Manual de Métodos para La Evaluación Del Estado Fisiológico Del Pulpo Rojo Octopus Maya1

Manual de métodos para la evaluación
del estado fisiológico del pulpo rojo

Octopus maya
Honorio Cruz, Ariadna Sánchez, Carlos Rosas y Cristina Pascual
Laboratorio Central 1 Bioquímica, Inmunología y Biología Molecular”

UMDI, Fac. Ciencias, UNAM.
Sisal, Yucatán.
Manual de métodos para la evaluación del estado fisiológico del pulpo rojo Octopus maya
Índice
1.- Manejo de los organismos.........................................................................6

2.- Obtención de la sangre. ............................................................................. 7
3.- Evaluación de indicadores nutricionales sanguíneos....................9
4.- Metabolitos en plasma. .............................................................................10
5. Indicadores inmunológicos sanguíneos ...............................................17
6. Bioquímica de los tejidos; gónada, glándula digestiva y
músculo. ............................................................................................................... 25
7. Determinación de contenido energético; mediante la bomba
calorimétrica (Parr instrumens).................................................................. 29
8.- Bibliografia.................................................................................................... 33
9. Anexos.............................................................................................................. 36
Introducción.
En los últimos años se ha incrementado el interés por diversas especies de
cefalópodos, tanto en su cultivo (Iglesias et al., 2000; Iglesias et al., 2004; Rosas
et al., 2007), como en las ciencias biológicas y médicas por ser usados como
modelos biológicos (Boletzky and Hanlon, 1983; Rosas et al., 2007).
El pulpo rojo Octopus maya es un molusco con gran importancia económica,

ocupa el doceavo lugar en cuanto a la captura en zona litoral de la Península de
Yucatán y es cuarta pesquería más importante en el litoral del Golfo de México y
Caribe, además de ser una especie endémica.
Por tal motivo, se torna indispensable contar con herramientas de diagnóstico

que nos permitan establecer estrategias de monitoreo para conocer la respuesta
fisiológica integral en la que se encuentran los pulpos en diferentes condiciones
ambientales, tanto en el medio natural como en condiciones de cultivo.
El fuljo de materia y energía que mantiene un estado fisiológico integral ocurre

de manera simultánea e incesante entre el organismo y su entorno. Este flujo
comienza con la energía química contenida en a partir de los nutrimentos
(lípidos, carbohidratos y proteínas) y aportados en primera instancia por el
alimento. Esta energía se transforma en gradientes eléctricos, iónicos, osmóticos
y de concentración muscular, etc., indispensable para producir trabajo y
mantener la integridad estructural, además otros actividades como el
crecimiento y la reproducción (Hill, 1979). En este sentido, en cualquier
organismo la deposición movilización y utilización de los diferentes componentes
bioquímicos e inmunológicos es indispensable como parte del mantenimiento de
la homeocinesis.
Los avances en la bioquímica fisiológica en organismos marinos como crustáceos

decápodos ha permitido determinar que tanto los componentes de la hemolinfa,
como de otros estructuras, como el músculo y la glándula digestiva, reflejan el
aprovechamiento y el uso de la energía (Rosas et al 2001a; Rosas et al, 2001b;
Sánchez et al 2001; Pascual et al. 2006). En cuanto a los cefalópodos, estos han
sido objetos de diversos estudios, donde describen diversos patrones de
comportamiento en la composición bioquímica de los principales tejidos
(músculo, la glándula digestiva y gónada), con respecto a su hábitat,
crecimiento, desarrollo sexual y alimentación (Pollero et al., 1987; Clarke et
al., 1994; de Moreno et al., 1997; Rosa et al., 2002; 2004; 2005a; 2005b;
Otero et al., 2007; Seiro et al., 2006; Özogul et al., 2008; Cruz, 2009)
La sangre o hemolinfa es un tejido de transporte y reserva de nutrimentos

(carbohidratos, lípidos y proteínas), además del sistema de defensa. En este
contexto y dado que en la sangre se encuentran las moléculas nutricionales e
inmunológicas que son transportadas a los distintos tejidos internos, la
evaluación de componentes en la hemolinfa ha sido utilizada como un indicador
de los mecanismos de regulación en organismos expuestos a diferentes

condiciones (Ferraris et al 1986; Vinagre y Da Silva, 1992; Santos y Keller,
1993; Webster, 1996; Hall y van Ham, 1998; Racotta y Palacios, 1998; Rosas et
al 2001a; Rosas et al, 2001b; Sánchez et al 2001; Pascual et al. 2006).
Las proteínas, ocupan una posición central por ser la base para la formación de
enzimas, hormonas, hemocianina, componentes de la respuesta inmunitaria, y
además intervienen directamente en la construcción de tejidos (crecimiento), y
en la reparación y mantenimiento de éstos. Asimismo, son fuente de energía en
los procesos catabólicos y son esenciales en el metabolismo de carbohidratos y
lípidos. Dentro de las proteínas sanguíneas se encuentra la hemocianina (Ernst
F. J. van Bruggen 1980; Marianne E. et al., 1998; Fabrice Mouche et al., 1999),
macromolécula que tiene incorporado el cobre el cual funciona como un sitio
activo, cuya función es de tipo respiratorio por acarrear oxígeno y también actúa
como reserva de proteínas (Rainer y Brouwer, 1993; Van Holde et al., 2001).
Los lípidos son insolubles en agua, entre ellos, los triacilglicéridos, que son
ésteres de ácidos grasos y glicerina, representan la mayor fuente de energía y la
forma predominante de almacenamiento. Otro compuesto lipídico de importancia
es el colesterol, y es precursor de la vitamina D (controla la digestión y
almacenamiento del Calcio) y de hormonas esteroides. Aunque el conocimiento
de los sistemas de defensa de los cefalópodos está aún en una etapa inicial y se
desconocen muchos de la regulación de la respuesta inmune, en el presente
manual se presentan diferentes técnicas inmunológicas que, hoy por hoy, se han
aplicado en el pulpo rojo del Caribe Octopus maya. Entre los carbohidratos, la
glucosa es fuente de energía, y el lactato, producto del metabolismo de
carbohidratos, se asocia a condiciones de estrés, por la activación del
metabolismo anaerobio.
Son muy pocos los estudios sobre indicadores nutricionales sanguíneos en

moluscos cefalópodos (Heras and Pollero 1990; Malham et al., 1998; Águila et
al., 2007; Cruz, 2009). Sin embargo, en estos estudios se observó que los
metabolitos sanguíneos actúan, al igual lo observado en crustáceos, como
indicadores del estado fisiológico.
Aunque el conocimiento de los sistemas de defensa de los cefalópodos está aún

en una etapa inicial y se desconocen muchos de la regulación de la respuesta
inmune hay algunos estudios realizados hasta ahora en cefalópodos
componentes del sistema inmunológico (Auffret M. et al., 1994; Oubella R. et al,
1993).
Estos estudios señalan que los hemocitos, es decir, las células sanguíneas,
presentan capacidad fagocítica, de encapsulación y neutralización de sustancias
extrañas, y que también participan en procesos de inflamación y regeneración de
heridas (Beuerlein et al., 2002). En invertebrados, la amplificación de la
respuesta inmunológica está directamente relacionada al sistema
profenoloxidasa (ProFO) (Hernández-López et al., 1996; Gollas-Galván et al.,
1999) y el sistema de coagulación (Montaño-Pérez et al., 1999) presentes en

estas células. El sistema ProFo, al activarse, genera algunos factores que
estimulan a los hemocitos para que eliminen el material extraño (Söderhäll y
Häll, 1984; Sung et al., 1998).
Durante el proceso fagocítico, se origina el fagolisosoma, además de liberarse

sustancias líticas biológicamente muy reactivas como el peroxido y el superóxido
(Muñoz et al., 2000; Campa-Córdova et al., 2002); este proceso se conoce como
estallido respiratorio y juega un papel central en la actividad microbicida de los
hemocitos. Las aglutininas son el componente humoral mejor estudiado en
cefalópodos; y en éste, las lectinas de la hemolinfa intervienen al reconocer y
aglutinar una variedad de eritrocitos de vertebrados así como de bacterias
patógenas (Fisher y Dinuzzo, 1991).
Con todo lo anterior, el presente manual se ha elaborado con el objeto de poner a

la disposición, a estudiantes y profesionales, una serie de métodos
estandarizados para la evaluación de diversos componentes tanto de la
hemolinfa, como de otros estructuras, como el músculo y la glándula digestiva,
en la que su integración permita un conocimiento integral de la bioquímica
fisiológica de los organismos sujetos a estudio. En estos métodos se incluyen
aspectos que intervienen en su correcta evaluación, desde el manejo de los
animales, obtención y procesamiento de muestras, hasta la forma en que se
deben procesar los datos.
1.- Manejo de los organismos.

a) Material.
o Contenedores de 100 L (depende del tamaño del pulpo).

o Contenedores (20 L). (depende del tamaño del pulpo).
o Red de mano.
o Bombas de aireación.
o Termómetro.
o Contenedores de hielo.
b) Fundamento.
El manejo antes de la toma de muestra de sangre es un aspecto crucial en este

tipo de análisis. Esto se debe a que la manipulación en si misma puede alterar,
de manera significativa, los componentes sanguíneos.
Por esta razón antes de la extracción de la sangre, los pulpos se deben de

introducir en un baño frio (16 ° C por debajo de la temperatura inicial) que
funcionará como anestesia termal para reducir su metabolismo (se adormece) y
prevenir que algunos de los metabolitos plasmáticos, como la glucosa y el
lactato, no sean alterados rápidamente por la manipulación.
El tiempo de exposición a este baño termal depende del tamaño de los

organismos. En pulpos de 300 a 1000 g el tiempo es de 3 a 4 minutos mientras
que en pulpos menores 200 g se mantienen por 2 o 3 minutos en el baño frío.
a) Procedimiento
Monte el sistema en el cual permanecerán los pulpos. Dependiendo del número y

tamaño de los organismos son los contenedores donde estos serán colocados:
para el caso de pulpos de menores de 200 g se recomiendan contenedores de 50
L, y para mayores de este peso, contenedores de 100 L.
Se requiere llenar los contenedores a la mitad de su capacidad y mantenerlos

con aireación (Fig. 1a). Cabe mencionar que es importante cuidar que el volumen
de agua sea suficiente ya que ayuda a evitar que los organismos salgan.
Es muy importante manipular a los pulpos en la menor medida posible por lo

que al introducir los pulpos en los contenedores deben colocarse con suavidad
ya que podrían estresarse y arrojar su tinta.
Es necesario tomar por completo al pulpo ya que se podría adherir fuertemente

al contenedor.
Prepare el contenedor de 20 L donde será transportado

tra sportado el organismo al
laboratorio donde se harán las evaluaciones sanguíneas. Pasar el pulpo al
contenedor como ya se describió anteriormente.
Una vez tra

ransportado
tado al laboratorio, tome la temperatura del medio en ell que ha
sido mantenido el pulpo.
pulpo En un recipiente de 20 L,L lleno con 15 L de la misma
agua de mar,
mar, coloque los contenedores con hielo hasta que se llegue a una
temperatura 12 ° centígrados menor que la temperatura de mantenimiento. Es
importante mantener esta temperatura en todo el muestreo. Se recomienda enda
preparar dos contenedores para la anestesia termal por si algún pulpo llegará áa
arrojar tinta.
a) b)
Figura 1.. Sistema
Sistema de aclimatación de los organismos en el laboratorio:
laboratorio contenedores de 10
1000L
(1), con aireación (2).
(2) b) manejo
ejo del pulpo.
Una vez alcanzada la temperatura deseada

deseada, se coloca suavemente al pulpo en el
contenedor de anestesia
anest termal y con un cronómetro se toma el tiempo de
permanencia deldel pulpo en esta condición (Fig. 2a). Paralelamente, s
se monitorea
onitorea
la respuesta del pulpo: pasado un minuto
minuto, se toma con las manos al pulpo y si
pone resistencia,
resistencia se le deja otro
otros tres minutos.
minutos Es s importante monitore
monitorear
continuamente al pulpo porque si se pasa del efecto de la anestesia termal,
morirá y no se podrá extraer la sangre.
sangre Una vez adormecido el pulpo
pulpo, se extrae
del contenedor y se envuelve los brazos con una franela,
franela quedando só
sólo la cabeza
expuesta (Fig. 1b). Posteriormente se coloca al pulpo en la charola de disección
para la extracción de la sangre.
2. Obtención de la sangre.
2.-
o Cinta teflón
a) Material o Mango de bisturí y n
navaja
avaja de
bisturí No. 11
o Catééteres
es Marca Punzocat: No. o Puntas para micropipeta 100 a
24 G * 3/4" (20 mm) y No. 22 G * 1000 µl y de 20 a 200 µl.
3/4"(25 mm).
mm) o Tubos Eppendorf de 1.5 ml.
ml
o Catéter
Catéter de alimentación o Franelas de algodón.
(diámetro externo 2.67 mm) o Estuche de disección.
o Viales estériles de 10 ml o Plancha de disección.
o Toallas secantes.
o Cronómetro. b) Equipo
o Alcohol al 70 %.
o Agua de mar filtrada. o Una micropipeta de 100 a 1000
o Gradillas con hielo µl y
o Guantes o Dos micropipetas de 20 a 200 µl.
Procedimiento.
Antes de cada pulpo muestreado, el material debe ser enjuagado con alcohol al 70 %.
El proceso de extracción sanguínea requiere de dos personas, una quien sujeta al
pulpo, y la otra, quien realiza la disección requerida para la obtención de sangre.
Cabe mencionar que la persona que sujeta al pulpo, coloque a éste en forma semi-
inclinada para así evitar que pierda el agua contenida en el manto.
La disección se realiza en la zona central adyacente a la parte frontal del pulpo. En

ese sitio se toma el manto con unas pinzas de ratón y, cuidadosamente con el bisturí
se hace un pequeño corte longitudinal. Posteriormente se van cortando las capas del
músculo del manto, hasta que se llega a la última capa, una capa muy delgada, a
través de la cual se hace visible la aorta principal. En ese punto, con unas tijeras se
corta la ultima capa de la dermis dejando al descubierto los órganos y la aorta
principal (fig. 2b). Una vez encontrada la aorta, se obstruye con unas pinzas de
presión con lo cual se mantiene el pulso, y con ello, el flujo de sangre.
Posteriormente, se introduce el catéter y se conecta al catéter de alimentación el cual
dirige la sangre al tubo colector estéril de 10 ml.
Es importante mencionar mientras se extrae la sangre, se debe dar un ligero masaje

por debajo de la cabeza del pulpo, lo cual ayuda a bombear la sangre (fig. 2c). El
tiempo máximo para la obtención de sangre es de 4 minutos. Una vez extraída la
sangre se distribuye para las diferentes evaluaciones en tubos Eppendorf de 1.5 ml y
se conserva en frio (2-8 °C).
Figura 2. a) pulpo en proceso de anestesia termal, b) corte del músculo del manto, c) extracción de la
sangre con cateter.
3.- Evaluación de indicadores nutricionales sanguíneos.

3.1 Hemocianina.
a) Material: b) Equipo:
o Cajas de puntas para o Micropipetas de 2 a 20 µl y 100 a

micropipeta de 2 a 20 µl y 100 a 1000 µl.
1000 µl. o Espectrofotómetro con lámpara
o Agua destilada. UV (absorbancia 335 nanómetros
o Tubos Eppendorf. nm).
o Papel secante. o Cubetas Ultravioletas (UV) para
o Contenedor de desechos. espectrofotómetro.
Se prende el espectrofotómetro se ajusta a 335 nanómetros (nm). Posteriormente se

coloca una celda de UV de 1 ml en el espectro la cual deberá contener 990 l de agua
destilada, y se calibra a cero de absorbancia.
Se debe de tener cuidado de no tocar con los dedos los lados de la celda de UV por
donde pasa la radiación (Fig. 3).
No tocar
Figura 3. Celda de UV de 1 ml y espectrofotómetro.
Se toman 10 l de la sangre con una micropipeta y se diluyen en 990 l de agua

destilada contenidos en un tubo Eppendorf. Posteriormente se coloca en la celda para
UV, se revisa que ésta no tenga manchas de dedos ni burbujas, y se coloca en el
espectro. Se anota el valor obtenido. Este procedimiento se hace por triplicado.
c) Cálculo:
Se realiza un promedio de las réplicas de la muestra.

La concentración de hemocianina (Hc) se calcula utilizando el coeficiente de extinción
 =17.26.
Ejemplo: Replicas: 0.327, 0.328, 0.330 = promedio 0.328, entonces:

Hc = (0.328/17.26) * FD
Donde:
FD = Factor de Dilución. Si se utilizaron 10 l en 990 l, entonces 1000/10 = 100.
Por lo tanto: Hc = (0.328/17.26) * 100 = 1.378 mmol/L
4.- Metabolitos en plasma.

4.1- Obtención del plasma.
a) Material:
b) Equipo:
o Tubos Eppendorf (0.5 ml)
o Gradillas con hielo. o Micropipetas de 2 a 20 µl y 100 a
o Puntas para micropipeta 20 a 1000 µl.
200 µl y de100 a 1000 µl. o Centrifuga refrigerada.
o Contenedor de desechos.
Las muestras se centrifugan a 800 g (2500 revoluciones por minuto (rpm)) por 5
minutos a 4 °C. Posteriormente se retira el sobrenadante (plasma), introduciendo
lentamente la punta de la micropipeta sin tocar el paquete celular, el cual para este
tipo de análisis no interesa. El plasma se deposita en tubos Eppendorf nuevos y
marcados con la misma secuencia de números que se siguió desde la extracción de la
sangre. Las muestras de plasma siempre deben mantenerse a una temperatura de 2-
8 °C., y deben realizarse el mismo día que se obtiene la sangre.
4.2.- Fundamento de cuantificación de metabolitos.
La cuantificación de la glucosa, lactato, colesterol, triglicéridos y proteínas se llevan a

cabo con Kits comerciales, a través de los cuales se evalúan colorimétricamente
reacciones enzimáticas, a excepción de las proteínas, en las que no se cuantifican
reacciones enzimáticas, sino la reacción de enlaces químicos de una solución acídica
de color (Azul Coomassie) por la presencia de proteínas. El principio para todos los
metabolitos se basa en los cambios de color diferencial, identificados
espectrofotométricamente a través de la absorbancia de la solución en la longitud de
onda correspondiente y registrada en densidades ópticas.
a) Proteínas totales solubles.
Se determina la concentración de proteínas solubilizada a través de una solución

acídica de color, el azul Coomassie, el cual se liga a los aminoácidos primariamente
básicos y aromáticos, especialmente la arginina. La absorbancia máxima para esta
solución ocurre de 465-595 nm, cuando sucede el enlace con proteínas.
b) Triglicéridos.
El glicerol liberado en la hidrólisis de los triglicéridos, por la acción de la lipoproteín-

lipasa, se convierte, mediante la glicerol-3-fosfato, que se oxida por la glicerol-fofato
oxidasa en dihidroxiacetona y peróxido de hidrógeno. Ante la peroxidsa, el peróxido
de hidrogeno oxida al cromógeno 4-aminoantiripina/p-clorofenol, en un compuesto
de color naranja pálido.
c) Colesterol.
Los ésteres del colesterol son hidrolizados por el colesterol éster hidrolasa para
liberar colesterol y ácidos grasas. El colesterol libre existente, conjuntamente con el
producido por el colesterol oxidasa a.
a) Glucosa.
La glucosa es transformada por la glucosa oxidasa en ácido glucónico y peróxido de

hidrogeno; éste último, en presencia de peroxidasa, oxida el sistema cromógeno (4-
aminofenazona/fenol) convirtiéndolo en un compuesto de color rosa.
a) Lactato.
El acido láctico es convertido a piruvato y peróxido de hidrógeno (H2O2) por la lactato

oxidasa. En la presencia de H2O2 formando, la peroxidasa cataliza la condensación
oxidativa de cromógenos que produce un color violeta.
4.3.- Uso de Kits.
Los Kits de glucosa (ELITech GPSL-5505), colesterol (ELITech CHSL-5505), y

triglicéridos (ELITech TGML-5415), cuentan con el reactivo listo para ser usado. Sin
embargo, con respecto al lactato y proteínas, el procedimiento cambia. En el lactato
(Trinity 735-10), se adicionan 10 ml de agua libre de pirógenos (agua estéril, la cual
puede encontrarse en las farmacias como agua inyectable) en el frasco y se disuelve.
Para las proteínas, es necesario diluir el reactivo (Proteína BIO-RAD-500-0006) en
agua libre de pirógenos, en una proporción de 1:4. Por ejemplo, si se desea preparar
un total de 250 ml, se necesitan diluir 50 ml de reactivo madre en 200 ml de agua
libre de pirógenos. Posteriormente se filtra, con filtro Whatman (0.2 µ de diámetro de
poro), con ayuda de una bomba de vacío.
Antes de realizar las evaluaciones, es importante verificar la fecha de caducidad

marcada en la etiqueta externa del kit; y una vez preparado el reactivo, marcar la
fecha de preparación y caducidad. Es necesario mantener los reactivos de acuerdo
con las instrucciones del fabricante (Tabla 1).
4.4.- Evaluación.
a) Material: o Guantes.
o Cronómetro.
o Puntas para micropipeta de 2-20 μl. o Plantillas de referencia.
o Puntas para Micropipeta de 100- o Canaletas para multicanal para los
1000 μl. reactivos.
o Tubos Eppendorf de 0.5 ml y 1.5 ml o Gradillas con hielo.
(nuevos).
o Gradilla para tubos Eppendor. b) Equipo:
o Placas de hielo.
o Puntas para micropipeta de o Micropipeta de 2-20 μl.
repetición. o Micropipeta de 100-1000 μl.
o Microplacas para lector de ELISA o Micropipeta de repetición.
(Essay Link Immunology Specific o Espectrofotómetro de Microplacas.
Antibody). o Vórtex.
c) Procedimiento:
Antes de comenzar las evaluaciones es necesario atemperar las soluciones reactivas

de los kits. Una vez obtenido el plasma, colocar en una microplaca para el lector de
ELISA:
10 µl de muestra + 200 µl de solución reactiva (kit):

Tiempo de incubación Lectura en el lector de microplacas.
Es decir, se colocan 10 µl de la muestra de plasma en un pozo (cada muestra por

triplicado). Posteriormente se añaden 200 µl de solución reactiva (kit), se espera el
tiempo de incubación y se lee la absorbancia en un espectrofotómetro de microplacas
(fig. 4). Con una pipeta de repetición se pueden dispensar los 200 µl lo cual reduce el
tiempo empleado en el llenado de los pozos de la microplaca, sobre todo si se
considera que la evaluación colorimétrica de cada uno de los metabolitos, tienen un
límite de tiempo de incubación, mismo que es necesario medir con precisión.
Fig. 4. Lector de microplacas (Benchmark Biorad).

Es importante mencionar que para evaluación de las proteínas, se requieren tomar 5

µl del plasma y diluirlo en 2 ml de agua libre de pirógenos, esto se realiza en un tubo
Eppendorf de 2 ml. Dependiendo la concentración de proteínas que contenga el
plasma se realizará otra dilución, por ejemplo, si las densidades ópticas están por
debajo de los valores registrados para la menor concentración de la curva patrón, se
realizará otra dilución aumentando la cantidad de muestra, por ejemplo, 10 µl en
2000 µl.
Tabla 1. Uso de reactivos.
Solución Tempo de la Estabilidad Longitud de Tiempo de caducidad del reactivo

reactiva reacción de la onda preparado.
(minutos) reacción (nm)
(minutos)
La fecha que indica la caja,
Glucosa 2 60 500 manteniéndolo en 2-8 °C y
protegido de la luz
Lactato 10 10 540 8 horas 18-26 °C; 7 días 2-8 °C;

30 días congelado.
La fecha que indique la caja, de 5-

Colesterol 5 60 500 7 días si se almacenan 4 °C, -20
°C 3 meses y varios años a -70
°C.
La fecha que indique la caja, de 5-
7 días si se almacenan 2-8 °C, -
Triglicéridos 7 60 500 15-20 °C 3 meses y varios años a
-70 °C.
Proteínas 5 60 595 60 días 4 °C; 2 semanas a 15-25

°C
Además de la muestras de plasma que se van a evaluar, se debe adicionar en la

microplaca, un blanco y una curva patrón para cada metabolito. Al considerar un
blanco se elimina la absorbancia que presentan las sustancias ajenas a la reacción
colorimétrica del metabolito con el reactivo. Como blanco se usará agua libre de
pirógenos, en particular para proteínas, debido a la dilución que se realiza para su
evaluación.
La curva patrón es un procedimiento técnico indispensable que permite cuantificar la

concentración total final de cada uno de los metabolitos. Está integrada por una serie
de seis diluciones, que van de una concentración menor a una mayor, y que se
preparan a partir de una solución estándar, que no es más que el sustrato sobre el
cual actúan las enzimas contenidas en la solución reactiva del kit.
Al adicionar la solución reactiva a las diluciones preparadas con el estándar de

acuerdo con las concentraciones consideradas en la curva patrón, se espera que los
valores de la densidad óptica obtenida una vez que ocurre la reacción colorimétrica,
sean directamente proporcionales al valor de concentración de la dilución (la forma
de verificar este comportamiento se explica en la parte de cálculos).
Por ello, a través de la evaluación de la reacción de las diluciones de la curva patrón

con la solución reactiva del kit, es posible valorar la estabilidad de ésta, por ejemplo,
si las densidades ópticas obtenidas de las diluciones que integran la curva patrón no
tienen un comportamiento de aumento proporcional conforme aumenta la
concentración de la solución estándar, o bien, si no hay reacción colorimétrica,
entonces hay indicios de alteración en la solución reactiva del kit. Por ello, es
necesario correr la curva patrón para cada uno de los metabolitos al momento de
realizar las evaluaciones en la placa.
En el anexo 1 presenta la relación de concentraciones requeridas y las diluciones a

preparar para cada curva patrón. Los kits de glucosa, colesterol y acilglicéridos
cuentan con la solución estándar. Para el caso de proteínas y lactato, la solución
estándar se adquiere aparte. Para las proteínas es albúmina bovina (Sigma A-7906 o
Pierce-23209, este último viene específicamente en la concentración deseada); y para
el lactato, la solución de referencia tiene el número de catálogo: Trinity 826-10.
A continuación se muestra un esquema de la plantilla de referencia de una

microplaca de lector de ELISA con un formato de ubicación de los tres elementos que
se consideran en el procedimiento: blanco, curva patrón y muestras (en el caso de
que fueran 5 pulpos muestreados):
Blanco
Curva patrón
Muestras (1-5)
En el esquema se observa que se tienen tres repeticiones por cada elemento

considerado, sin embargo, una vez que el error manual de pipeteo disminuye, se
pueden realizar sólo dos repeticiones. En el caso de las proteínas y los triglicéridos,
se recomienda hacer las tres repeticiones.
Es necesario recalcar la importancia que tienen las plantillas de referencia, estas son
usadas para llevar un orden y para evitar una confusión en los pozos de la
microplaca, estas se rotulan y se colocan abajo de la microplaca.
Si las muestras a evaluar exceden los pozos de la microplaca, debe de repetirse el

blanco en la nueva microplaca. Por otro lado, si no se cuenta con un
espectrofotómetro de microplacas, las evaluaciones se pueden realizar en un
espectrofotómetro convencional, siguiendo los pasos que marca el instructivo para
cada kit clínico.
4.5.- Cálculo.
Como ejemplo de los cálculos a realizar, a continuación se presenta el procesamiento

de datos de proteínas obtenidos en un muestreo llevado a cabo en adultos de pulpo
rojo del Caribe (Octopus maya). Se realizó una dilución de 5 µl en 2 ml de agua libre
de pirógenos.
a) Valores obtenidos (Densidades ópticas).
Como primer paso, es necesario llevar a cabo una regresión lineal con el promedio de
los valores de densidad óptica obtenidos en la curva patrón, a los cuales se les resta
el valor promedio del blanco.
Valores obtenidos en la curva patrón
Concentraciones Densidades ópticas de la curva Densidades Promedios de

ópticas del densidades ópticas
Curva patrón Repeticiones Promedios blanco
(mg/ml) Repeticiones Curva – blanco
0.402 0.406 0.405 0.404
0.05 0.480 0.482 0.500 0.487 0.336 0.404
0.1 0.339
0.2
0.617 0.616 0.625 0.619
0.338
0.487
0.3 0.743 0.759 0.773 0.758 0.338 0.619
0.4 0.858 0.896 0.909 0.888 0.758
0.5 1.050 1.025 1.021 1.032 0.888
1.032
b) Verificación estadística y comportamiento matemático de los valores

obtenidos en la curva patrón.
Como ya se mencionó, se espera que los valores de las densidades ópticas obtenidas
en cada una de las concentraciones consideradas en la curva patrón, sean
directamente proporcionales al aumento en la concentración del estándar.
Por ello, al correr la regresión, se tiene que verificar el coeficiente de correlación

múltiple (preferentemente no debería ser menor a 0.98), y el valor de significancia de
la regresión (valor crítico de F ≤ 0.05).
En caso de que el valor de correlación sea menor a 0.98, se requiere corre una nueva
curva patrón. Además de estos índices, como resultado de la aplicación de la
regresión se obtienen el valor del intercepto y la pendiente (variable x1),
indispensables para el cálculo de la concentración final del metabolito a evaluar.
Estadística de regresión
Variable X 1 Curva de regresión ajustada
0.800
Coeficiente de correlación
0.700
Densidades opticas
múltiple. 0.9997
0.600
Análisis de varianza:
Valor critico de F. 0.500
Intercepto. 0.00001 0.400
Variable X1(dependiente) 0.0342 0.300
1.3757 0.200
0.100
0.000
0 0.2 0.4 0.6
Concentraciones
c) Análisis final.
Una vez verificado el comportamiento de los datos, el cálculo de la concentración final

debe realizarse a partir de la ecuación de la recta:
Donde:
a= intercepto y = a + bx
b= pendiente
x= concentración (mg/ml)
y= valores de densidad óptica (DO)
Considerando los datos obtenidos en la ecuación de la recta, entonces:
Concentración = ((DO muestra – DO blanco) – (intercepto) / pendiente) (FD)
DO = Densidades ópticas (valores promedios).

FD = Factor de dilución, para el caso de proteínas 5 µl de plasma + 2 ml de agua libre
de pirógenos; FD = 401.
La concentración para todos los metabolitos (glucosa, lactato, colesterol, triglicéridos

y proteínas) se expresa en mg/ml.
Valores obtenidos:
Muestras Replicas (DO) Promedio

Blanco 0.336 0.339 0.338 0.338
Calculo:
Prom-
mg/ml
Blanco
1 0.878 0.88 0.875 0.878 0.540 154.803

2 0.970 0.969 0.975 0.971 0.634 181.861
3 0.830 0.835 0.833 0.833 0.495 141.803
4 0.910 0.900 0.951 0.920 0.583 167.128
5 0.843 0.841 0.843 0.842 0.505 144.596
Como ya se mencionó, este ejemplo corresponde a la evaluación de proteínas, y se

llevaron a cabo tres repeticiones, y una dilución de 5 µl de plasma en los 2000 µl de
agua libre de pirógenos. En caso que las réplicas no se comporten como tal, se
elimina el valor alejado de los otros dos.
5. Indicadores inmunológicos sanguíneos

Como ya se mencionó en el capítulo 2, correspondiente a “Obtención de sangre”, una
vez extraída la sangre del pulpo se distribuye en tubos Eppendorf (1.5 ml) para las
diferentes evaluaciones, algunas de las cuales corresponden a las inmunológicas:
 Conteo de hemocitos
 Actividad de Fenoloxidasa
 Estallido Respiratorio
 Hemaglutinación
5.1 Manejo de la hemolinfa: Obtención de plasma y degranulado de hemocitos
a) Material: b) Reactivos:
o Puntas nuevas para micropipeta o Solución anticoagulante.

de 2-20 μl. o Cacodilatos.
o Puntas nuevas para Micropipeta o Agua estéril inyectable.
de 100-1000 μl.
o Tubos Eppendorf de 1.5 ml. c) Equipo:
o Gradilla congelada para tubos
Eppendor. o Micropipeta de 2-20 μl.
o Contenedor de desechos. o Micropipeta de 100-1000 μl.
o Guantes. o Centrífuga refrigerada.
Algunas evaluaciones inmunes se realizan en plasma y otras en degranulado de

hemocitos, por lo que, como primer paso, previo a su evaluación, es necesario
separar el plasma. Como se especifica en el apartado 4.1 del capítulo de
“Evaluaciones nutrimentales sanguíneas” , la hemolinfa se centrifuga a 800 g (2500
revoluciones por minuto (rpm)) por 5 minutos a 4 °C, y el sobrenadante (plasma) se
retira cuidadosamente, sin tocar el paquete celular, y se coloca en un tubo Eppendorf
(1.5 ml).
Posteriormente, al paauete celular obtenido al separar el plasma, se le agrega

suavemente, solución anticoagulante (anexo 2), en el mismo volumen que la
hemolinfa tomada.
Se centrifuga a 800 g por 5‘a 4 °C. Se desecha sobrenadante y se adiciona

amortiguador de cacodilatos en el mismo volumen de hemolinfa. Se resuspende el
paquete celular varias veces (al desagregarse el paquete celular, la solución se torna
turbia). Se centrifuga a 2460 g por 5’ a 4 °C. Se toma sobrenadante y se colocar en
un tubo Eppendorf de 1.5 ml.
5.2 Conteo de hemocitos.
a) Material.
b) Reactivos.
o Puntas para micropipeta de 2-20 μl.
o Puntas para Micropipeta de 100- o Alsever.
1000 μl. o Formol.
o Tubos Eppendorf de 0.5 ml o Alsever formol 10 %.
o Gradilla para tubos Eppendorf.
o Guantes.
c) Equipo.
o Micropipeta de 2-20 μl.

o Micropipeta de 100-1000 μl.
o Vórtex
o Cámara Neubauer .
o Microscopio óptico
Para el conteo de hemocitos, se toma directamente un volumen de muestra de

hemolinfa y se mezcla en tres volúmenes de solución Alsever-formol 10 % (Anexo 2).
Las muestras se refrigeran en 2-8 °C, hasta su análisis. El conteo de los hemocitos se
realiza en una cámara Neubauer y en microscopio óptico en objetivo 40x.
5.3 Actividad de Fenoloxidasa (FO)
El sistema fenoloxiddasa, se determina evaluando espectroscópicamente la oxidación

de la L-hidroxi-fenilalanina (L-DOPA), de acuerdo a Leonard et al (1985), modificada
por Hernández-López et al (1996). La evaluación de la fenoloxidasa requiere la
conversión de la profenoloxidasa (proFO) a su forma activa, fenoloxidasa (FO). El
sistema profenoloxidasa se encuentra en compartimentos, principalmente en las
células granulares, por lo que el contenido granular de estas células, se obtiene
lisándolas (degranulado de hemcitos). Sin embargo, en el caso del pulpo, se evalúa la
actividad total de fenoloxidasa tanto en degranulado de hemocitos como en el
plasma, y la actividad con tripsina endógena (degranulado + plasma)
a) Material
o Solución anticoagulante (anexo 2)
o Puntas para micropipeta de 2-20 o Cacodilatos (anexo 2)
μl. o Tripsina(2.5 mg mL-1, en agua
o Puntas para Micropipeta de 100- estéril inyectable)
1000 μl. o L-DOPA (3 mg mL-1, en agua estéril
o Tubos Eppendorf de 1.5 ml inyectable)
o Gradilla congelada para tubos o Agua estéril inyectable
Eppendor.
o Contenedor de desechos c) Equipo
o Microplacas estériles de 96 pozos
fondo plano. o Micropipeta de 2-20 μl.
o Guantes o Micropipeta de 100-1000 μl.
o Centrífuga refrigerada
b) Reactivos. o Espectrofotómetro de microplacas
a) Actividad de Fenoloxidasa (degranulado de hemocitos).
Procedimiento:
o Dispensar 50 L plasma en microplaca de 96 pozos fondo plano estéril

o Añadir 180 L de L-DOPA
o Incubar 10’ a 25 °C ± 2 °C.
o Leer a 490 nm en el lector de ELISA.
o Registrar lectura también a los 20 y 30 minutos.
Blanco: 5’
50 ul plasma + 180 ul agua estéril Lector de ELISA 490 nm
Muestra 5’
50 ul plasma + 180 ul L-DOPA Lector de ELISA 490 nm
b) Actividad total de Fenoloxidasa (plasma y degranulado de hemocitos)
Procedimiento:
Plasma:
o Dispensar 50 L plasma en microplaca de 96 pozos fondo plano estéril

o Dispensar 50 L de tripsina
o Incubar 5’ a 25 °C + 2 °C
o Añadir 180 L de L-DOPA
o Incubar 10,
Degranulado de hemocitos:
o Dispensar 50 L degranulado en microplaca de 96 pozos fondo plano estéril.

o Dispensar 50 L de tripsina.
o Incubar 5’ a 25 °C + 2 °C.
o Añadir 180 L de L-DOPA.
o Incubar 10,
Blanco:
5’ 10’
50 ul plasma + 50 ul tripsina 180 ul agua estéril Lector de ELISA
490 nm.
5’ 10’
50 ul DH + 50 ul tripsina 180 ul agua estéril Lector de ELISA
490 nm.
Muestra:
5’ 10’
50 ul plasma + 50 ul tripsina 180 ul L-DOPA Lector de
ELISA 490 nm.
5’ 10’
50 ul DH + 50 ul tripsina 180 ul L-DOPA Lector de ELISA 490
nm.
c) Actividad de Fenoloxidasa con tripsina endógena (degranulado + plasma)
Procedimiento:
o Dispensar 50 L plasma en microplaca de 96 pozos fondo plano estéril.

o Dispensar 50 L de degranulado.
o Incubar 5’ a 25 °C + 2 °C.
o Añadir 180 L de L-DOPA.
o Incubar 10,
Blanco:
5’ 10’
50 ul plasma + 50 ul DH 180 ul agua estéril Lector de ELISA
490 nm.
Muestra:
5’ 10’
50 ul plasma + 50 ul tripsina 180 ul L-DOPA Lector de ELISA
490 nm.
Para las tres evaluaciones de actividad de fenoloxidasa, los valores se expresan en

Densidad óptica (DO).
Importante:
 El L-DOPA se oxida fácilmente y se afecta con la luz, por lo que se prepara el

mismo día que se va a utilizar y se guarda en una botella opaca. Se prepara
con agua libre de pirógenos y con la micropipeta se mezcla 30 veces.
 Durante el procedimiento debe tenerse cuidado en mantener las muestras en
2-8°C. Se mantienen estables en esa temperatura hasta 12 horas.
5.4 Estallido respiratorio - Detección del anión superóxido.
El estallido respiratorio es un proceso oxidativo asociado a la fagocitosis, en el que

varios radicales tóxicos de oxígeno son generados para destruir al patógeno invasor
que está siendo ingerido por las células inmunitarias. La producción del anión
superóxido es cuantificado por la técnica espectrofotométrica de reducción del
Nitroblue Tetrazolium (NBT), de acuerdo al protocolo optimizado por Hérnandez-
López (2001). El test optimizado de microplacas de NBT se basa en la cuantificación a
630 nm de formazán solubilizado por KOH/DMSO mejorando la sensibilidad y
exactitud de la cuantificación. La tasa de producción del 02, se obtiene dividiendo el
valor de la absorbancia de la muestra estimulada, por el valor de la absorbancia de la
misma muestra sin estimulación.
Al momento del muestreo se requieren tubos Eppendorf conteniendo Alsever. El

factor de dilución es 1:1. Por cada muestra se hacen triplicados, de tal modo que se
tengan tres pozos para actividad básica y tres pozos para actividad de células
estimuladas, por lo tanto, el volumen de sangre requerido para tres repeticiones de es
800 l, para dos, 1100 l, y sólo una repetición, 600 l.
a) Material o Hanks (anexo 2)

o Zimosán(2 mg mL-1)
o Puntas para micropipeta de 2-20 o Nitroblue tetrazolium (NBT)
μl. o Metanol al 70 %
o Puntas para Micropipeta de 100- o Dimetyl sulfóxido (DMSO)
1000 μl. o Hidroxido de Potasio 2 M (KOH)
o Tubos Eppendorf de 1.5 ml o Agua estéril inyectable.
o Gradilla congelada para tubos
Eppendor. c) Equipo
o Contenedor de desechos
o Microplacas estériles de 96 pozos o Micropipeta de 2-20 μl.
fondo plano para cultivo celular. o Micropipeta de 100-1000 μl.
o Guantes. o Centrífuga refrigerada
o Espectrofotómetro de
b) Reactivos microplacas
o Alsever (anexo 2)
Procedimiento:
Se dispensan 250 l de la muestra de hemolinfa diluida en Alsever en una microplaca

de 96 pozos para tejido celular estéril. A continuación se muestra una plantilla que
sirve de guía para dispensar las muestras:
Nota: Si el número de muestras sobrepasa el que pueda colocarse en una

microplaca, utilizar otra placa, utilizando el mismo formato con la respectiva
numeración de muestra. En caso de que sean dos placas, se colocan todas las
muestras en los pozos, y ambas se ponen a centrifugar al mismo tiempo.
o Centrifugar 300 g, 10 minutos a 20 ºC

o Desechar plasma
o Adicionar 100 L de Hanks
o Desechar sobrenadante
o En BASALES, adicionar 200 L de Hanks
o En ACTIVADAS, adicionar 200 L de Zimosán
o Incubar en agitación 30 minutos a temperatura ambiente (25 ºC)
o Adicionar 100 L de Hanks
o Adicionar 200 L de NBT
o Incubar 30 minutos en un lugar protegido de la luz
o Descartar sobrenadante
o Añadir 200 L de metanol al 70 %.
o Repetir dos veces el lavado con metanol al 70 %
o Dejar secar la microplaca a temperatura ambiente (5 min)
o Añadir 120 L de KOH
o Añadir 140 L de Dimethyl sulfóxido (DMSO)
o Inmediatamente leer a 630 nm en el lector de ELISA
Los valores se expresan como densidad óptica (DO)

Importante: El NBT es un reactivo altamente inestable, por lo que se prepara en el
proceso de análisis de la muestra y se prepara con DMSO y Hanks, los cuales se
adicionan en ese orden.
Volumen requerido NBT DMSO Hanks

20 ml 57 mg 5.7 ml 13.3 ml
10 ml 33 mg 33 ml 7.7 ml
8 ml 24 mg 2.4 ml 5.6 ml
5.6 Hemaglutinación.
Dentro de los procedimientos inmunológicos, este es un útil y práctico inidcador que

se basa en la especificidad de la unión Antígeno-Anticuerpo. Esta unión pueda ser
visualizable por la aglutinación.
a) Material
b) Reactivos.
o Puntas para micropipeta de 2-20 μl.
o Puntas para Micropipeta de 100- o Sangre humana tipo O+, para
1000 μl. Solución de eritrocitos al 2 %
o Tubos Eppendorf de 1.5 ml o Hidróxido de sodio (NaOH) al 0.9 %
o Tubos falcón de 15 ml. (solución salina isotónica)
o Vaso de precipitado de 10 ml o Tubo o Agua estéril inyectable
Eppendorf de 2 ml.
o Gradilla congelada para tubos c) Equipo
Eppendor.
o Contenedor de desechos. o Micropipeta de 2-20 μl.
o Microplacas de 96 pozos fondo U. o Micropipeta de 100-1000 μl.
o Plantillas para microplacas. o Micropipeta multicanal.
o Guantes. o Centrífuga.
a) Preparación de solución de eritrocitos al 2 %

 Agitar la unidad de sangre humana (tipo O+) y verter aproximadamente 1.5 ml

en un contenedor de más de 2 ml (vaso de precipitado o Tubo Eppendrof de 2
ml)
 Tomar 1 ml de sangre y diluirlo en 10 ml de solución salina isotónica al 0.9 %
(SSI) en un tubo Falcón de 15 ml. Desechar la punta de la micropipeta.
 Centrifugar a 800 g por 5` a 25 ºC
 Desechar sobrenadante sin tocar botón de eritrocitos
 Adicionar nuevamente 10 ml de la SSI.
 Repetir dos veces vez más el proceso de lavado, centrifugación y desecho.
 Tomar 400 l del botón de eritrocitos y diluirlo con 19 600 l de SSI para al
final tener un volumen de 20 ml. (los 20 ml son suficientes para evaluar 30
muestras).
Procedimiento:
 Dispensar 50 l de SSI en cada pozo de una microplaca de 96 pozos de fondo

U.
 Dispensar 50 l de plasma en la segunda columna de la microplaca.
Importante:
Cada hilera de la microplaca corresponderá a una muestra, de tal manera que en

una microplaca se pueden correr 8 muestras. Elemplo:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A C M1 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10
B C M2 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10
C C M3 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10
D C M4 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10
E C M5 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10
F C M6 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10
G C M7 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10
H C M8 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10
C= Control (50 l de SSI + 50 l de eritrocitos al 2 %).

M= Muestra (de la 1 a la 8) (50 l de plasma + 50 l de SSI + 50 l de eritrocitos al 2
%).
D= Diluciones.
 Con ayuda de una micropipeta multicanal, se toman de 50 l de la segunda

columna, se homogenizan lentamente tres veces, y en la última homogenización, se
toman 50 l y se diluyen en la siguiente columna de la microplaca. Se sigue el
mismo procedimiento de homogenización. Este procedimiento se repite
sucesivamente hasta la 12ª columna, en la que por último que se toman 50 l y se
desechan.
Nota: Con este procedimiento se tienen diluciones seriadas de la concentración de

lectinas en plasma: 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512,1024.
 Adicionar 50 l de la solución de eritrocitos al 2 % en todos los pozos.

 Tapar la microplaca
 Observar la hemaglutinación una hora después
La aglutinación se observa como una mancha difusa roja o como un punto rojo poco
definido al fondo del pozo. Cuando no aglutinan aparece un punto rojo. Todos los
controles no deben aparecer aglutinados.
El título de hemaglutinación se reporta como el inverso de la última dilución.
6. Bioquímica de los tejidos; gónada, glándula digestiva y

músculo.
6.1 Determinación de glucógeno: Modificado de Nicholas, V et al., 1955.
 Fenol al 5 %.
 Acido Sulfúrico.
Material:
 Alcohol etílico absoluto anhídro al
95 % (etanol).
 Tubos Eppendorf de 1.5 ml y 2ml.
 Estándar de glucosa 1mg/ml.
 Gradilla para tubos Eppendor.
 Agua destilada.
 Microplacas para lector de ELISA.
 Puntas para micropipeta de 100- Equipos:
1000 μl.
 Puntas para micropipeta de 2-20  Micropipeta de 2-20 µl.
μl.  Micropipeta de 100-1000 μl.
 Tijera y pinza para obtener el corte  Balanza analítica.
del tejido.
 Centrífuga.
 Guantes.
 Homogenizador.
 Estufa de incubación (37 °C).
Reactivos:
 Lector de Elisa.
 Campana de extracción.
 Acido Tricloroacético al 5 %.
Procedimiento:
o Extraer la glándula digestiva.

o Hacer un corte del tejido que pese entre 0.400 g.
o Congelar en nitrógeno líquido y almacenarlo en -40ºC (Repco).
o Colocar el corte en un tubo Eppendorf de 1.5 ml, al cual se añadieron
previamente 200 μl de ácido tricloroacético TCA al 5 %.
o Homogenizar el tejido en el TCA al 5% durante un minuto.
o Centrifugar a 7000 rpm (centrífuga Eppendorf) durante 6 minutos.
o Tomar 100 μl del sobrenadante (extracto) y poner en un tubo Eppendorf de 1.5
ml que contiene 500 μl de etanol al 95 %.
o Homogenizar con ayuda de la micropipeta.
o Incubar en estufa a 37 °C por 3 horas.
o Centrifugar a 4550 g (7000 rpm) por 15 minutos.
o Desechar el sobrenadante y poner a escurrir los tubos en forma invertida sobre
un papel absorbente. (como resultado se obtendrá un botón en la parte inferior
de la pared del tubo Eppendorf “paquete sedimentado”).
o Agregar 20 μl de agua destilada hirviendo a las muestras.
o Agregar 200 μl de fenol al 5% a las muestras.
o Preparar blanco y estándar:
 Blanco: 20 μl de agua destilada hirviendo + 200 μl de fenol al 5% + 1 ml de

ácido sulfúrico.
 Estándar: 10 μl del estándar de glucosa (1 mg/ml) + 200 μl de fenol al 5% + 1

ml de ácido sulfúrico.
o Agregar 1 ml de ácido sulfúrico a las muestras.

o Agitar en vórtex.
o Dispensar 200 μl por muestra en una microplaca de Lector de Elisa. Incluir
blanco y estándar. Cada uno por triplicado.
o Leer la absorbancia a 490 nm.
Las densidades ópticas de los blancos y del estándar deben estar en un rango de:
DO Blanco = 0.107 a 0.146
DO Estándar de glucosa = 0.358 a 0.380
Las densidades ópticas de las muestras deben ser < 3; de ser mayor se requiere diluir
la muestra con ácido sulfúrico.
Nota: Para realizar el calculo: se saca el promedio de las densidades ópticas (DO) de
los triplicados de cada una las muestras, incluyendo Blanco y Estándar.
Calculo:
Glucógeno (mg/g) = (((PM–PBCO)/(PStd.))*(1)*(0.1/PeT)*(0.9))*FD

Dónde:
Promedio de la muestra = PM
Promedio del blanco = PBCO
Promedio del estándar = PStd
Estándar de glucosas (Kit comercial de Bayer) 100 mg/dl = 1 mg/ml
Volumen del extracto = 100 μl = 0.1 ml
Peso del tejido = PeT
Factor de conversión de glucosa a valores de glucógeno = 0.9
Factor de Dilución = FD (se aplica solo en caso de que se haya hecho una dilución).
Preparación de los Reactivos:
 Acido tricloroacético al 5 %.
Ejemplo: para preparar 100 ml: 5 g de TCA en 100 ml de H2O destilada.
 Fenol al 5 %.
Ejemplo: para preparar 100 ml: 5 g de fenol en 100 ml de H2O destilada.
 Alcohol etílico absoluto anhídro al 95 % (etanol).
Ejemplo: para preparar 100 ml: 95 de etanol en 5 ml de H2O destilada.
6.2 Determinación de lípidos por el método de: Foch et al 1957.
Material:
 Tubos Eppendorf de 1.5 ml.

 Tubo de vidrio del homogenizador.
 Gradilla para tubos Eppendor.
 Matraz Erlenmeyer de 25 ml.
 Frascos de pesada.
 Embudos de separación.
 Embudo de vidrio para filtrar.
 Matraz erlenmeyer de 500 ml para filtrar.
 Filtros whatman No. 40.
 Picetas.
 Tijera y pinza para obtener el corte del tejido.
 Guantes.
 Papel parafilm.
 Papel secante.
 Mascarilla.
Reactivos:  Balanza analítica.

 Homogenizador.
 Cloroformo.  Agitador.
 Metanol.  Bomba de vacío.
 Desecador.
Equipos:  Campana de extracción.
Procedimiento:
o Extraer el tejido.
o Colocar tejido en un tubo eppendorf de 1.5 ml
o Congelar en nitrógeno líquido y almacenarlo en -40ºC (Repco).
o Hacer un corte del tejido que pese entre 0.400 a 0.600 g.
o Coloca el tejido en el tubo de vidrio del homogenizador.
o Agregar al tejido con una piceta aprox. 3 ml de cloroformo/metanol.
o Macerar la muestra por un minuto.
o Verter el contenido macerado en un matraz erlenmeyer de 50 ml y agregar
cloroformo/metanol hasta un volumen final aproximado de 20 ml, tapar con
parafilm.
o Colocar en el agitador por un periodo de 15 minutos.
o Filtrar en la bomba de vació con un matraz kitazato y con embudo de vidrio, al
cual se le colocara un filtro whatman.
o Pasar al embudo la solución filtrada y agregar aprox. 1/3 del volumen
agua/metanol.
o Se vierte el embudo unas tres veces con la mano y se deja reposar
aproximadamente una hora en un soporte.
o En este trascurso se pesan los frascos de pesada.
o La muestra contenida en el embudo después de ese tiempo, se separa en dos
fases, la fase inferior es el extracto puro (total de lípidos) y la fase superior es el
agua metanol, la cual se desecha.
o Después se vacía al frasco de pesada la fase separada (fase inferior).
Previamente pesados los frasco.
o Se colocan las muestras en un desecador y se deja dentro de la campana de
extracción.
o Una vez evaporada la muestra (aprox. 2-4 días) se pesa de nuevo el frasco de
pesada y la diferencia es el total de lípidos.
o Posteriormente se realizan los cálculos.
Nota:
 Los frascos de pesada siempre se deben tomar con guantes en todo momento
(desde la pesada del frasco hasta todo el proceso de la muestra).
 Desechar el agua metanol en un frasco de vidrio de desecho.
 Se debe de monitorear la evaporización de las muestras.
Calculo:
Lípidos totales (mg/g)= (((PFcm–PFsm)*1000)/PT)
Dónde:
PFcm = Peso del Frasco con muestra.
PFsm = Peso del frasco sin muestra.
PT = Peso del Tejido.
Preparación de reactivos:
Agua-Metanol (3:1).
Ejemplo: si se requiere preparar 1 litro de esta solución tomar:

750 ml de agua destilada + 250 ml de metanol = 1 litro agua-metanol (3:1)
Cloroformo-metanol (2:1).
Ejemplo: si se requiere preparar 1 litro de esta solución tomar:

666.6 ml de cloroformo + 333.4 ml de metanol = 1 litro cloroformo-metanol (2:1).
7. Determinación de contenido energético; mediante la

bomba calorimétrica (Parr instrumens)
El método de calorimetría se basa en la diferencia de temperatura antes y después de
realizar la combustión. En la bomba calorimétrica (una atmósfera comprimida de
CO2), se realiza la combustión completa de compuestos hidrocarbonatos los cuales se
oxidan a CO2 y H2O. Los compuestos azufrados se transforman en óxidos gaseosos y
son absorbidos en agua que se encuentran en la base de la bomba, junto con
elementos inorgánicos como arsénico, boro y halógenos.
Material:  Cronómetro.
 Papel absorbente o toalla.
 Termómetro de alta sensibilidad.
 Alambre de ignición. Reactivos:
 Cápsula de combustión.
 Soporte para bureta.  Naranja de metilo 0.1%.
 Vaso de precipitado de plástico  NaOH 0.1 N.
de 2litros.  Ácido nítrico o agua acida.
 Vaso de precipitado de 40ml con
agua destilada.
 2 Pinzas. Equipos:
 Tijeras.  Tanque de oxígeno.
 Espátula.  Bomba calorimétrica.
 Pipeta de 1ml.
 Bureta.
Preparación de la muestra:
La cantidad de la muestra utilizada no deberá ser mayor a un 10 g y deberá estar

seca, por tal motivo el tamaño de la muestra no debe desprender más de 7.000 kcal
al quemarse. Se pulveriza la muestra a evaluar en una capsula de porcelana, el polvo
se coloca en la capsula y se compacta, posteriormente se pesa la pastilla.
Procedimiento:
NOTA: en todo el procedimiento se requiere utilizar guantes y pinzas.
 Llenar el vaso de precipitado de plástico con dos litros de agua destilada (esta
cantidad debe de ser precisa.
 Temperar: el agua de la cubeta debe estar cuando menos 2°C por debajo de la
temperatura ambiente y 2 °C por arriba de la temperatura mínima que marca
el termómetro (18°C). (dejar unos minutos a temperatura ambiente)
 Cortar 10 cm del alambre de ignición.
 Anotar el peso de la cápsula metálica, el alambre de ignición y la muestra
(pastilla).
 Agregar 1 ml de agua destilada al fondo de la bomba calorimétrica (Esta agua
permitirá cuantificar la cantidad de ácido nítrico formado por la reacción).
 Sujetar el alambre al soporte de la bomba.
 Colocar la cápsula metálica en el soporte correspondiente de la bomba.
 Doblar el alambre a modo de columpio y colocar la pastilla, de tal forma que el
alambre no toque la cápsula.
 Cerrar la bomba despacio y con precaución, dado que la pastilla se puede caer.
 Colocar el contenedor de acero dentro del calorímetro y agregarle los 2 litros de
agua destilada previamente temperada, corroborar que la temperatura no sea
mayor de 20 ºC.
 Conectar la manguera del tanque de oxígeno a la válvula de entrada de la
bomba.
 Abrir la llave del regulador muy despacio para llenar la bomba, dejar salir el
aire durante 30 segundos y cerrar la válvula de escape. En estas condiciones
dejar que la bomba se llene de oxígeno lentamente hasta alcanzar 30
atmósferas de presión y cerrar la llave del regulador, importante: liberar el
aire de la manguera de alimentación.
 Introducir con mucho cuidado y con ayuda de las pinzas la bomba al recipiente
de agua, colocar los electrodos y cerrar el calorímetro con mucho cuidado. La
polela deberá quedar hacia atrás.
 Colocar el termómetro hacia delante y colocar la banda del motor de la polea.
 Encender el motor durante 4 minutos tiempo aproximado de la estabilidad de
la temperatura del agua de la cubeta.
 Una vez estabilizada la temperatura se registra esa temperatura la cual será la
inicial y se oprime el botón de ignición en la fuente de poder debe prender el
foco rojo por un segundo, a partir de ese momento se registrar las lecturas a
intervalos de un minuto, hasta que la temperatura se vuelva constante
aproximadamente en 7 minutos.
 Apagar el motor.
 Abrir el calorímetro, quitar los electrodos y sacar la bomba con mucho cuidado,
secarla con el papel absorbente o una toalla limpia y dejar salir el CO2 abriendo
lentamente la válvula de escape.
 Abrir la bomba y colocar en el soporte. Retirar el alambre quemado, la capsula
y pesarlos.
30
 Recuperar el líquido de la bomba en un vaso de precipitado, agregarle una gota

de naranja de metilo.
 Titular con hidróxido de sodio (NaOH 0.1 N) lentamente y en agitación
constante hasta que cambie su coloración de naranja a amarillo.
 Concluidas todas las determinaciones se debe lavar la bomba y el recipiente de
acero inoxidable con agua destilada y secar. Las cápsulas metálicas se lavan
con el ácido nítrico se enjuagan con agua destilada y se ponen a secar en la
estufa.
 El equipo deberá ser guardado en el lugar destinado para tal efecto.
Notas importantes:
o Si no sube la temperatura durante 3 minutos después de la ignición puede

ser por varias razones:
o Se cayó la pastilla y solo se quemo el alambre de ignición.
o No hubo flujo de energía, la fuente o electrodo podrían estar dañados.
o El recambio se hace cuando ya está muy sucia el agua, en caso de evaluar
pocas muestras se recuperara el agua según su estado.
o Se debe de mantener siempre los 2 L de agua destilada en el contenedor de
acero.
o En caso de no haberse quemado completamente la pastilla a notar los
residuos que quedaron en la capsula.
Precauciones:
 Nunca ponga en la bomba una muestra que libere más de 8000 calorías.
 La presión de O2 nunca deberá ser superior a 40 atmósferas, ya que es la
máxima presión que soporta la bomba, por tal motivo se debe de tener
precaución al momento del llenado.
 Nunca realice la ignición cuando haya fugas de O2 por pequeñas que sean.
 Cuando libere el CO2 debe de permanecer separado de la bomba ya que
podría marearlo.
 No ponga la cabeza o las manos cerca de la bomba durante la ignición.
Deben pasar 20 segundos para acercarse.
 Se deberá evitar el uso de las muestras con alto contenido de azufre o de
cloro pues pueden dañar la bomba.
 Esta bomba no resiste cloro, fluor o bromo en presencia de humedad.
 No utilice aceite en ningún sistema de oxígeno
 No olvide cerrar la llave del tanque de oxígeno.
31
Cálculos:
Hg = ((ΔT°C * W) – e1 – e2-e3)/m)
Dónde:
Hg = Es la energía bruta de la muestra (cal/g).

ΔT°C es la diferencia de temperatura entre el valor de la T°Co y T°Cx
W = Constante de estandarización (2379.99) este valor será utilizado en todas las
evaluaciones dentro de la UMDI.
e1 = es el valor de corrección por el gasto de NaOH.
e2 es el valor de corrección de combustión del alambre (peso del alambre inicial –
alambre final x 1400).
e3
m = es el peso de la pastilla.
32
8.- Bibliografia.
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35
9. Anexos.
Anexo1. Preparación de curvas patrón.
Para preparar las curvas patrón se requiere de estándares con concentraciones

conocidas de cada metabolito. En el caso de triglicéridos y glucosa los estándares
vienen en el kit respectivo.
Con respecto a las proteínas, lactato y colesterol, se preparan las concentraciones ya
que estas no vienen en el kit.
Colesterol.
Se diluyen 2 mg de colesterol en 1 ml de alcohol etílico absoluto, y la concentración

de la solución madre será de 2 mg/ml. Se toman 500 µl y se afora a 2000 µl alcohol
etílico absoluto, quedando así una concentración de 0.5 mg/ml.
Lactato.
Se toman 1000 µl del estándar del kit (0.4 mg/mL Trinity 825-10) y se afora a 2000
µl de agua libre de pirógenos, quedando una concentración de 0.2 mg/ml.
Una vez preparadas las concentraciones de cada estándar, se hacen las diluciones
respectivas de las concentraciones que integran la curva patrón de cada metabolito,
como ya se mencionó.
En el caso de triglicerdidos y glucosa, se toma los volúmenes para preparar la curva

patrón directos del Kit, ya que estos ya vienen preparados a cierta concentración.
A continuación se presenta una tabla con las concentraciones de la curva de cada

metabolito.
Diluciones de la curva patrón.
Metabolitos y Concentraciones de sol. Volumen de a Volumen del agua Volumen

concentración de la Estándar en curva patrón solución libre de pirógenos fina µl
solución estándar mg/ml estándar µl µl
0.05 25 475 500
0.1 50 450 500
Glucosa 0.2 100 400 500
1 mg/ml 0.3 150 350 500
0.4 200 300 500
0.5 250 250 500
36
0.01 12.5 487.5 500
0.025 31.25 468.75 500
Lactato 0.05 62.5 437.5 500
0.4 mg/ml 0.1 125 375 500
0.15 187.5 312.5 500
0.2 250 250 500
0.05 12.5 487.5 500
0.1 25 475 500
Acilglicéridos 0.2 50 450 500
2 mg/ml 0.3 75 425 500
0.4 100 400 500
0.5 125 375 500
Colesterol 0.05 12.5 487.5 500
2 mg/ml 0.1 25 475 500
Importante: la soluciones 0.2 50 450 500

se llevan a cabo con
etanol 0.3 75 425 500
0.4 100 400 500
0.5 125 375 500
0.05 12.5 487.5 500
Proteínas 0.1 25 475 500
2 mg/ml (albúmina 0.2 50 450 500

bovina)
0.3 75 425 500
0.4 100 400 500
0.5 125 375 500
Cada concentración se prepara en tubo Eppendorf (500 µl), y se agita en vórtex.

Todas las curvas deben mantenerse en frío (2-8 °C).
37
Anexo 2. Preparación de soluciones fisiológicas
Anticoagulante: Solución isotónica

ompuesto Peso mM gramos para 500 ml
Molecular
Cloruro de Sodio 58.44 450 13.145
(NaCl)
Cloruro de 74.55 10 0.37275
Potasio
(KCl)
Hepes 260.3 10 1.3015
EDTA.Na2 372.24 10 1.861
pH 7.3 ( pH inicial 6.98 + 0.13)
mOsm 997 + 28.41 mOsm/Kg.
Después de pesar cada uno de los reactivos en papel parafilm en las cantidades
calculadas, se incorporan, uno por uno, en 400 ml de agua estéril inyectable en
agitación. Este procedimiento asegura la completa disolución de los reactivos. Al
vaciar cada uno de los reactivos, es importante enjuagar el parafilm en el que se pesó
el reactivo con el fin de que no queden restos.
Una vez diluidos los reactivos, se ajusta el pH 0.1-0.3 unidades por debajo de 7.3, es
decir, 6.9-7.2, porque el pH aumenta una vez que el reactivo se filtra. Para ajustar el
pH, si usa Ácido Clorhídrico (HCl) 1 M, para disminuir el pH, oHidróxido de Sodio
(NaOH) 1 M para aumentarlo.
Una vez ajustado el pH, se vacía el contenido en un matraz aforado de 500 ml, donde
se completan los 500 ml con el agua estéril inyectable. La solución se filtra con una
bomba de vacío a través de un filtro de celulosa de 0.2 m nuevo y se vacía en un
frasco estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean,
Sigma Sigma E9029). Se evalúa la presión osmótica en el microosmómetro. Se
etiqueta el frasco con el nombre de la solución, fecha, nombre de quien lo preparó,
pH y osmolaridad (mOsm). Se refrigera a 2-8 ºC.
Importante:
Todo el material de plástico y cristalería debe estar estéril o lavado con un jabón
neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean, Sigma E9029).
Alsever
Compuesto Peso mM gramos
Molecular para 500
ml
Citrato de Sodio 294.1 30 4.41
Cloruro de Sodio 58.4 338 9.86
(NaCl)
Glucosa 180.2 115 10.36
EDTA.Na2 372.2 10 1.86
pH 7.0 (pH inicial 6.26 + 0.33)
mOsm 987 + 31.58 mOsm/Kg.
38
pH, si usa Ácido Clorhídrico (HCl) 1 M, para disminuir el pH, oHidróxido de Sodio
(NaOH) 1 M para aumentarlo. Una vez ajustado el pH, se vacía el contenido en un
matraz aforado de 500 ml, donde se completan los 500 ml con el agua estéril
inyectable. La solución se filtra con una bomba de vacío a través de un filtro de
celulosa de 0.2 m nuevo y se vacía en un frasco estéril o lavado con un jabón neutro
especial para inmunología (ETOXA-Clean, Sigma E9029). Se evalúa la presión
osmótica en el microosmómetro. Se etiqueta el frasco con el nombre de la solución,
fecha, nombre de quien lo preparó, pH y osmolaridad (mOsm). Se refrigera a 2-8 ºC.
Importante:
neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean).
Alsever - Formol 10 %
Dado que el formol se evapora, se prepara sólo la cantidad de reactivo requerido. Por
ejemplo, si se requieren 10 ml, entonces a 9 ml de Alsever se adiciona 1 ml de formol.
Buffer Cacodilatos
Compuesto Peso mM gramos
Molecular para 500
ml
Ácido cacodílico * 138 10 0.69
Cloruro de Calcio 110.99 10 0.55
(CaCl2)
Dimethylarsinic acid C2H7AsO2
pH 7.0 (pH inicial 3.96 + 0.47)
mOsm 112.50 + 24.33 mOsm/Kg.
pH, si usa Ácido Clorhídrico (HCl) 1 M, para disminuir el pH, o Hidróxido de Sodio
(NaOH) 1 M para aumentarlo.
39
Una vez ajustado el pH, se vacía el contenido en un matraz aforado de 500 ml, donde
se completan los 500 ml con el agua estéril inyectable. La solución se filtra con una
bomba de vacío a través de un filtro de celulosa de 0.2 m nuevo y se vacía en un
frasco estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean,
Sigma E9029). Se evalúa la presión osmótica en el microosmómetro. Se etiqueta el
frasco con el nombre de la solución, fecha, nombre de quien lo preparó, pH y
osmolaridad (mOsm). Se refrigera a 2-8 ºC.
Importante:
Solución Hanks
pH 7.0 (pH Inicial 7.63 + 0.32)

mOsm 386.86 + 25.86 mOsm/Kg
La Solución Hanks (HBSS, Sales balanceadas de Hanks) que se utiliza (Sigma H1387)
está en presentación leofilizada y lista para preparar 1000 ml.
Es una solución salina que mantiene el pH y el balance osmótico en el medio y
provee a las células el agua y los iones inorgánicos esenciales. La solución de una sal
balanceada está influenciada por el tipo de célula, el tipo de cultivo (monoclonal,
suspensión, clonal), y el grado de definición química.
En 900 ml de agua estéril, con temperatura entre 15 y 20 ºC, se adiciona, poco a

poco, el polvo contenido en el frasco. Después de vaciar el reactivo, es importante
enjuagar el frasco con agua libre de pirógenos, con el fin de que no queden restos.
Posteriormente, agregar el bicarbonato de sodio. Ambos reactivos se adicionan
mientras el agua está en constante agitación. Mantener hasta su completa
disolución. Una vez diluidos los reactivos, se ajusta el pH 0.1-0.3 unidades por
debajo de 7.0, es decir, 6.7-6.9, porque quizá el pH aumente una vez que el reactivo
se filtra. Al ajustar el pH, si los valores son mayores a 7.0 debe adicionarse gota a
gota Ácido Clorhídrico 1N (HCl); si por el contrario, está por abajo, se adicionará,
también gota a gota, Hidróxido de Sodio 1 N (NaOH). Ajustado el pH, se vacía el
contenido en un matraz aforado de 1000 ml, donde se completan los 1000 ml con el
agua estéril.
La solución se filtra con una bomba de vacío a través de un filtro de celulosa de 0.2
m nuevo y se vacía en un frasco estéril o lavado con un jabón neutro especial para
inmunología (ETOXA-Clean, Sigma E9029). Se evalúa la osmolaridad en el
microosmómetro. Se etiqueta el frasco con el nombre de la solución, fecha, y nombre
de quien lo preparó, pH y osmolaridad (mOsm). Se refrigera (2-8 ºC).
Importante:
40
Anexo3. Valores de referencia de las evaluaciones bioquímica de 68 hembras y

organismos de Octopus maya.
Lípidos Gónada Media Máximo Mínimo

totales
H 29.036 30.172 27.900
M 22.960 23.782 22.139
Glándula
H 40.577 41.888 39.267
M 41.457 42.508 40.406
Músculo
H 7.657 8.012 7.302
M 6.303 6.564 6.042
Glucógeno Gónada
H 1.726 1.844 1.608
M 0.590 0.633 0.547
Glándula
H 4.063 4.243 3.884
M 41.457 42.508 40.406
Músculo
H 0.287 0.302 0.272
M 0.250 0.260 0.240
Valor calórico Músculo
H 4539.37 4576.86 4501.88
M 4466.78 4502.84 4430.73
Hembras (H), Machos (M).
41

Manual de Métodos para La Evaluación Del Estado Fisiológico Del Pulpo Rojo Octopus Maya1

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Manual de Métodos para La Evaluación Del Estado Fisiológico Del Pulpo Rojo Octopus Maya1

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Manual de métodos para la evaluación

del estado fisiológico del pulpo rojo

Honorio Cruz, Ariadna Sánchez, Carlos Rosas y Cristina Pascual

Laboratorio Central 1 Bioquímica, Inmunología y Biología Molecular”

1.- Manejo de los organismos.........................................................................6

El pulpo rojo Octopus maya es un molusco con gran importancia económica,

Por tal motivo, se torna indispensable contar con herramientas de diagnóstico

El fuljo de materia y energía que mantiene un estado fisiológico integral ocurre

Los avances en la bioquímica fisiológica en organismos marinos como crustáceos

La sangre o hemolinfa es un tejido de transporte y reserva de nutrimentos

de los mecanismos de regulación en organismos expuestos a diferentes

Son muy pocos los estudios sobre indicadores nutricionales sanguíneos en

Aunque el conocimiento de los sistemas de defensa de los cefalópodos está aún

1999) y el sistema de coagulación (Montaño-Pérez et al., 1999) presentes en

Durante el proceso fagocítico, se origina el fagolisosoma, además de liberarse

Con todo lo anterior, el presente manual se ha elaborado con el objeto de poner a

1.- Manejo de los organismos.

o Contenedores de 100 L (depende del tamaño del pulpo).

El manejo antes de la toma de muestra de sangre es un aspecto crucial en este

Por esta razón antes de la extracción de la sangre, los pulpos se deben de

El tiempo de exposición a este baño termal depende del tamaño de los

Monte el sistema en el cual permanecerán los pulpos. Dependiendo del número y

Se requiere llenar los contenedores a la mitad de su capacidad y mantenerlos

Es muy importante manipular a los pulpos en la menor medida posible por lo

Es necesario tomar por completo al pulpo ya que se podría adherir fuertemente

Prepare el contenedor de 20 L donde será transportado

Una vez tra

Una vez alcanzada la temperatura deseada

La disección se realiza en la zona central adyacente a la parte frontal del pulpo. En

Es importante mencionar mientras se extrae la sangre, se debe dar un ligero masaje

3.- Evaluación de indicadores nutricionales sanguíneos.

o Cajas de puntas para o Micropipetas de 2 a 20 µl y 100 a

Se prende el espectrofotómetro se ajusta a 335 nanómetros (nm). Posteriormente se

Figura 3. Celda de UV de 1 ml y espectrofotómetro.

Se toman 10 l de la sangre con una micropipeta y se diluyen en 990 l de agua

Se realiza un promedio de las réplicas de la muestra.

Ejemplo: Replicas: 0.327, 0.328, 0.330 = promedio 0.328, entonces:

4.- Metabolitos en plasma.

4.2.- Fundamento de cuantificación de metabolitos.

La cuantificación de la glucosa, lactato, colesterol, triglicéridos y proteínas se llevan a

a) Proteínas totales solubles.

Se determina la concentración de proteínas solubilizada a través de una solución

El glicerol liberado en la hidrólisis de los triglicéridos, por la acción de la lipoproteín-

La glucosa es transformada por la glucosa oxidasa en ácido glucónico y peróxido de

El acido láctico es convertido a piruvato y peróxido de hidrógeno (H2O2) por la lactato

4.3.- Uso de Kits.

Los Kits de glucosa (ELITech GPSL-5505), colesterol (ELITech CHSL-5505), y

Antes de realizar las evaluaciones, es importante verificar la fecha de caducidad

Antes de comenzar las evaluaciones es necesario atemperar las soluciones reactivas

10 µl de muestra + 200 µl de solución reactiva (kit):

Es decir, se colocan 10 µl de la muestra de plasma en un pozo (cada muestra por

Fig. 4. Lector de microplacas (Benchmark Biorad).

Es importante mencionar que para evaluación de las proteínas, se requieren tomar 5

Tabla 1. Uso de reactivos.

Solución Tempo de la Estabilidad Longitud de Tiempo de caducidad del reactivo

Lactato 10 10 540 8 horas 18-26 °C; 7 días 2-8 °C;

La fecha que indique la caja, de 5-

Proteínas 5 60 595 60 días 4 °C; 2 semanas a 15-25

Además de la muestras de plasma que se van a evaluar, se debe adicionar en la

La curva patrón es un procedimiento técnico indispensable que permite cuantificar la

Al adicionar la solución reactiva a las diluciones preparadas con el estándar de

Por ello, a través de la evaluación de la reacción de las diluciones de la curva patrón

Glucógeno (mg/g) = (((PM–PBCO)/(PStd.))(1)(0.1/PeT)(0.9))FD