros de campo alto fu posible culminar (el Prof. Manuel Rico, en Madrid, ya haba iniciado sus trabajos con la ribonucleasa a 90 MHz!) el estudio de biopolmeros tales como polipptidos, protenas, etc. Pero todava era preciso obtener todos los espectros mediante el lento barrido de campo (o de frecuencia) caracterstico del mtodo de la onda continua. De todos modos, la gran dispersin de frecuencias protnicas alcanzable con imanes superconductores permiti la aparicin, en 1967, de un primer estudio detallado de protenas por RMN. En 1966 lleg tambin la primera gran revolucin metodolgica instrumental de la RMN, veinte aos despus de su descubrimiento, por parte de uno de sus primeros

investigadores (Weston A. Anderson) y de un joven suizo (Richard R. Ernst) todava poco conocido, que por aquel entonces trabajaba en Varian, Palo Alto. Se trata del mtodo de pulsos y transformacin de Fourier, hoy universalmente utilizado por todos los espectrmetros, que ya haba sido investigado por Hahn en 1950. La gran ventaja de este mtodo es que permite excitar simultneamente, con un nico pulso de radiofrecuencia de gran intensidad y de muy corta duracin (tpicamente inferior a 10 s), todos los protones de la muestra, independientemente de su desplazamiento qumico, sin necesidad de efectuar un barrido de frecuencia. La respuesta transitoria del sistema (FID) consiste en la aparicin de una induccin nuclear, en forma de magnetizacin macroscpica transversa, que precesiona perpendicularmente al campo fijo del imn, mientras se va amortiguando por la accin de los mecanismos de relajacin. Como en los experimentos de Bloch, esta induccin nuclear se puede medir gracias a la fuerza electromotriz que induce en la bobina del detector, y suele tener una duracin del orden de un segundo. Adems, se puede almacenar digitalmente en la memoria de un ordenador y, tan pronto como se anula, inmediatamente se puede volver a enviar un pulso a la muestra, sumndose coherentemente las sucesivas FIDs en la memoria del ordenador. Esto permite mejorar en dos o tres rdenes de magnitud la relacin seal-ruido y ampliar as los mbitos de aplicacin de la RMN. La transformacin de Fourier de esta FID, operacin matemtica que tambin realiza digitalmente el ordenador, proporciona un espectro con el mismo formato y la misma informacin que si se hubiera obtenido por onda continua, pero en mucho menos tiempo. As, durante los diez minutos habitualmente necesarios para el registro de un nico espectro por onda continua, el mtodo de pulsos puede sumar un total de ca. 600 FIDs. Pero es que, adems, la seal de cada una de estas FIDs es mucho ms intensa que la de un espectro convencional de onda continua para la misma concentracin de muestra. Hasta esta revolucin, las aplicaciones prcticas de la RMN se haban limitado a los muy pocos istopos de elevada abundancia natural y de spin 1/2, principalmente 1H, 19F, 31P y 195 Pt. Desgraciadamente, esto excluye ncleos tan abundantes e importantes como el carbono 12 ( C, 98.9%) o el oxgeno (16O, 99.8%), ya que carecen de spin (I = 0). Pero la aparicin de este artculo de Ernst y Anderson abri el campo de la RMN multinuclear, al posibilitar la suma coherente, en poco tiempo, de centenares o miles de FIDs correspondientes a ncleos de baja abundancia natural, hasta entonces slo accesibles para molculas isotpicamente enriquecidas. Entre los ncleos de mayor inters que la tcnica de pulsos y transformacin de Fourier puso al alcance, hay que mencionar en primer lugar al 13C (1.1% de abundancia natural), el 15N (0.37%), el 2H o deuterio (0.015%) y, en general, todos los elementos de la tabla peridica. Naturalmente, tambin permiti la obtencin en poco tiempo de excelentes espectros de protn de compuestos de estructura complicada utilizando muestras de 1 mg o menos. Los primeros espectrmetros comerciales que incorporaron la nueva tcnica fueron comercializados por la firma alemana Bruker, y estaban en el mercado hacia 1970. La combinacin de imanes superconductivos de campo permanente cada vez ms alto y el mtodo de pulsos y transformacin de Fourier, con su ya inseparable ordenador integrado, caracteriz el incremento constante de la sensibilidad de la RMN durante los primeros aos setenta. Tambin permiti convertir la RMN multinuclear en una herramienta prctica de investigacin estructural. As, los espectros de 13C a abundancia natural pronto se convirtieron en completamente rutinarios. Con grados de dificultad variables, tambin muchos ncleos metlicos fueron accesibles en la prctica por primera vez. Otra caracterstica de los avances producidos durante los aos setenta fu el diseo y la utilizacin de secuencias multipulso, con el objetivo de aumentar an ms la relacin

seal/ruido (p.ej., mediante transferencia de polarizacin) o de singularizar el tipo de informacin espectral producida (p.ej., espectroscopa diferencial, determinacin de NOEs, excitacin selectiva, etc). Si para la obtencin de un espectro convencional por onda continua se requiere simplemente un barrido de frecuencias, registrando la intensidad absorbida a cada frecuencia, con el mtodo de pulsos basta excitar la muestra con un nico pulso de corta duracin, y acto seguido recoger y almacenar la FID que, por transformacin de Fourier, proporcionar un espectro idntico al anterior. Pero nada impide librar ms de un pulso durante la excitacin, como ya lo haba efectuado Hahn al estudiar los ecos de spin. As, variando el nmero de pulsos, su duracin, su fase, los perodos entre ellos, los ncleos a los que excitan, su selectividad (duros o blandos), etc, se abri paso una gran variedad de secuencias multipulso tiles para la obtencin de informaciones estructurales especficas, hoy da ya totalmente rutinarias, y que se desarrollaron durante los aos setenta. Tambin en esos aos se perfeccionaron los estudios de muestras slidas mediante RMN de alta resolucin, con la introduccin de mtodos de desacoplamiento de alta potencia y especialmente la rotacin de ngulo mgico. Finalmente, tambin en los setenta, Lauterbur inici un ambicioso programa de localizacin espacial de seales RMN, que l denomin zeugmatografa, que acabara siendo la base de la actual tcnica de obtencin de imgenes mdicas por RMN.

RMN multidimensional: la primera juventud de la RMN Vemos, pues, que desde el descubrimiento (1946) de la RMN hasta la primera revolucin metodolgica (pulsos y transformacin de Fourier, 1966) haban transcurrido veinte aos. La segunda gran revolucin metodolgica, la RMN bidimensional (2D NMR) tard mucho menos en llegar: conceptualmente fu formulada como posibilidad terica por J. Jeener, en uno de los unpublished papers ms citados del mundo, durante el congreso Ampre celebrado en 1971 en Basko Polje, en un pas todava llamado Yugoslavia. Cinco aos ms tarde, el equipo de Ernst, ya definitivamente instalado en la ETH de Zrich, haba completado la teora de la 2D NMR, haba incorporado a los espectrmetros las modificaciones necesarias y haba aplicado los mtodos experimentales bidimensionales, con ejemplos concretos y aplicaciones prcticas, todo ello publicado entre 1973 y 1976. Con la llegada de la segunda dimensin, nuevamente la RMN revelaba la existencia de un nuevo territorio inexplorado para investigar: correlaciones homo- y heteronucleares, espectroscopa J, procesos de intercambio qumico o topolgico, transferencias de polarizacin, secuencias multipulso, excitaciones selectivas y un largo etctera. Significativamente, uno de los nuevos campos ahora abiertos, gracias a la gran simplicidad de los espectros bidimensionales, fu el estudio de transiciones prohibidas, en particular las bicunticas. En palabras del propio Ernst: "Chemists will find great excitement in the forbidden fruits of spectroscopy". El principio en que se basa la RMN bidimensional es sobradamente conocido por esta audiencia, y es conceptualmente muy sencillo. En RMN monodimensional se excita el sistema de spins y se mide la magnetizacin o seal S en funcin de la variable tiempo. Se obtiene as la funcin temporal S(t), o FID, que se debe monitorizar a intervalos constantes, y cuya transformacin de Fourier proporciona el espectro F(), en funcin de la frecuencia. Pero si se somete el sistema de spins a dos perturbaciones, separadas en el tiempo por un periodo incrementable t1, tras medir la magnetizacin a lo largo del tiempo (que ahora se denomina t2) se obtiene una seal S(t1,t2) que es funcin de ambas variables temporales. Por

doble transformacin de Fourier se obtiene un espectro bidimensional, F(1,2), en el cual la intensidad de la seal ser funcin simultneamente de dos variables frecuencia. Cada una de estas dos variables frecuencia est relacionada con el comportamiento del sistema durante el correspondiente tiempo (1 con el tiempo t1, 2 con el tiempo t2), as como con la naturaleza de las dos perturbaciones introducidas. Surgen de este modo espectros de correlacin, tanto homonucleares (COSY) como heteronucleares (HETCOR, HMQC, HSQC, HMBC), pero tambin espectros J-resueltos, de doble cuanto, de intercambio (EXSY) o de relajacin (NOESY, HOESY), y un largo etctera. Todos ellos constituyen poderosos mtodos que ayudan a la asignacin estructural o a la investigacin de procesos de escala de tiempo adecuada. Desde la introduccin de estas tcnicas bidimensionales el concepto se ha extendido a tres y hasta cuatro dimensiones. Con la ayuda del marcaje isotpico (13C y 15N, principalmente) y por medio del uso de tcnicas de ingeniera gentica (DNA recombinante) se puede disponer de protenas cmodamente biosintetizadas a partir de aminocidos doblemente marcados con ambos istopos. Los resultados son totalmente espectaculares, especialmente gracias a la aceleracin en la obtencin de los resultados posibilitada por la seleccin de coherencias por medio de gradientes. La RMN da hoy una informacin tan precisa y fiable como la difraccin de rayos X para protenas de peso molecular inferior a 50000, con la ventaja de que, al trabajar en solucin, puede suministrar tambin informacin sobre procesos dinmicos, de gran inters para entender la funcin biolgica de estas macromolculas. Las mejoras instrumentales, aparecidas desde que en 1975 se inici la prctica generalizada de la RMN bidimensional, han facilitado en gran medida la aplicacin de estos mtodos. Veamos algunos ejemplos. El campo magntico estable y homogneo de los imanes superconductivos disponibles comercialmente ha ido aumentando desde los 5.17 T del viejo Varian HR-220, de 1966, hasta los 21.1 T (900 MHz para protn) de los espectrmetros comerciales actuales de mayor campo. De hecho se habla ya de la espectroscopa de GHz, sin duda reservada para las aplicaciones (todava lejanas, lamentablemente) de los nuevos materiales superconductores de alta temperatura. En cualquier caso, a mayor campo magntico se tiene mayor sensibilidad, mayor dispersin y la posibilidad de extender las aplicaciones a casos ms difciles. El coste de estos futuros espectrmetros de GHz, sin embargo, deber resultar astronmico. El desarrollo de la informtica ha permitido la incorporacin a los espectrmetros RMN de ordenadores de gran capacidad y velocidad. Adems, el software se ha diseado pensando en facilitar al usuario no especialista un control fcil sobre las variables instrumentales. Por otra parte, las redes informticas permiten el procesamiento off-line de los espectros en cualquier ordenador personal o estacin de trabajo. Los avances en electrnica aplicada han permitido disponer de espectrmetros multicanal, con los cuales se pueden perturbar simultneamente diversos istopos, usando excitaciones de radiofrecuencia precisables desde unos pocos mHz a varios kHz de amplitud de excitacin, con un control de fases de excitacin, desacoplamiento y deteccin mejor que medio grado sexagesimal.

Los hoy ya rutinarios mtodos de deteccin inversa y de seleccin de coherencias por medio de gradientes pulsantes de campo magntico han facilitado el diseo y la realizacin de todo tipo de experimentos estructurales y dinmicos, en una o varias dimensiones, para dilucidar cualquier detalle de molculas orgnicas, inorgnicas o bioqumicas. Por otra parte, la RMN en estado slido ha experimentado grandes progresos con el desarrollo de mtodos que van ms all de la rotacin de ngulo mgico, tales como los mtodos de doble rotacin puestos a punto por Pines. De este modo se han podido abordar por RMN los materiales slidos, cermicos, polimricos, etc. Pero, sin duda, es en las biociencias donde la moderna RMN tiene un futuro ms prometedor. Aparte de las ya clsicas determinaciones estructurales y dinmicas de biopolmeros (como las protenas), que todava hoy constituyen un reto importante en el caso de oligonucletidos de varias docenas de pares de bases, la RMN se ha usado ya con xito en estudios de metabolismo, tanto in vitro como in vivo, gracias a su carcter de tcnica no invasiva. Hace ya treinta aos de la observacin de seales de RMN de 31P correspondientes a diversos metabolitos fosforilados de gran importancia, como ATP, ADP, fosfocreatina, etc. Tambin son ya clsicos los estudios de pH intracelular monitorizados por medio del desplazamiento qumico de ciertas seales. Se han desarrollado mtodos de perfusin para el estudio de rganos en fluidos nutrientes apropiados, antenas para el estudio de elementos de volumen cercanos a la piel en seres vivos, pulsos de profundidad predeterminada para el estudio de zonas ms internas, etc. Finalmente, la RMN mdica, en la cual se mide casi siempre la seal del agua, es hoy una tcnica rutinaria en los hospitales para fines diagnsticos. Tambin es muy activo el campo de la espectroscopa localizada in vivo. Medio en broma, Bloch deca que el primer experimento de RMN in vivo lo haba efectuado l mismo, en 1946, poniendo su dedo en la sonda de su espectrmetro RMN, con lo que observ una seal de agua. Y entre los qumicos orgnicos veteranos es muy conocido un artculo de J. Org. Chem., de los aos sesenta, en que se describe el espectro de RMN de un ratn entero y vivo. Hoy, las aplicaciones de la RMN a las biociencias son de alcance cada vez mayor, pero tambin lo son en ciencia de materiales, en geologa (magnetmetros, sondas RMN para los pozos de petrleo), en la industria alimentaria (que usa la RMN protnica para medir el contenido en agua) e incluso en estudios agrcolas, en los que se puede usar la RMN como tcnica no invasiva para determinar el contenido de semillas y plntulas.

Conclusin: se acerca la RMN a la madurez? No es muy frecuente que una tcnica instrumental siga siendo objeto de tanta investigacin fundamental a los sesenta aos de su nacimiento. En el caso de la RMN, tras su infancia claramente marcada por la fsica, con Premios Nobel a Rabi (1944) y a Purcell y Bloch (1952), su adolescencia y juventud han estado claramente ligadas a la qumica, con Premios Nobel a Ernst (1991) y a Wthrich (2002). Dicen que la juventud es el perodo ms feliz de la vida. Si en su futura madurez la RMN cae finalmente en manos de los mdicos, que sin duda le amputarn su segundo adjetivo, siempre recordar con aoranza los agradables perodos en que se mantuvo unida a la qumica.