AVIAN LEUKOPETTM

mtodo para el recuento total de glbulos blancos en aves.

Requerimiento de almacn En la sangre de aves los glbulos blancos difiere de la de mamferos en el predominio de leucocitos polimorfonucleares de heterfilos en lugar de neutrfilos. El resto de leucocitos aviares son linfocitos, monocitos y eosinfilos, y son morfologicamente similares a los homlogos en mamferos. Los heterfilos aviares se asemejan ms a eosinfilos que a neutrofilos. Como los heterofilos tienden a ser ms abundantes en la mayora de los casos, es til hacer una pasada visual del portaobjetos antes de empezar el conteo diferencial por orden para determinar las caractersticas especficas de heterfilos para una determinada especie de ave. Esto ayudar a diferenciarlos de eosinfilos. Para ms informacin respecto a la morfologa de las clulas aviares, hay un nmero de referencias disponible. Para un correcto recuento de clulas sanguneas en aves el mtodo debe poder teir selectivamente heterfilos y eosinfilos. Los heterfilos aviares y eosinfilos contienen ambos unos grnulos bien definidos que se tien de color rojo-naranja. Este mtodo utiliza 0,1 % de floxina y un a cmara de recuento Neubauer con cubres.

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Mantener los tubos en la oscuridad, en zona fra. La exposicin a la luz puede estropear la Floxina. PROCEDIMIENTO 1- Hacer un frotis de sangre por los mtodos habituales y una tincin de Wright Giemsa u otra tincin adecuada. 2- Proceder a un recuento diferencial de clulas sanguineas igual que para especies de mamferos sustituyendo neutrfilos por heterfilos. Anotar los resultados. 3- Aadir un limpiador con la pipeta de 25l con punta nueva. 4- Destapar el tubo de Floxina y colocarlo en una rejilla. 5- Utilizando la pipeta, aspirar 25 l de sangre anticoagulada. 6- Introducir la punta con la sangre en el tubo de floxina, aspirar y dispersar el contenido floxina/sangre al menos 6 veces, minuciosamente. IMPORTANTE: es un paso crtico y hay que asegurar que toda la sangre de la punta sea enjuagada para una correcta dilucin. Dependiendo de la viscosidad de la muestra puede requerir ms enjuagues de la punta. 7- Cerrar el tubo y para mezclarlo se invierte varias veces, sin agitacin. 8- En posicin vertical del tubo y dejarlo incubar 10-15 minutos, pero nunca ms de 1 hora. 9- Utilizando la punta enjuagada, aspirar una muestra del tubo y cargarla en la cmara de recuento. 10-Dejar 10 minutos para que las clulas se fijen. 11-Con el objetivo de 10X y contar heterfilos y eosinfilos. 12-Calcular en recuento total de leucocitos a partir de la siguiente frmula:

CONTENIDO DEL TEST 1. 0,1% de solucin floxina en tubos con tapn de rosca. 2. Pipetas Minipet de 25 l 3. Puntas de pipeta desechables.

Materiales adicionales requeridos Cmara Neubauer de recuento. Cubres para la cmara de recuento. Microscopio. Contador de clulas (opcional)

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MTODO DE NATT Y HERRICK

El mtodo de Natt y Herrick se trata de un mtodo directo de recuento de eritrocitos y leucocitos para aves y reptiles. Ya que la misma dilucin es utilizada tanto para glbulos rojos como blancos, el total de ambas clulas se puede obtener simultaneamente desde la misma carga en la cmara.

www.euroveterinaria.com Recuento de Leucocitos Totales

Como antes, la misma dilucin de 1:200 es utilizada para contar glbulos blancos. Se tien de color azul-prpura y pueden presentar alguna granulacin. Contar el nmero total de leucocitos en los nueve cuadros grandes de un lado de la cmara. De nuevo se contabilizan las clulas que toquen la pared superior y la izquierda y no los que solapen con las lneas inferior e izquierda. El clculo total de leucocitos requiere aplicar la siguiente frmula: Total leucocitos/l = (n leucocitos contados en 9 cuadros + 10% del total de leucitos) X 200

Materiales requeridos
-Solucin de Natt y Herrick -Cmara Neubauer -Filtro de papel (Whatman) -Pipeta hemocitomtrica de bola roja o mtodo alternativo para obtener una dilucin 1:200.

Solucin Natt & Herrick

Aadir en el siguiente orden: -3,88g Na2Cl -2,50g Na2SO4 -2,17g KH2 PO4 7H2O -7,5ml 37% formalina -0,10g violeta de metilo 2B (Sigma M4511) Disolver en agua destilada y diluir hasta un volume de 1000ml. Volumen final 1000ml a pH 7,3. Dejar una noche. Filtrar con el filtro de Whatman n2

Procedimiento
Examinar la solucin de Natt y Herrick y el filtro por hubiese alguna clase de precipitado. Con la pipeta de bola roja, diluir todo la sangre con la solucin de Natt y Herrick hasta una dilucin de 1:200. La dilucin tambin se puede obtener con pipetas estndar y microcapilares. Esperar 1-2 minutos antes de descargar la dilucin en la cmara de recuento. Y una vez depositado en el hemocitmetro dejar el contenido unos 3 minutos para que las clulas sediementen..

Recuento de Eritrocitos Totales

Utilizando el objetivo de 40X, contar el total de glbulos rojos (fciles de reconocer por su ncleo). Contar el nmero total de eritrocitos en cinco cuadros (cuadros de las esquinas y el cuadro central) Cuando un eritrocito se sita en mitad de las lneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sita en mitad de las lneas inferior y/o de la derecha. Multiplicar el total de clulas contadas por 10.000 y se obtiene el total de eritrocitos por microlito.

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