PRCTICAS DE MICROBIOLOGA OBJETIVOS: 1. Iniciacin en las tcnicas del estudio de mic oo !anismos" culti#o$ tincin % mo &olo!

'a( Mate ial necesa io" Culti#o de )acte ias$ le#adu as$ #ino a! iado( Anti)iticos( C istal #ioleta *+ ! de c istal #ioleta en +,, cc de a!ua destilada-( Lu!ol *+ ! de iodo en . ! de iodu o /ot0sico en +,, cc de a!ua destilada-( 1ucsina )0sica *+ ! de &ucsina )0sica en +,, cc de a!ua destilada-( Aceite de inme sin( Mic osco/io Po tao)2etos$ asas de culti#o$ mec3e o$ c0/sulas de Pet i$ tu)os de ensa%o( Pa/el secante(

+(4 I5TROD6CCI75 El tama8o de la ma%o 'a de las clulas )acte ianas es tal 9ue esultan di&'ciles de #e con el mic osco/io /tico( La / inci/al di&icultad es la &alta de cont aste ent e la clula % el medio 9ue la odea( El modo m0s sim/le de aumenta el cont aste es la utili:acin de colo antes( Si se desea sim/lemente aumenta el cont aste de las clulas /a a la mic osco/'a$ son su&icientes los / ocedimientos 9ue usan un solo colo ante llamados de tincin sim/le( Sin em)a !o$ a menudo se utili:an mtodos 9ue no ti8en de i!ual modo todas las clulas$ es el / oceso denominado tincin di&e encial( 6no mu% usado en mic o)iolo!'a es la tincin G am( Bas0ndose en su eaccin a la tincin G am$ las )acte 'as /ueden di#idi se en dos ! u/os" ! am/ositi#as % ! amne!ati#as( Esta tincin tiene ! an im/o tancia en ta;onom'a )acte iana %a 9ue indica di&e encias &undamentales

de la /a ed celula de las distintas )acte ias( Mient as 9ue las )acte ias ! amne!ati#as son constantes en su eaccin$ los mic oo !anismos ! am/ositi#os /ueden / esenta es/uestas #a ia)les en cie tas condiciones *son ! aml0)iles-( Po e2em/lo$ los culti#os #ie2os de al!unas )acte ias ! am/ositi#as /ie den la / o/iedad de etene el c istal #ioleta$ % en consecuencia$ se ti8en /o la sa& anina a/a eciendo como ! amne!ati#as( An0lo!o e&ecto se / oduce en ocasiones /o cam)io en el medio del o !anismo$ o /o li!e as modi&icaciones en la e2ecucin de la tcnica( Po este moti#o$ es / eciso atene se$ en la / 0ctica$ al / ocedimiento esta)lecido( Pa a e;/lica el mecanismo de la tincin de ! am se 3an / o/uesto #a ias 3i/tesis &undadas en la natu ale:a 9u'mica de las /a edes celula es de los mic oo !anismos( A9u' /uedes #e las di&e encias est uctu ales % 9u'micas de los dos ti/os de /a ed )acte iana" Pa ed G am <
ca/a densa % uni&o me de .,, a =,, A0cidos teicoicos /olisac0 idos / ote'nas */ocas #eces!lico//tido *>,? del /eso seco-

Pa ed G am 4
ca/a inte na del!ada de ., a @, A cu)ie ta /o ca/as e;te nas de densidad meno li/o/olisac0 idos li/o/ ote'nas / ote'nas !lico//tido *+,? del /eso seco-

El mecanismo de la tincin G am es la ese8ado en el si!uiente es9uema"

P oductos 9ue se utili:an

Reaccin % colo acin de las )acte ias GRAM < Clulas colo #ioleta GRAM 4 Clulas colo #ioleta Se &o ma el com/le2o CA4I( Las clulas continBan te8idas de colo #ioleta( Eliminacin /o e;t accin de ! asas de las /a edes celula es( Aumenta la /o osidad( El com/le2o CA4I se se/a a de la clula(

+- C istal #ioleta .- Lu!ol solucin iodada @- Alco3ol

Se &o ma el com/le2o CA4I( Las clulas continBan te8idas de colo #ioleta( Se des3id atan las /a edes celula es( Se cont aen los /o os( Disminu%e la /e mea)ilidad( El com/le2o CA4I no sale de las clulas 9ue continBan te8idas de colo #ioleta( C- Sa& anina Clulas no decolo adasD 9uedan te8idas de colo #ioleta(

Clulas decolo adasD se ti8en de colo osado(

.( TI5CI75 DE GRAM .(+ Mtodo .(+(+ E;tensin" En un /o ta )ien lim/io *con alco3ol$ /a/el de &ilt o % &lameado- se coloca una !ota de a!ua destilada a la 9ue( con el asa de siem) a$ / e#iamente este ili:ada a la llama$ se lle#a una /e9ue8a cantidad de sus/ensin de )acte ias o$ en su caso$ de una colonia( Con el asa se e;tiende la !ota % las )acte ias so) e el /o ta % se &i2a la e;tensin /o el calo $ calentando sua#emente a la llama del mec3e o 3asta 9ue se se9ue(

.(+(. Colo acin" a- + minuto en c istal #ioleta de EucFe (colorante inicial) )- se la#a con a!ua destilada c- + minuto en lu!ol (mordiente) d- se decolo a con alco3ol de G>H (decolorante) e- se la#a con a!ua destilada &- + minuto en &ucsina )0sica (colorante de contraste) !- se la#a con a!ua co iente 3- se seca suavemente % sin frotar con /a/el de &ilt o 6na #e: 9ue la / e/a acin est0 totalmente seca$ /one una !ota mu% /e9ue8a de aceite de ced o % o)se #a al mic osco/io con el o)2eti#o de inme sin(

.(.( Observacin De)e utili:a se el o)2eti#o de inme sin( Se coloca una !ota de aceite de ced o so) e la / e/a acin( Se en&oca$ / e&e entemente$ con el mic omt ico( Despu s de utili!ar el ob"etivo de inmersin debe limpiarse con #ilol

O)se #aciones eali:adas" antalas en tu cuade no IJu &o ma tienen las )acte ias o)se #adasK ILas )acte ias a/a ecen aisladas o a! u/adasK En caso de 9ue a/a e:can a! u/adas indica el ti/o de asociacin( Indica ti/o de G am(