AISLAMIENTOYSELECCIONDELEVADURASFERMENTADORASDEMELAZADECAÑASACARUMOFFICINARUM

UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLS DE HIDALGO
FACULTAD DE BIOLOGA

Aislamiento y Seleccin de Levaduras Fermentadoras de Melaza de Caa de
azcar (Saccharum officinarum)

TESIS:

QUE PRESENTA

MIRIAM ERIKA SALCEDO CRDENAS

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TITULO PROFESIONAL DE BIOLOGO

DIRECTOR DE TESIS: DC. JESS CAMPOS GARCA

MORELIA, MICH. AGOSTO 2008

Firmado digitalmente por
AUTOMATIZACION
Nombre de
reconocimiento (DN):
cn=AUTOMATIZACION,
o=UMSNH, ou=DGB,
email=soporte@bibliotec
a.dgb.umich.mx, c=MX
Fecha: 2011.01.31
12:51:09 -06'00'
AGRADECIMIENTOS

El hombre es una cuerda tendida entre el animal y el superhombre; una
cuerda tendida sobre el abismo. Es peligroso pasar al otro lado, peligroso
permanecer en el camino, peligroso mirar hacia atrs; peligroso pararse y
peligroso temblar (Friedrich Nietzsche).

A mis padres Martha y Jos Luis, por haberme dado todo su cario, amor,
comprensin y apoyo, gracias a ellos soy lo que soy; solo me resta decirles que
los amo y que espero no defraudarlos.

A mis hermanos Ale, Pepe y Csar por estar con migo en todo momento, por
sus palabras de aliento y caminar junto a mi los quiero mucho.

Al Dr. Jess Campos Garca por darme la oportunidad de formar parte de su
equipo y realizar este trabajo.

A mis compaeros de laboratorio Alma, Too, Nancy, Arnoldo, Mauricio y
Santa por brindarme su amistad y compartir su conocimiento con migo.

A mis amigos inseparables Ady, Yari, Nancy y Marcos por haberme soportado
durante todo este tiempo y los que nos falta, gracias por su amistad los quiero.

A Isra por ser parte importante de mi existencia te amo.

A mis compaeros de la seccin 05 por haberme enseado tanto, por todos los
momentos juntos, estamos en el camino esforcmonos por cumplir nuestros
sueos.

INDICE
RESUMEN...1
I.-INTRODUCCION2
1.1 Sustratos utilizados para obtener etanol por fermentacin..6
1.2 La caa de azcar...7
1.3 Melaza de caa....8
1.4 La sacarosa....12
1.5 Combustibles y el alcohol etlico.13
1.6 Combustibles que contienen etanol14
1.7 Caractersticas del etanol.15
1.8 Efectos txicos del etanol.16
1.9 Procesos de fermentacin17
1.10 Produccin de etanol por medio de la fermentacin.18
1.11 Principio de destilacin...19
1.12 Microorganismos fermentadores..20
1.13 Levaduras.21
1.14 Componentes de una clula de levadura22
1.15 Composicin qumica de las levaduras...23
1.16 Requerimientos nutricionales de las levaduras..23
1.17 Conversin de azcar a etanol.24
1.18 Reproduccin...25
1.19 Distribucin...26
1.20 Utilizacin de levaduras para fermentacin27
1.21 Poder fermentativo de las levaduras27
1.22 Factores de estrs que afectan la actividad de las levaduras.28
1.23 Mecanismos de tolerancia en levaduras.30

II.- ANTECEDENTES..34

III.- OBJETIVOS...37

IV.- MATERIALES Y METODOS.39
4.1 Medios de cultivo..39
4.2 Aislamiento de levaduras40
4.3 Seleccin de cepas de levaduras..40
4.4 Pruebas de crecimiento...41
4.5 Pruebas de tolerancia...41
4.6 Pruebas de produccin de etanol...42
4.7 Cuantificacin de azcares y etanol..43
4.8 Determinacin de la poblacin celular...43

V.- RESULTADOS ..44
5.1 Aislamiento de levaduras en mostos de melaza..44
5.2 Seleccin de cepas...45
5.3 Pruebas de crecimiento46
5.4 Pruebas de tolerancia a etanol55
5.5 Pruebas de produccin de etanol...63

VI.
DISCUSION..68

VII.- CONCLUSIONES69

VIII.- ANEXOS..70

IX.- LITERATURA CITADA... ...87

Miriam Erika Salcedo Crdenas 1

RESUMEN

La utilizacin de microorganismos ha brindado grandes avances dentro de
la biotecnologa. Ejemplo de ello es la obtencin de etanol por el proceso de
fermentacin, el cual es considerado como una alternativa prometedora para la
obtencin de combustibles que suplan ciertas demandas energticas, como las
automotrices. Es por ello que la melaza de caa es considerada como un sustrato
viable para la produccin de etanol. En los ltimos aos la produccin de melaza
se ha ido incrementando; el azcar principal en la melaza es la sacarosa, un
disacrido compuesto por una molcula de glucosa y una de fructosa. El etanol es
obtenido principalmente por la fermentacin alcohlica mediante el uso de
microorganismos fermentadores como las levaduras, las cuales consumen los
azcares presentes en el medio convirtindolos en etanol. Es por ello que el
objetivo principal de esta investigacin fue el aislamiento y la seleccin de
levaduras procedentes de fermentos de melaza de caa; seleccionando aquellas
cepas con mayor eficiencia para llevar a cabo el proceso de fermentacin. Se
seleccionaron tres cepas de levaduras que tenan una mayor habilidad para crecer
en medios con altas concentraciones de azcares, con una mayor produccin de
biomasa, cepas tolerantes, eficientes, productoras de etanol y con capacidad para
soportar las altas temperaturas.


I. INTRODUCCION

El inminente peligro de enfrentar una crisis energtica desencadenada a partir
del incremento brusco en los precios internacionales del petrleo, como la ocurrida
en la dcada de los aos 70, reviste en la actualidad una gran preocupacin e
incertidumbre por las consecuencias desastrosas que generara para los pases
que no disponen de reservas propias de combustibles fsiles.

No resulta nada difcil predecir que el petrleo siendo un combustible fsil de
amplio uso y por tanto potencialmente agotable, podra disminuir
significativamente en el mediano o largo plazo sus reservas naturales, debido al
notable y significativo incremento del consumo mundial, elevando con ello sus
precios a niveles imprevisibles como viene acontecido en los actuales momentos.

Esta situacin debe su importancia, trascendencia y actualidad, despertar el
inters y la atencin de los pases potencialmente afectados, sometiendo a
revisin y estudio los recursos disponibles y sus necesidades energticas,
procurando diagnosticar y evaluar la viabilidad real de aprovechamiento de
Fuentes Alternativas de Energa Renovables en el plano nacional.

La energa solar es utilizada a travs del mecanismo de conversin
fotosinttica de las plantas, por medio de la cual el CO
2
de la atmsfera es fijado
por el vegetal en diversos compuestos de naturaleza orgnica, formando
carbohidratos. La biomasa producida es luego transformada en productos que
poseen la capacidad energtica de sustituir los derivados del petrleo, tal como
ocurre con el alcohol carburante o etanol.


Las materias primas vegetales que pueden potencialmente emplearse para
producir alcohol es muy diverso, aunque genricamente se incluye
preferencialmente aquellas ricas en hidratos de carbono (Chvez, 2004).

La produccin de alcohol a partir de sustratos azucarados o amilceos se
conoce desde tiempos inmemorables. El etanol a partir de cultivos agrcolas
bioetanol es de inters a causa de la naturaleza renovable de las materias
primas.

Los sustratos o materias primas ms usadas son el de la caa de azcar y la
remolacha azucarera, sin embargo se le puede producir a partir de una gran
variedad de sustratos azucarados o amilceos, principalmente granos y cereales
(Fernndez y col., 2004).

En Mxico se cultivan aproximadamente 50 millones de toneladas mtricas de
caa, para una produccin de 5.8 millones de toneladas de azcar y 1.8 millones
de melazas (zafra 2004/05); uno de cuyos destinos finales es precisamente la
produccin de alcoholes de distintas calidades. En aos recientes, se instalaron en
dos destileras de ingenios azucareros, columnas deshidratadoras, para la
obtencin de alcohol anhidro, mejor conocido como etanol, para uso como
carburante asociado a las gasolinas convencionales (Enrquez, 2005).

Histricamente se ha determinado que la palabra melaza se deriva de las
lenguas romances y en especial del espaol. En un principio, se denomin como
un producto parecido a la miel y no por el significado burdo que a partir de la
adicin del sufijo aza obtuvieron. La miel final (melaza) aparece como
subproducto solamente despus que se busca el cristal de sacarosa como
producto principal. La denominacin se aplica al efluente final de la extraccin de
la sacarosa a partir de los jugos de caa o remolacha, bajo el nombre de mieles
finales, se agrupan una serie de productos residuales de los procesos azucareros,
que poseen caractersticas y composicin bien diferenciadas. En la actualidad, y

desde hace bastante tiempo, se encuentran implementados a escala industrial dos
procesos de extraccin de sacarosa, a partir de la caa de azcar, y otro a partir
de la remolacha azucarera. En ambos casos se producen miel es finales
(melazas). La miel final ha sido utilizada bsicamente para la alimentacin del
ganado vacuno. Para estos propsitos se ha definido como un subproducto de la
fabricacin de azcar, y deber contener no menos del 48 % de su total de
azcares en forma de azcares invertidos. El otro uso ms extendido de las
mieles finales es la produccin de etanol. La fermentacin de los azcares
presentes en las mieles se lleva a cabo por las levaduras, que comienza por
invertir la sacarosa para poder introducirla en el ciclo metablico de fermentacin
(una variante de la gluclisis) por accin de la invertasa que secreta. A
continuacin la levadura convierte los azcares invertidos en etanol de acuerdo
con:

C
6
H
12
O
6
2C
2
H
5
OH + CO
2
+ H
2
O
Glucosa Etanol Dixido de carbono

El rendimiento terico de 1 Kg. de azcar (0,95 Kg. de sacarosa) es de
0.511 Kg. de etanol y 0.486 Kg. de dixido de carbono. Adicionalmente las mieles
se utilizan en menor medida para la produccin de levadura panadera y levadura
forrajera, para alimento humano y animal, y de algunas sustancias qumicas
orgnicas (Otero, 1993).


Figura 1. Ruta enzimtica para la produccin de etanol por va fermentativa

Tomado de 0tero, 1993.


1.1. Sustratos utilizados para obtener etanol por fermentacin.

Los azcares comnmente disponibles para procesos de fermentacin son: la
glucosa, sacarosa y fructosa. Estos azcares son costosos para la produccin de
etanol, adems de que la produccin de estos azcares en nuestro pas es
limitada, ya que se usan principalmente para la alimentacin humana y el mercado
de combustibles requiere de cantidades elevadas de estos sustratos (Martnez y
col., 2002).

Existe una alternativa para la produccin de combustibles como el etanol y
otros compuestos qumicos a partir de la utilizacin de una gran variedad de
biomasa (Aristidou y Penttil, 2000), la cual incluye:

Residuos agrcolas: Como los tallos de la planta de maz, la paja del trigo,
los desperdicios de la remolacha y las papas.
Residuos de madera: Los sobrantes obtenidos al cortar madera y rboles
muertos o enfermos.
Cultivos especficos: Como lamo, acacia negra, sauce, arce plateado,
caa de azcar, maz y sorgo.
Otros: Papel reciclado, bagazo de caa y maz.

En consecuencia el uso de residuos agroindustriales y particularmente el
bagazo de la caa de azcar, presenta la mejor opcin para la produccin de
etanol anhidro en nuestro pas. Sin embargo, los azcares presentes en forma de
polmeros en los residuos agroindustriales son heterogneos, alrededor del 40%
son pentosas (xilosa y arabinosa) y el 60% hexosas (glucosa y manosa) (Martnez
y col., 2002).


Hoy en da, los logros que se han alcanzado estn enfocados en la obtencin
de nuevos biocatalizadores, que fermenten eficientemente jarabes que contengan
mezclas de azcares. Ya que en la naturaleza se cuenta con una gran variedad de
material vegetal que se puede utilizar como sustrato para la obtencin de etanol
por fermentacin.

1.2. La caa de azcar

El trmino caa denomina vulgarmente tallos cilndricos, con nudos macizos
y entrenudos huecos. Provienen de vegetales con hojas esparcidas, compuestas
tpicamente de vaina, lgula y limbo. La vaina rodea el tallo, mientras que la lgula
es un pequeo apndice membranoso, o raramente peloso, situado en la zona de
unin del limbo con la vaina; el limbo suele ser alargado. Existen diferentes
especies: Caa tacuara, Caa de azcar, Caa castilla, Caa bamb, Hierba
caa, Caa colige, Caa Guadua, etc.

La caa de azcar pertenece a la familia Poaceae y al gnero Saccharum,
dentro de este gnero existen seis especies, dos silvestres y cuatro cultivadas.
Las especies silvestres son S. robustum y S. spontaneum, las especies cultivadas
son S. sinense, S. barberi, S. edule y S. officinarum.
La caa de azcar es una planta proveniente del sureste asitico. Fue
llevada a Espaa por los rabes, donde se cultivaba principalmente en las tierras
costeras de Mlaga y Granada. Posteriormente los espaoles llevaron la planta,
primero a las islas Canarias y luego a las Indias Occidentales, en muchas de
cuyas zonas el clima era ms favorable que en la Pennsula, por lo que casi se
abandon el cultivo en esta.


El jugo de su tronco es la principal fuente de azcar. Se obtiene por medio
de un trapiche, una vez cosechada la caa. Este jugo se convierte en melaza de
donde se obtienen los panes de azcar y de su molienda el azcar comercial. En
las zonas donde se cosecha, tambin se masca la caa fresca, por su jugo. La
caa de azcar es un excelente material para la obtencin de alcohol etlico.
Adems, el proceso de fermentacin es simple y los sobrantes, como el bagazo,
son utilizados como combustible. En la fermentacin de los jugos de la caa de
azcar no solo se produce etanol sino tambin butanol, glicerina, cido ctrico y
cido levulnico.
Tabla 1. Potencialidades de la produccin de alcohol de distintos cultivos.
Materia prima Alcohol (litros / hectrea)
Maz 2050
Trigo 790
Yuca 2160
Sorgo dulce 2970
Caa de azcar 4850

1.3. Melaza de caa
La melaza es un lquido denso y negruzco, constituido por el residuo que
permanece en las cubas despus de la extraccin de la mayor parte de los
azcares de remolacha o caa por cristalizacin y centrifugacin. Es un
concentrado de hidratos de carbono y los azcares representan del orden del 80%
de su contenido en materia seca.
Se trata de un producto muy apetecible y su contenido energtico es
apreciable en todas las especies. Su perfil de hidratos de carbono la hace
fcilmente degradable en el rumen dando lugar a una fermentacin tpicamente
butrica. La melaza es la fuente de carbohidratos no fibrosos ms econmica del
mercado.

Las melazas se utilizan generalmente diluidas al 50%. Como los
compuestos coloidales de la melaza de caa pueden causar problemas en las
varias etapas del proceso de fermentacin, el mosto es casi siempre clarificado.
La clarificacin puede hacerse antes o despus de la esterilizacin, que se realiza
en la ltima etapa por inyeccin directa de vapor, a la presin atmosfrica en la
mayor parte de los casos.
La melaza es deficiente en algunos macroelementos como N, P, S, Mg, y
Zn en la mayora de los casos, por lo cual es necesario su agregado a los mostos.
La cantidad de nitrgeno y fsforo a ser agregado depende de las prcticas
comerciales. El nitrgeno que se suministra generalmente como agua amoniacal y
el P como cido fosfrico, son alimentados durante el proceso de acuerdo a
programas de alimentacin que dependen de las prcticas industriales. El Mg, S, y
Zn son incorporados en forma de sulfatos.
Las melazas son un subproducto de la industria azucarera. Existen varios
tipos de melazas segn la fuente de extraccin y del proceso (Murtagh, 1999).
Melaza Negra: Es un subproducto en la produccin de azcar producida
por la caa de azcar.
Melaza de Caa de Altas Pruebas: Es un producto primario extrado de la
caa de azcar.
Azcar Refinada: Es un subproducto de la refinacin cruda de la azcar
morena hasta obtener azcar blanca.
Remolacha Azucarera: Es un subproducto de la produccin de azcar de
remolacha azucarera (Beta vulgaris).
Melaza Ctrica: Es extrada del jugo de la manufacturacin de la pulpa seca
de ctricos.


Las melazas se utilizan como materia prima para:
Alimento Animal: Es el uso ms importante, emplendose tanto para la
elaboracin de forraje para la alimentacin directa en granja.
Alcohol: Los procesos fermentativos de los azcares de la melaza
permiten la obtencin de alcohol, el cual puede destinarse para diferentes
usos.
Levadura: Su riqueza en azcares permite que sea un medio de cultivo
ptimo para el crecimiento de levaduras, principalmente para la elaboracin
de pan y para la obtencin de frmacos.
Glutamato Monosdico: Saborizante de la carne y de productos
enlatados.
cido Ctrico: Para alimentos y bebidas.
Como componente de jarabes, salsas y dulces.


Tabla 2. Comparacin en la composicin qumica de la remolacha y melaza de caa
Melaza de Caa Melaza de remolacha
Materia seca 75% 74-78%
Azcares reductores 20-35% 0.5-4.0%
Azcares totales 48-56% 48-57%
Materia orgnica (no
azcares)
9-12% 12-17%
Cenizas 10-15% 10-12%
Sacarosa 25 a 35% 46-52%
pH 5-5.5% 7.0%
Almidn 0.5%
Calcio 0.4-0.8% 0.1-0.5%
Sodio 0.1-0.4% 0.5-1.0%
Potasio 1.5-5.0% 2.0-7.0%
Magnesio 0.05-0.98% 0.1-0.15%
Fsforo 0.03-0.1% 0.02-0.07%
Azufre 0.3-0.8% 0.15-0.5%
Cobre 2.2-38 ppm 2.5 ppm
Manganeso 4-300 ppm 3.0 ppm
Zinc 4-48 ppm 0.15 ppm

Vitaminas (ppm)

Biotina 1.2-3.2 0.04-0.13
Acido flico 0.04 0.2
Inositol 6,000 5,800-8,000.
Pantotenato de Ca 54-64 50-100
Piridoxina 2.6-5 504
Riboflavina 2.5 0.4
Tiamina 1.8 1.3
Acido nicotnico 30-800 20-45
Colina 600-800 400-600

1.4. La sacarosa

La sacarosa es un disacrido compuesto de una molcula de glucosa y
una de fructosa. La sacarosa es el azcar principal en la melaza. En la hidrlisis
(Reaccin con agua), la sacarosa rinde dos monosacridos. El peso molecular de
la sacarosa es menor que el total de sus monosacridos que la componen por que
una molcula de agua es desplazada de la sacarosa y trasformada en azcar
simple. Durante la fermentacin las levaduras producen una enzima (invertasa)
que rompe la sacarosa en azcares invertidos. La concentracin de melaza es
normalmente medida en grados Brix. La escala Brix es la misma que la escala
Balling, la cual es una medida del azcar contenido en un lquido; esto es el
azcar contenido de una solucin azucarada con la misma gravedad especfica a
la muestra. As, en 80 Brix de melaza con una gravedad especfica de 1.416, que
es lo mismo que en una solucin azucarada que contiene 80% de azcar por
peso. Desafortunadamente con la melaza, la presencia de otros slidos disueltos
significa que la lectura de los grados Brix a menudo sostiene poca relacin con la
cantidad de azcares actualmente presentes. A pesar de esto, los grados Brix
comnmente usados en la industria azucarera; y la melaza es a menudo definida
alrededor de los 80 Brix. Los grados Brix determinados por el hidrmetro y
refractmetro raramente coinciden, a menos que el mtodo por el cual es ledo
sea obtenido en un estado claro (Jacques y col., 2003).
Figura 2. Hidrlisis de la sacarosa


1.5. Combustibles y el alcohol etlico
El petrleo, transformado en gasolina, es el principal energtico que se
utiliza en el transporte. Sin embargo, el petrleo es un recurso natural no
renovable y es bien sabido que se agotar en el presente siglo. Estimaciones
conservadoras indican que la fecha probable de agotamiento en Mxico ser entre
los aos 2025 a 2035 (Martnez y col., 2002). Los motores de combustin interna
consumen cantidades relativamente altas de petrleo y contribuyen enormemente
a la contaminacin del aire, razn por la cual se han desarrollado otros tipos de
combustibles y motores no convencionales. El combustible alternativo ideal
realizar una combustin ms limpia y podr ser capaz de utilizar la infraestructura
ya existente destinada para los combustibles convencionales.

Existen varias alternativas para sustituir a la gasolina como combustible,
una de ellas es la utilizacin de alcohol etlico. Ya sea absoluto o mezclado con
gasolina para formar gasohol. El etanol al contener oxgeno, realiza una eficiente
combustin; se consume en el aire produciendo una flama azul, formando dixido
de carbono y agua.

Cuando se utiliza el etanol como combustible en vehculos, se reduce la
emisin de dixido de carbono, el principal causante del calentamiento global. A
pesar de que durante la produccin y combustin de etanol se libera dixido de
carbono, ste es reciclado al ser utilizado por la biomasa que se utiliza como
materia prima para la produccin de etanol por fermentacin lo que crea un ciclo
en el cual el dixido de carbono es utilizado en lugar de acumularse en el
ambiente.

El etanol es un combustible verstil, que ofrece un alto octanaje, un calor de
vaporizacin alto y otras caractersticas que le permiten alcanzar una eficiencia
alta al utilizarse como combustible automotriz. El etanol tiene toxicidad, volatilidad
y reactividad fotoqumica baja, comparado con los combustibles convencionales
(Aristidou y Penttil, 2000).

Desde el punto de vista ambiental, tecnolgico, prctico y econmico, la
produccin de etanol anhidro por fermentacin representa una de las opciones
ms viables para sustituir a la gasolina (Martnez y col., 2002).

1.6. Combustibles que contienen etanol

Existen en el mercado extranjero, varios combustibles obtenidos a partir de
diversas mezclas preparadas con etanol absoluto y gasolina. El contenido de
estos componentes vara, ejemplos de ello son los siguientes combustibles:

E10. Todos los motores de vehculos fabricados a partir de 1970 pueden
trabajar con E10, una mezcla que contiene 10% de etanol y 90% de gasolina.

E85. Es una mezcla de 85% de etanol y 15% de gasolina sin plomo, esta
mezcla no es compatible con todos los motores automotrices, pero existen varios
vehculos capaces de utilizar E85. Estos automviles son llamados FFV (Flexible
Fuel Vehicles) y pueden utilizar una combinacin 85% de etanol.

E- Diesel. Este combustible es una mezcla lquida de diesel No. 2, 7-15%
de etanol y una pequea cantidad de un aditivo diseado para estabilizar la
mezcla y mejorar la combustin. La utilizacin de E- Diesel elimina los gases que
emiten los motores que utilizan solamente diesel.

A partir del ao 1998, muchos autos estadounidenses han sido equipados
adecuadamente para ser capaces de utilizar E85. El metanol tambin se puede
utilizar para formar gasohol, pero este alcohol es txico, corrosivo y sus emisiones
producen formaldehdo, el cual causa cncer.


1.7. Caractersticas del etanol

El alcohol etlico es un alcohol primario monohdrico, cuando no contienen
agua es llamado etanol absoluto. Este es un lquido incoloro, transparente, voltil,
inflamable y con cierto grado de toxicidad, tiene un sabor quemante, es soluble en
agua y en la mayora de los lquidos orgnicos. Tiene un punto de congelacin de
-114.1C, su punto de ebullicin es de 78.4C y tiene una densidad de 0.789 g/ml
a 20C. Su bajo punto de congelacin ha permitido que este alcohol se utilice en
termmetros para temperaturas menores de -40C y como componente de los
anticongelantes en los radiadores automotrices.

Adems el etanol se utiliza como solvente, y su principal uso es como
intermediario en la sntesis de innumerables compuestos orgnicos. La
deshidratacin del etanol produce dietil ter, el cual es empleado como solvente y
anestsico. La deshidrogenacin del etanol produce acetaldehdo, que es la
materia inicial para la produccin de un gran nmero de compuestos orgnicos,
tales como cido actico, anhdro actico, cloral, butanol y etilhexano. Las
reacciones con cidos carboxlicos o anhdridos producen steres, los cuales
tienen varias aplicaciones. El grupo hidroxilo del etanol puede ser reemplazado
por un halgeno para dar haluros de etilo. El tratamiento del etanol con cido
sulfrico produce sulfato de etilo hidrogenado y dietil sulfato. Estos y otros
qumicos derivados del etanol son utilizados en medicinas, colorantes, hules,
solventes, detergentes, adhesivos, cosmticos, explosivos, pesticidas, fibras de
resina sintticas, etc. (Roehr, 2001).

El etanol ha sido obtenido desde hace muchos aos por la fermentacin de
azcares. Todas las bebidas alcohlicas y ms de la mitad del etanol industrial
son todava obtenidos por este proceso.


A partir de soluciones acuosas, normalmente el etanol es concentrado por
destilacin, obtenindose hasta un 96% etanol y 4% agua, razn por la cual el
etanol puro no se puede obtener por destilacin. Para producir etanol absoluto, se
utilizan agentes deshidratantes, para eliminar el agua restante, hasta obtener el
etanol a concentraciones arriba del 99%.

Una gran cantidad del etanol que no se utiliza para bebidas, es actualmente
producido sintticamente, ya sea a partir de acetaldehdo obtenido del acetileno, o
de etileno obtenido del petrleo. Al etileno se le aade agua a unos 280C y 300
atm:

H
3
PO
4
CH
2
= CH
2 (g)
+ H
2
O
(g)
CH
3
CH
2
OH
(g)

Catalizador

1.8. Efectos txicos del etanol

El etanol es txico para los microorganismos fermentadores, por lo tanto
solo en concentraciones limitadas de ste pueden ser acumuladas en el proceso
de fermentacin. La proporcin de etanol producido por el organismo
etanolognico en el medio de fermentacin est en ntima dependencia con el
grado de tolerancia de la cepa al alcohol. Es conocido que el etanol ejerce efectos
inhibitorios sobre los organismos, uno de ellos es la inhibicin de la multiplicacin
celular y un efecto letal generalizado para las clulas. El alcohol provoca inhibicin
del crecimiento al provocar una inhibicin de enzimas de tipo no competitivo de
acuerdo a la cintica de Michaelis-Menten; este tipo de inhibidor se une a un sitio
de la enzima distinto al sitio activo modificando as a la enzima y haciendo de esta

forma que el proceso cataltico no sea eficiente (Mathews y Van Holde, 1998;
Stryer, 1993).

Por lo tanto, la tolerancia a etanol es considerada como uno de los
principales aspectos a explorar en las cepas etanolognicas y la investigacin de
nuevos mecanismos para el mejoramiento del proceso de produccin.

1.9. Proceso de fermentacin

La produccin industrial de bebidas alcohlicas es uno de los sectores de
mayor importancia a nivel mundial y la innovacin en este campo es fundamental
para mantener un posicionamiento adecuado.

La fermentacin es una reaccin de oxido-reduccin realizada por
organismos que transforman monosacridos tales como: glucosa, fructosa y
galactosa en alcohol etlico y CO
2
. Cualquier producto que contenga azcares o
hidratos de carbono fcilmente transformables en azcar fermentable, almidn o
celulosa sirve para la produccin de alcohol etlico.

El termino fermentacin deriva del verbo latino fervere que significa hervir,
lo cual se observa cuando las levaduras actan sobre extractos de frutos o granos
malteados durante la produccin de bebidas alcohlicas. La apariencia de hervor
se debe a la produccin de burbujas de dixido de carbono causadas por el
catabolismo anaerobio de los azcares presentes en los extractos mediante la
accin de un microorganismo. Desde el punto de vista bioqumico, la fermentacin
es un proceso en el cual se genera energa a partir del catabolismo de
compuestos orgnicos, los cuales actan como donadores y aceptores de
electrones (Nez, 2004).


La produccin de alcohol por accin de levaduras en extractos de frutos o
granos de malta, se ha llevado a cabo en gran escala desde hace muchos aos y
fue el primer proceso utilizado para obtener un metabolito microbiano. Por esta
razn, los microbilogos industriales extendieron el trmino de fermentacin para
describir cualquier proceso para obtener un producto a travs del cultivo de
microorganismos (Nez, 2004).

1.10. Produccin de etanol por medio de la fermentacin

El etanol es obtenido principalmente por un proceso de fermentacin de
azcares y es conocido como bioetanol. El lquido fermentado llega a contener
en promedio de un 7 a un 12% de etanol (v/v), dependiendo de la concentracin
de azcares fermentables disponibles, el cual se puede concentrar y llegar hasta
un 95% mediante una serie de destilaciones. (Jacques y col., 2003). La reaccin
que representa este proceso fermentativo es la siguiente:


1.11. Principio de destilacin

El principio de la destilacin se basa en las diferencias que existen entre los
puntos de fusin del agua (100C) y el alcohol (78.3C). Si un recipiente que
contiene alcohol es calentado a una temperatura que supera los 78.3C, pero sin
alcanzar los 100C, el alcohol se evaporar y separar del lquido original, para
luego juntarlo y condensarlo en un lquido de mayor fuerza alcohlica. Resultados
similares pero de separacin ms difcil pueden lograrse invirtiendo el proceso.
Esto implicara enfriar el alcohol contenido en un lquido, comenzando a congelar
el agua cuando se alcancen los 0C y separar el alcohol de la solucin. (El punto
de congelacin del alcohol es -114C). As, de comprender el proceso de
destilacin se deduce que los mayores componentes de las bebidas destiladas
son el alcohol etlico (C
2
H
5
OH) y el agua.
La combinacin de estas dos substancias en una mezcla directa no produce
una bebida sabrosa, aunque esto cambia al adicionarle componentes con carcter
propio, y que dan aroma y sabor que hacen sumamente atractivo su consumo. El
secreto de las bebidas alcohlicas destiladas, y en especial del productor, es el de
otorgarle a la bebida una fuerza alcohlica elevada y al mismo tiempo que el
producto final sea gustoso al paladar. Proceso que fue evolucionando y mejorando
con el paso del tiempo.
Generalmente los materiales de los que se parte para la elaboracin de
bebidas destiladas, son alimentos dulces en su forma natural como la caa de
azcar, la miel, frutas maduras, etc. y aquellos que pueden ser transformados en
melazas y azcares. Los agentes activos son enzimas, y estn encargados de
transformar el azcar en alcohol.


1.12. Microorganismos fermentadores

Los microorganismos utilizados en la industria para la obtencin de etanol son
seleccionados para obtener la mejor combinacin de caractersticas adecuadas
para el proceso y el equipo que se utiliza. Las caractersticas deseadas de un
proceso industrial para obtener etanol dependen de gran parte del microorganismo
utilizado en la fermentacin. Estos microorganismos deben tener:

Un alto rendimiento del producto por unidad de sustrato asimilado.
Una adecuada tolerancia al etanol.
La habilidad de permanecer viable a altas temperaturas.
Estabilidad bajo condiciones de fermentacin.
Produccin de compuestos con caractersticas organolpticas.
Bajos niveles de formacin de subproductos, tales como cidos y glicerol.
La capacidad para resistir la presin osmtica (osmotolerancia).

Las levaduras y bacterias, las cuales son utilizadas ampliamente dentro de la
industria para la produccin de etanol, tienen varias ventajas y desventajas. Las
cuales estn relacionadas con las variables del proceso y del microorganismo para
metabolizar determinado sustrato, y a la tolerancia a etanol del mismo.

La gliclisis es la ruta metablica presente en la mayora de los organismos
heterotrficos aerobios y anaerobios, utilizada para metabolizar la glucosa. Esta
ruta no requiere oxgeno, pero puede ocurrir en presencia o ausencia de este.

Cuatro eventos importantes ocurren en la gliclisis: (Creager y col., 1990)

1. Fosforilacin a nivel sustrato.
2. El rompimiento de la molcula de 6 carbonos en dos molculas de 3
carbonos.
3. La transferencia de 2 electrones a la coenzima NAD.


4. La captura de energa en forma de ATP.
Algunas de la levaduras que se utilizan industrialmente para la obtencin de
etanol son: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarun,
Schizosaccharomyces pombe y Kluyveromyces sp. Las levaduras son capaces de
utilizar una gran variedad de sustratos como: glucosa, galactosa, manosa,
fructosa, sucrosa y algunos otros azcares.

En general, las levaduras son capaces de crecer y fermentar etanol
eficientemente en un rango de pH de 3.5 a 6 y temperaturas de 28 a 35C. A
pesar de que la velocidad inicial de produccin de etanol es mayor a temperaturas
elevadas (40C), la produccin global de la fermentacin disminuye aunado a la
inhibicin que causa el etanol producido (Jones y col., 1981).

1.13. Levaduras

Algunos hongos existen como levaduras y se reproducen ya sea por
gemacin, o bien por fisin binaria. Estos son hongos verdaderos y no difieren
fundamentalmente de las formas miceliales. Las levaduras se clasifican dentro del
reino fungi, predominando la forma unicelular. Una levadura se define como un
hongo basidiomecete que se multiplica de manera vegetativa, y que no presenta
durante su fase sexual cuerpos fructferos internos o externos (Kurtzman y Fell.,
1998).

Las levaduras no son un grupo taxonmico natural, pero muestran varias
caractersticas bsicas en su organizacin celular. El trmino levadura es a
menudo usado sinnimamente con Saccharomyces cerevisiae ya que esta es la
especie que es producida en grandes cantidades. La levadura de Saccharomyces
se reproduce slo por gemacin. Las levaduras son considerablemente grandes
en tamao, ms que una bacteria y en trminos econmicos y de cantidad son el
grupo ms importante de microorganismos explotados para propsitos
industriales. Cerca de 700 especies diferentes de levaduras han sido identificadas.


1.14. Componentes de una clula de levadura

Las clulas de las levaduras varan de forma ovalada o redonda y en
tamao de alrededor de 5 a 10m de longitud, de 5 a 7m de ancho, pero hay sus
excepciones en el rango desde 2.5 a 21m. El tamao promedio de una clula
varia con el etapa del ciclo de crecimiento, las condiciones de crecimiento y la
edad de la clula (las clulas ms viejas son ms grandes en tamao).

Figura 3. La clula de levadura

La pared celular da forma y estabilidad as como el reconocimiento de
clula a clula. En realidad es una barrera permeable y juega un papel importante
controlando la entrada o salida de agua y solutos de la clula. La pared celular
tambin protege la membrana celular de la levadura. La pared celular de la
levadura est compuesta principalmente de glucanos. La membrana plasmtica de
la levadura son principalmente lpidos y protenas con una pequea cantidad de
carbohidratos y son la barrera entre el citoplasma y el exterior de la clula.


1.15. Composicin qumica de las levaduras

Una clula de levadura consiste de un 75% de agua y un 25% de
macromolculas.

Carbohidratos 18-44%
Protenas 36-60%
Acido nucleico 4-8%
Lpidos 4-7%
Inorgnicos totales 6-10%
Fsforo 1-3%
Potasio 1-3%
Sulfato 0.4%
Vitaminas en cantidades traza

1.16. Requerimientos nutricionales de las levaduras

Los requerimientos nutricionales especficos de las levaduras incluyen:

Agua.
Fuente de carbono. Son carbohidratos fermentables como una fuente de
energa.
Lpidos. Los lpidos como constituyentes de las membranas
citoplasmticas.
Fuente de nitrgeno. Los aminocidos y pptidos son necesarios para el
crecimiento y la sntesis de enzimas.
Factores nutrimentales. Como las vitaminas.
Iones inorgnicos. Son esenciales para el metabolismo de la levadura en
general.


Figura 4. Conversin de azcares dentro de la clula de levadura

1.17. Conversin de azcar a etanol

La levadura es capaz de utilizar azcar en la presencia de oxigeno
(aerbicamente) y en ausencia del oxigeno (anaerobicamente). Al utilizar el
catabolismo aerbico produce ms energa y es llamado respiracin. El
catabolismo anaerbico produce menos energa y es llamado fermentacin.

Una vez que los azcares estn dentro de la clula, estos son convertidos
por la ruta glicoltica (tambin llamada Embden-Myerhof-Parnas) en piruvato. La
secuencia de la reaccin catalizada enzimticamente que oxidativamente
convierte la glucosa en cido pirvico en el citoplasma de la levadura es conocido
como gliclisis.


1.18. Reproduccin

La reproduccin de las levaduras se desarrolla de dos formas:
asexualmente por gemacin y sexualmente mediante ascoesporas o
basidioesporas. La reproduccin por gemacin es la forma ms comn y es un
proceso en el cual la llamada clula madre desarrolla una pequea ampolla que va
aumentando de volumen hasta convertirse en una clula hija. En el microscopio se
puede observar en la pared celular las cicatrices debidas a la separacin de las
clulas hijas. Una clula de levadura puede reproducir alrededor de 25 clulas
hijas. La reproduccin sexual se realiza mediante el cruce de esporas, cuando las
condiciones de vida son desfavorables, como temperaturas extremas, sequedad
excesiva, etc.

Ciclo celular de la levadura: el ncleo del progenitor se divide y uno de los
dos ncleos resultantes entra a la clula en desarrollo. La mitocondria no se
puede desarrollar de nuevo, ya que cada uno tiene su propio DNA, que codifica al
menos para algunas protenas estructurales mitocondriales y para las enzimas que
intervienen en la respiracin. Tambin tienen sus propios ribosomas para la
sntesis proteica, siendo estos del tipo 70s como los de las bacterias, y como
consecuencia, la sntesis proteica de las mitocondrias es afectada por el
cloranfenicol (Deacon, 1988).

Figura 5. Ciclo celular de levadura


1.19 Distribucin

Las levaduras han colonizado gran parte del planeta ya que se pueden
aislar de la tierra, del agua y del aire; esto depende de la presencia de la fuente de
carbono, principalmente azcares reductores. Ya que no poseen la capacidad de
desplazarse por s mismas dependen de vectores como el viento, insectos,
animales, incluso el hombre (Vaughan y Martn, 1995). Las levaduras cuentan con
la capacidad de desarrollarse bajo la presencia o no de oxgeno, lo que representa
una ventaja importante para la industria fermentativa ya que las condiciones
iniciales del cultivo tienen una amplia reprecisin sobre los rendimientos de
produccin de biomasa o de produccin de etanol.

En condiciones aerbicas con niveles bajos de azcar, las levaduras entran
en fase de crecimiento y no de fermentacin llevando a cabo el efecto Pasteur. En
condiciones con niveles altos de azcar rpidamente son metabolizados
reprimiendo la capacidad de la clula para realizar la respiracin, aunque no haya
deficiencia de oxgeno convirtiendo inmediatamente los azcares en etanol. Este
efecto es conocido como represin catablica (Barnett, 1981).

Estos procesos metablicos y regulatorios tienen aplicaciones importantes
en el diseo de procesos de fermentacin alcohlica o en la produccin de
biomasa. As se demuestra la importancia de elegir las condiciones adecuadas
para desarrollar las levaduras.


1.20. Utilizacin de levaduras para fermentacin

Inicialmente todas las fermentaciones se realizaban de manera espontnea
con cepas de levaduras nativas sobre las que no haba ningn control. El primero
que uso cultivos puros fue el Danes Hansen en el proceso de elaboracin de
cerveza. En 1890 Mller-Thurgua introdujo el concepto de la inoculacin de las
fermentaciones de jugo de uva a partir de cultivos puros de levadura. En 1965 se
produjeron las dos primeras levaduras secas activas para su uso en la fabricacin
de vino en California EEUU. Sin embargo hasta 1980 en Europa los productores
de vino seguan trabajando con fermentaciones espontneas (Petrorius, 2000).

En la actualidad diferentes empresas poseen una amplia gama de
levaduras, particularmente Saccharomyces cerevisiae con caractersticas
especficas para cada uno de sus procesos. Las levaduras secas que hoy se
comercializan y aquellas que se aslan para llevar a cabo fermentaciones deben
presentar una serie de caractersticas deseables que permitan obtener
propiedades especficas, tanto en el proceso como en el producto elaborado
(Pretorius, 2000).

1.21. Poder fermentativo de las levaduras

El poder fermentativo tambin llamado poder, se alcoholgeno define como
el mximo porcentaje de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir al
fermentar un mosto con un exceso de azcares (Glazer y Hirochi, 1993). El poder
alcoholgeno presenta una amplia variabilidad entre distintas especies de
levaduras vitivincolas y a menudo entre distintas cepas que pertenecen a la
misma especie. Esta variabilidad en la produccin de etanol entre especies es
debida a la capacidad de tolerar el etanol producido. Otros factores que influyen el
poder fermentativo son la concentracin de azcar en el mosto, la temperatura, el
pH del medio, las sales presentes en el medio de fermentacin, y la fuente de

nitrgeno asimilable por el microorganismo. Estos ltimos factores influyen de
manera muy variable en las diferentes cepas involucradas en la fermentacin.

En condiciones anaerbicas las levaduras convierten los azcares en
alcohol por la va Embden-Meyerhof. La reaccin neta global involucra la
produccin de dos moles de etanol, dos moles de dixido de carbono y un mol de
ATP por cada mol de glucosa fermentada; en peso, significa que cada gramo de
glucosa produce tericamente 0.51 gramos de etanol, de acuerdo con la siguiente
ecuacin global:

El rendimiento obtenido en la prctica, generalmente se encuentra entre el
90 y 95% del terico; esto se debe al requerimiento de 4 a 5 % de sustrato para el
mantenimiento y produccin de biomasa (Glazer y Hiroshi, 1993).

1.22. Factores de estrs que afectan la actividad de las levaduras

As como la levadura produce altos niveles de etanol, algo que llega a ser
de principal importancia son los factores de estrs involucrados. Los factores de
estrs crtico tales como la temperatura, niveles de alcohol e infeccin son de
inters.

La temperatura es el principal factor de estrs, su incapacidad de precisar el
control de la temperatura en la fermentacin es posiblemente el mayor factor y el
ms comnmente problema que afecta al rendimiento. La temperatura ptima de
la fermentacin para la levadura (Saccharomyces cerevisiae) es de 35C y la
temperatura ptima de reproduccin para la levadura es de 28C.

Existen varios tipos de infeccin, sin embargo el punto ms crtico y
relevante en este contexto son los lactbacilos. Los lactbacilos consumen
glucosa para producir cido lctico y cido actico, el cual es el segundo factor
que afecta el rendimiento de alcohol en la fermentacin. Las levaduras producen
algunos cidos orgnicos durante la fermentacin, pero las concentraciones son
relativamente bajas comparadas con las que se producen de lactbacilos y otros
contaminantes bacterianos. Como una regla general, cuando hay actividad de
lactobacilos, la generacin de cido lctico y actico sustancialmente se
incrementa la acidz la cual puede causar que las levaduras fermentadoras paren
o dramticamente desciendan.

El alto contenido de etanol en los mostos tiene una tendencia a detener la
fermentacin. Se conoce que los niveles de alcohol provocan un estrs en los
requerimientos de la levadura (metabolismo y crecimiento). Esto nos muestra que
cuando la levadura sta en la fase reproductiva esta produce alcohol 30 veces
mas rpido que cuando no se esta reproduciendo. Existen tres fases en el
crecimiento de las levaduras; la fase llamada fase de adaptacin, durante la cual
la levadura se adapta al medio fermentador. Durante ste periodo es poco o casi
no hay crecimiento de la levadura y consecutivamente poco o casi nula la
produccin de alcohol. Este periodo puede durar de 4 a 12 horas. La segunda fase
es la fase de crecimiento exponencial. Esta es la fase ms importante donde casi
todo el alcohol es producido. Aqu es limitado el tiempo en el cual la levadura se
queda en esta fase; y este es el factor limitante de la cantidad de alcohol
producido durante la fermentacin. La tercera fase es la de muerte, en donde la
levadura se encuentra en decaimiento metablico y entra en fase de muerte.


Figura 6. Factores de estrs que afectan a las levaduras

1.23. Mecanismos de tolerancia en levaduras

El conocimiento de nuevos mecanismos que permitan producir organismos
ms tolerantes al etanol, es uno de los aspectos a considerar cuando se trabaja
con microorganismos fermentadores (Martnez y col., 2000). Por lo que se infiere
que la produccin del etanol est limitada por el efecto inhibitorio que ejerce el
propio etanol sobre el organismo que lo produce (Osman e Ingram, 1985; Walter,
1998).

Todo organismo vivo tiene la capacidad de adaptarse a diversas
condiciones del ambiente (estrs, pH, salinidad, etc.); los microorganismos no son
la excepcin, pues han desarrollado diversas estrategias, tanto para metabolizar
diferentes nutrientes como para resistir a los diversos factores que pueden
causarles daos, asegurando as su viabilidad.

La extrema toxicidad que ejercen los solventes orgnicos en los
microorganismos causa un serio problema, tal es el caso del etanol, que tras su
acumulacin en el medio de fermentacin, causa efectos adversos en el
crecimiento del microorganismo y en su propia biosntesis (Ingram, 1980).

Entre los mecanismos de tolerancia a solventes orgnicos en los
microorganismos encontramos:

Cambios en la membrana plasmtica: la membrana plasmtica posee
una estructura lipdica, la cual es responsable de muchas funciones, entre
estas destacan el transporte y la produccin de energa. Adems la
membrana contiene protenas de transporte que permiten la capacitacin
de metabolitos y la liberacin de otras sustancias, as como bombas de
iones que permiten mantener un potencial de membrana (Murria, 2002).
Aunque la bicapa de lpidos de la membrana citoplasmtica es una barrera
eficiente para discriminar la entrada de molculas hidroflicas, permite que
pequeas molculas anfiflicas tales como el etanol pasen sin necesidad
de una permeasa especfica.

Han sido estudiados varios mecanismos de respuesta a nivel de membrana
para contrarrestar los efectos txicos debidos a la acumulacin de solventes
orgnicos. Estos cambios incluyen la modificacin del grado de saturaci n de
lpidos de la membrana, cambios en la composicin de los lpidos, el recambio
y la isomerizacin cis-trans de los lpidos insaturados. Esta isomerizacin de
los lpidos de la membrana juega un papel muy importante en la tolerancia a
solventes orgnicos, permitindole a la clula sobrevivir al dao inicial; sin
embargo, se han observado que la isomerizacin cis-trans de cidos grasos no
es el nico mecanismo de tolerancia a los solventes (Yura y col., 2000). Los
cidos grasos no saturados de las levaduras son principalmente el cido
palmitolico y el cido olico a los cuales se les ha atribuido un efecto protector
de los efectos txicos del etanol. El cido olico es incorporado en la bicapa de
fosfolpidos produciendo una disminucin de la fluidez de la membrana, lo cual
impide que el etanol ingrese a la clula (Kyung y col., 2003). Esta relacin
entre la composicin de lpidos y la tolerancia al etanol tambin fue observada
cuando se encontr la presencia del ergosterol, fosfatidilcolina y cidos grasos

de cadena larga lo que ocasion en el microorganismo una mayor tolerancia al
etanol (Chi y Arneborg, 1999).

Produccin de compuestos osmoprotectores: entre estos se encuentran
las biopelculas, las cuales son formadas por la agregacin de
microorganismos en estructuras multicelulares que se adhieren a las
superficies. S cerevisiae puede formar biopelculas cuando se encuentra
bajo condiciones de estrs como son falta de nutrientes, condiciones
extremas ambientales como un aumento o disminucin en la temperatura
as como a concentraciones altas de compuestos orgnicos como el etanol
(Todd y col., 2001). Estas levaduras son capaces de formar biopelculas y
como tales muestran caractersticas fisiolgicas particulares derivadas
probablemente de una expresin diferencial de genes (Gutirrez-Correa,
2003). Adems del aspecto estructural, las biopelculas son importantes por
que promueven un cambio fisiolgico en los microorganismos. En
levaduras, despus de la adhesin se inicia una adaptacin en respuesta a
esta nueva condicin de crecimiento, la cual se refleja en la sntesis de
polisacridos y lipopolisacridos, permitindole al microorganismo
desarrollar una resistencia a varios compuestos orgnicos como el etanol.
Aparentemente, los lipopolisacridos y polisacridos interactan
fsicamente con el etanol unindole y evitando que ingrese al interior de la
clula, con lo que se genera la resistencia al etanol por parte de la
biopelcula (Chandra y col., 2000).

Expulsin activa de solventes orgnicos: varias especies de levaduras
como Saccharomyces cuentan con transportadores multidrogas, siendo los
antiportadores los ms abundantes, a los cuales se les ha relacionado con
la expulsin de algunos metaloides como arsnico y el antimonio o
solventes orgnicos como el cido octanico, evitando la toxicidad que
generan para el microorganismo. El antiportador para la expulsin de
solventes orgnicos esta localizado en la membrana plasmtica y se le ha

visto asociado con la expulsin del etanol cuando este se encuentra en
altas concentraciones (Cabral y col., 2001). Cabe mencionar que hasta el
momento no se ha descrito un transportador que sea especfico para la
expulsin del etanol en levaduras.

Sistema de respuesta a estrs oxidativo: el etanol causa dentro de la
clula estrs oxidativo ya que al encontrarse en solucin acuosa, se disocia
formando especies reactivas de oxgeno. Uno de los mecanismos de
defensa que presentan las levaduras es la accin de catalasas y
peroxidasas, donde el etanol es oxidado a acetaldehdo lo que llega a
ocasionar un aumento en la concentracin de peroxido de hidrgeno. A su
vez, las peroxidasas convierten el peroxido de hidrgeno generando agua
con lo cual ayuda a destoxificar a la clula (Alberts y col., 2002).

Protenas de respuesta a condiciones de estrs: la exposicin de la
clula al etanol es una causante de estrs lo cual puede desencadenar la
sntesis de protenas de respuesta a estrs. Entre ellas podemos mencionar
a las chaperonas moleculares, las cuales participan en la proteccin de
algunas enzimas que son desnaturalizadas por el efecto txico del etanol,
permitiendo que stas no sufran la prdida de su funcin o
desnaturalizacin, por lo que la proteccin otorgada por este tipo de
protenas permite la sobrevivencia del microorganismo.


II. ANTECEDENTES

Durante los ltimos aos se vienen utilizando las melazas como ingrediente
en la fabricacin de forraje para el ganado, habindose experimentado un
importante incremento en el consumo de melazas en alimentacin animal en el
mundo. Actualmente entre el 60% y el 70% del comercio mundial de melaza se
destina a alimentacin animal.

Por otro lado, las melazas son utilizadas ampliamente en la produccin de
etanol por ejemplo:

Acevedo y col., (2003) realizaron un estudio sobre el efecto del complejo
enzimtico Rhizozyme en la produccin de alcohol mediante la fermentacin de
melazas con S. cerevisiae. Se construy un dispositivo a escala piloto de 220 L,
que cercanamente representa las caractersticas dinmicas, trmicas, qumicas y
biolgicas de un fermentador industrial de 240000 L. Se prepar un diseo
experimental para estudiar el efecto de la adicin del complejo enzimtico en la
evolucin del grado alcohlico, los azcares reductores totales y la demanda
qumica de oxgeno resultantes de la fermentacin alcohlica. Se observaron
incrementos en el grado alcohlico hasta de un 8%, a una concentracin de
enzima de 35 ppm, sin aumento significativo de la demanda qumica de oxgeno
en la vinaza resultante. La utilizacin de este complejo enzimtico constituye una
manera sencilla de aumentar el rendimiento de la produccin de alcohol etlico en
fermentacin de melazas.

Chvez (2004) utiliz la caa de azcar como materia prima para la
produccin de alcohol carburante, ya que es rica en hidrato de carbono, los tallos
representan mayor valor econmico e inters para la fabricacin de azcar y la
elaboracin de alcohol. El alcohol se fabrica a partir de la fermentacin de los
carbohidratos. Obteniendo que el rendimiento en alcohol va de 2,800 8,400
l/ha/ao, con un rendimiento agrcola de 40 120 ton/ha/ao.

Enrquez (2005) determin la produccin de etanol anhidro en ingenios
azucareros en Mxico, se instalaron dos destileras en ingenios azucareros,
columnas deshidratadoras, para la obtencin de alcohol anhidro, para uso como
carburante asociado a las gasolinas convencionales. La iniciativa surgi del
acuerdo suscrito entre la Cmara Nacional de las Industrias Azucarera y
Alcoholera y el Gobierno del Distrito Federal. Se acord que seran destinados 10
millones de litros de etanol anhidro, para servir en la unidades de Gobierno del DF;
recibiendo apoyos econmicos los involucrados. Si bien la produccin de alcohol
etlico en las doce destileras que operaron en los ingenios al canz una cifra
cercana a los 60 millones de litros en la zafra ms reciente; en lo que respecta al
etanol anhidro, la produccin fue insignificante, destinndose fundamentalmente
para fines distintos al energtico.

Saura et al. (2005) mostr las ventajas de emplear esquemas integrado en
la produccin de azcar, alcohol y levadura en comparacin con la operacin
aislada. Desde un punto de vista de materias primas, la operacin integrada
reduce significativamente (37%) el dficit de miel final para un ingenio de 5500 ton
de caa molida/da, asociado con una destilera de 1200 l/da y una planta de
produccin de 30 ton/da de levadura forrajera. Con relacin al balance energtico,
la integracin de los procesos revierte el dficit de electricidad sobrante utilizando
como fuente energtica el bagazo. Desde el punto de vista del balance econmico
del complejo productivo, se obtienen reducciones de los costos de produccin de
US$40.00 ton/azcar, US$7.00 l/alcohol y US$30.00 ton/levadura, si se conduce
las producciones de forma integrada.


Otero et al. (2005) analizaron los indicadores de eficiencia de la produccin
de etanol a partir de diferentes fuentes de carbono en uso actual o perspectivo en
la industria alcoholera. Los rendimientos de produccin de etanol por hectrea de
tierra sembrada y por tonelada de cosecha se discuten para maz, caa,
remolacha azucarera y yuca, resultando que en trminos de rendimiento en
litros/ton de materia prima, el maz supera al resto de los productos analizados en
ms del doble, alcanzando 400 litros/ton. Un resultado similar arroja el rendimiento
expresado en l/ha. El maz alcanza un lugar intermedio en cuanto al costo, siendo
muy similar a la remolacha azucarera y 6 veces ms caro que el alcohol de caa.
Cuando el anlisis se llev a litros por tonelada de producto, el maz result ser la
mejor opcin.


III. OBJETIVO GENERAL

Aislar, seleccionar y caracterizar levaduras productoras de etanol a partir
de melaza de caa de azcar.

Objetivos Particulares:

Aislar levaduras procedentes de melaza de caa de azcar.

Evaluar la osmotolerancia a glucosa y sacarosa de las cepas
aisladas.

Evaluar la susceptibilidad a etanol en las cepas aisladas.

Realizar ensayos de fermentacin a las cepas de levaduras aisladas.

Seleccionar una cepa de levadura con altas capacidades productoras
de etanol.

Realizar una prueba piloto de fermentacin de melaza con la cepa
seleccionada.


Descripcin:

Se aislarn cepas de levaduras procedentes de melaza de Caa de azcar,
las cuales fueron seleccionadas de acuerdo a las mayores proporciones de etanol
producido en ensayos in vitro. Una vez seleccionadas las cepas de inters, se
evaluaron los parmetros fermentativos de las cepas utilizando melaza de caa. El
estudio pretende emplear un sistema eficiente en el laboratorio para la obtencin
de alcohol etlico, a partir de melaza, derivada de la caa de azcar, que ser
utilizado posteriormente en pruebas piloto.

1. Para el aislamiento de las levaduras la melaza se dej fermentar durante 48
horas y posteriormente se sembr el fermento en cajas de medio slido de
YPD.

2. Las pruebas de osmotolerancia se llevaron a cabo a diferentes
concentraciones de glucosa y sacarosa en medio lquido, inoculando las
levaduras seleccionadas.

3. Para evaluar la tolerancia a etanol a las distintas cepas aisladas se les
adicionaron diferentes concentraciones de alcohol, se sembraron en medio
lquido y se evalu su crecimiento, mediante densidad ptica y conteo de
clulas.

4. Las cepas seleccionadas fueron sometidas a pruebas de fermentacin con
melaza a diferentes concentraciones para evaluar el alcohol producido
durante la fermentacin.

5. De lo anterior fue seleccionada la cepa de levadura que present la mayor
capacidad productora de etanol durante el proceso de fermentacin.


6. Una vez seleccionada la cepa de mayor capacidad se realiz una prueba
de fermentacin de melaza a nivel piloto, para evaluar su productividad.
IV. MATERIALES Y METODOS

Las levaduras utilizadas en este trabajo se aislaron de la melaza de caa a
30 y 40 Brix.

4.1. Medios de cultivo

Se utiliz el medio de cultivo YPD para crecer las cepas, el cual contiene lo
siguiente:

Medio YPD para un litro de agua destilada
Extracto de levadura 10 g
Peptona de casena 20 g
Glucosa 2%*
Agar bacteriolgico 20 g
1

Al medio se le ajusto el pH a 6.5, se esteriliz 30 minutos a 121C,
posteriormente se dejo enfriar hasta que la temperatura descendi, se le aadi la
solucin de glucosa.

*(La glucosa se prepar a una concentracin de 20g/100ml, se esteriliz a 15
lb/pulg
2
121C por 10 minutos).

1
(El agar se adicion para preparar el medio slido).

Medio con melaza de caa: se esteriliz la melaza a 121C durante 10 minutos,
se diluy con agua destilada estril hasta obtener los grados Brix de inters y se le
adicion una fuente de nitrgeno (HN
4
)
2
SO
4
a una concentracin de 0.8 g/l.


4.2. Aislamiento de levaduras

Para aislar las cepas de levaduras se prepar melaza de caa diluyendo
con agua hasta obtener las concentraciones deseadas de 30 y 40 Brix; las
concentraciones fueron determinadas con un refractmetro (ATAGO 01089).
Posteriormente se dejo fermentar durante 48 horas a temperatura ambiente, una
vez fermentada la melaza se hicieron 8 diluciones de cada muestra 1:10, 1:100,
1:1000, etc.; se colocaron en tubos Eppendorf, y se espatularn 100 l de cada
dilucin en cajas de petri con medio YPD a 20 y 30 % en concentracin de glucosa
y sacarosa. Las cajas se incuban a 30 y 45C durante 24 horas, hasta obtener un
banco de levaduras.

4.3. Seleccin de cepas de levaduras

Se seleccionaron las colonias crecidas en las cajas de petri con medio YPD
2% de glucosa a las 24 horas de crecimiento; las diferentes cepas se
seleccionaron de acuerdo a caractersticas morfolgicas y de crecimiento. Con la
finalidad de tener colonias aisladas de diferentes tipos y con ello tener una gran
variedad de cepas para las pruebas posteriores. Cada aislado fue marcado con
una clave indicando la concentracin, la dilucin y la temperatura de la cual se
aisl.


4.4 Pruebas de crecimiento

Las pruebas de crecimiento se realizaron con distintas fuentes de carbono
(glucosa y sacarosa) a diferentes concentraciones (0 %, 8 %, 16 %, 24 %, 32 % y
40 %), en medio YPD lquido. Posteriormente de un precultivo se utilizaron 200l
para inocular los tubos que contenan 4ml de medio YPD lquido con las
concentraciones antes mencionadas. El crecimiento se monitoreo a las 24, 48 y 72
horas tomando una muestra de 1ml de cultivo para determinar la absorbancia en
un espectrofotmetro modelo JENWAY 6406 UV/VIS, a una longitud de onda de
600nm. Los cultivos se incubaron a 30C con agitacin constante y 45C sin
agitacin.

4.5 Pruebas de tolerancia a etanol

Ya seleccionadas las cepas de mayor crecimiento y produccin de etanol se
probo en medio lquido YPD con sacarosa al 2% y 16% a diferentes
concentraciones de etanol (0 %, 5 %, 10 %, 15 % y 20 %) para determinar el nivel
de tolerancia a etanol, teniendo con ello aquellas que presentaron los mejores
parmetros de tolerancia. Se inocularon 200l de un cultivo crecido durante toda la
noche, en 8ml de medio YPD. Los cultivos se incubaron a 30C y 40C
respectivamente; monitoreando cada 24 horas, tomando una muestra de cultivo,
midiendo la densidad ptica a 600nm en el espectrofotmetro modelo JENWAY
6406 UV/VIS.


4.6 Pruebas de produccin de etanol

Una vez seleccionadas las levaduras que toleran mayores cantidades de
etanol se les realizaron otras pruebas para cuantificar la proporcin de etanol
producido. Para ello las levaduras se inocularon en 8 ml de jugo de melaza de
Caa de azcar a 20 Brix el cual fue esterilizado a 15 lb de presin a 121C
durante 15 min. y en medio YPD con sacarosa al 16% ambos medios se les
agregar una fuente de nitrgeno
,
fueron crecidas a 30C durante 72hr, tomando
muestras a las 24, 48 y 72hrs. Para cuantificar el etanol producido y el consumo
de azcares.

Posteriormente se seleccionaron nuevamente las cepas que producen
mayores cantidades de etanol para realizar las pruebas anteri ores; pero ahora
solo en melaza de caa a concentraciones de 20, 30 y 40 Brix, con su respectiva
fuente de nitrgeno adicional y as poder evaluar los parmetros fermentativos de
las cepas y rendimientos de productividad. Con ste procedimiento se selecci on
una cepa de levadura que mostr las mejores caractersticas de productividad y
se utilizo para la realizacin de una prueba de fermentacin a nivel piloto.


4.7 Cuantificacin de azcares y etanol

Las muestras obtenidas de la fermentacin fueron centrifugadas y filtradas
(Filtros para jeringa MILLIPORE de 0.2m de dimetro) con el fin de eliminar
restos celulares e impurezas. A partir de las muestras filtradas se realizaron
diluciones (1:10) las cuales fueron inyectadas para su anlisis en un cromatgrafo
de lquidos de alta presin (HPLC). La cuantificacin de las muestras obtenidas de
las fermentaciones se llevo a cabo en HPLC (Varian modelo pro star), se utiliz la
columna de separacin Varian (MetaCarb 87C 300 x 7.8 mm), el horno para
calentar la columna fue el modelo 530 de ALLTECH, y el detector de ndice de
refaccin utilizado fue el Perkin Elmer serie 200. La columna fue calentada hasta
80C segn especificaciones del fabricante. Para realizar al anlisis de azcares
(sacarosa, glucosa, fructosa) y el etanol producido, se realiz una curva de
calibracin determinando el rea bajo la curva de los compuestos
correspondientes (R
2
=0.999).

4.8 Determinacin de la poblacin celular

Para determinar el nmero de clulas y su viabilidad, se realiz un conteo a
partir de las muestras obtenidas de las fermentaciones mencionadas
anteriormente. Se prepararon diluciones 1:10, 1:100, 1:1000, se tomaron 20l de
las diluciones, se colocaron en la cmara de Neubauer para realizar el conteo
celular en microscopio (Leica ATC 2000). Para determinar la viabilidad celular, se
mezclaron 50l de azul de tripano al 0.4% y 50l del cultivo diluido, se dej
reposar durante 5 min y se colocaron 20l en la cmara de Neubauer y se observo
al microscopio. Para determinar la poblacin celular se aplico la siguiente formula:

Nmero de clulas contadas

Nmero de clulas por ml = -------------------------------------- x 10
5 (4 x 10
-6
ml)

V. RESULTADOS

5.1. Aislamiento de levaduras en mostos de melaza

Se aislaron un total de 27 colonias de levaduras fermentadoras
espontneas en jugos de melaza de caa de azcar. Del proceso de fermentacin
de la melaza diluida con agua destilada a 30 y 40 Brix, durante 48 horas; se
realizaron 8 diluciones de cada una de las muestras, posteriormente se tomaron
100l de las diluciones para sembrar en medio slido YPD para obtener las
levaduras que intervienen en el proceso de fermentado de la melaza, teniendo con
ello un banco, obteniendo los siguientes resultados:

Tabla 3. Aislados de los mostos de melaza de caa. Se muestra la condicin a la cual se llevo a
cabo el aislamiento de los microorganismos, la dilucin y el nmero designado a cada uno de ellos.
# de dilucin Melaza
30Brix-45 C
Melaza
30Brix-30 C
Melaza
40Brix-30 C
Melaza
40Brix-45 C
Dilucin 1 No No No No
Dilucin 3 2 (20-21) 1 (27) 1 (32) 2 (39-40)
Dilucin 4 2 (22-23) 2 (28-29) 2 (33-34) 2 (41-42)
Dilucin 5 3 (24-25-26) 2 (30-31) 2 (35-36) 2 (43-44)
Dilucin 6 No No 1 (37) 1 (45)
Dilucin 7 No No 1 (38) 1 (46)

De las diluciones 1 y 2 no se obtuvieron colonias aisladas por que creci un
tapete en toda la caja y no se puede tener un cultivo puro; mientras que en las

diluciones 6, 7 y 8 no hubo crecimiento de levaduras por el grado de dilucin en el
que se encontraban.
Los grados brix representan la cantidad porcentual de azcares totales
presentes en el medio (melaza), as como de los solutos coloridos.

5.2. Seleccin de cepas

Una vez obtenido el banco de levaduras se contino con la seleccin de
stas de acuerdo a las caractersticas morfolgicas teniendo con ello un total de
27 aislados de levaduras, estos fueron crecidos nuevamente en agar YPD con 2
% de glucosa, los cuales se colocaron por picadura en el medio y se
seleccionaron de acuerdo a caractersticas morfolgicas para tener un cultivo
axnico de cada una de las cepas aisladas y continuar con la caracterizacin de
ellas.

Tabla 4. Grupo de cepas aisladas
Condiciones Nmero de Cepa
Melaza 30Brix-
45C
(7) 20 - 26
Melaza 30Brix-
30C
(5) 27 - 31
Melaza 40Brix-
30C
(7) 32 - 38
Melaza 40Brix-
45C
(8) 39 - 46


5.3 Pruebas de crecimiento

Con la finalidad de conocer la concentracin mxima de glucosa tolerable
por los aislados y su efecto sobre la velocidad de crecimiento se realiz un ensayo
de osmotolerancia con los cuatro grupos de levaduras.

Para realizar las pruebas de crecimiento una vez obtenido el cultivo axnico
de las levaduras fueron crecidas en 4 ml de YPD para inocular a diferentes
concentraciones de Glucosa (0%, 8%, 16%, 24%, 32% y 40%), evaluando el
crecimiento de las levaduras a una densidad ptica de 600nm a 30C y 45C
durante 72 horas.


En la grafica 1 se muestra la prueba de crecimiento en glucosa del grupo
30 Brix de melaza a 45C. En esta grafica podemos observar que las cepas 24,
25 y 26 son las que alcanzaron una mayor densidad ptica respecto a las dems
en todas las concentraciones de glucosa (0% - 40%). La densidad ptica de la
cepa 24 fue 1.011 a 32% de glucosa, lo que nos indica que es una cepa tolerante
a altas concentraciones de glucosa teniendo un crecimiento aceptable. Para la
cepa 25 fue de 1.398 a 8% esta cepa no presenta un alto grado de tolerancia en
consideracin con la anterior y para la cepa 26 fue 1.295 a 40% de glucosa lo
cual representa el mayor nivel de osmotolerancia; mientras que las cepas 20, 21,
22 y 23 alcanzaron una densidad ptica muy baja a todas las concentraciones de
glucosa inferiores a 0.1. Lo que nos indica que stas cepas no crecen
eficientemente en el medio probado.

Tomemos en cuenta que el crecimiento de las cepas se ve afectado por las
altas concentraciones de glucosa y la temperatura de 45C a las que fueron
crecidas, otro factor importante es que stas cepas no tenan movimiento alguno
por lo que solo permanecieron en el fondo del tubo y esto trae una limitante ya que
no existe una dispersin de los organismos en todo el medio.


30 Brix - 45C
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0% 8% 16% 24% 32% 40%
% GLUCOSA
D
.
O

6
0
0

n
m
20
21
22
23
24
25
26

Grafica 1. Prueba de crecimiento realizada en medio YPD a diferentes concentraciones de glucosa
de las cepas aisladas a (30 Brix y 45C), sin agitacin durante 24 horas a 45C.

La grafica 2 muestra la prueba de crecimiento en glucosa del grupo 30 Brix
de melaza a 30C. En esta grafica podemos observar que las cepas 27, 28 y 30
son las que alcanzaron una mayor densidad ptica respecto a las dems en todas
las concentraciones de glucosa (0% - 40%). La densidad ptica de la cepa 27 fue
2.512 a 16% de glucosa, lo que nos indica que es una cepa medianamente
tolerante a glucosa teniendo un crecimiento muy bueno, para la cepa 28 fue de
2.499 a 24% esta cepa presenta un alto grado de tolerancia en consideracin con
la anterior. Para la cepa 30 fue 2.501 a 24% de glucosa lo cual representa un
nivel de tolerancia aceptable; mientras que las cepas 29 y 31 alcanzaron una
densidad ptica un poco ms baja en las concentraciones de glucosa. Este grupo
de cepas mostraron comportamientos similares pero se descartaron por sus
valores de densidad ptica entre 2.3.

Tomemos en cuenta que el crecimiento de las cepas es muy uniforme ya
que se encontraban con agitacin constante y a una temperatura de 30C.


30 Brix - 30C
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
0% 8% 16% 24% 32% 40%
% GLUCOSA
D
.
O

6
0
0

n
m
27
28
29
30
31

de las cepas aisladas a (30 Brix 30C), con agitacin constante durante 24 horas, incubados a
30C.

En la grafica 3 se muestra la prueba de crecimiento en glucosa del grupo
34, 36 y 38 son las que alcanzaron una mayor densidad ptica respecto a las
dems en todas las concentraciones de glucosa (0% - 40%). La densidad ptica
de la cepa 33 fue 2.438 a 24% de glucosa, para la cepa 34 fue de 2.251 a 24%, la
cepa 36 fue 2.410 a 24% de glucosa, y la cepa 38 fue de 2.401 a 24% de glucosa;
mientras que las cepas 32, 35 y 37 alcanzaron una densidad ptica un poco mas
baja en las concentraciones de glucosa probadas.

Todas las cepas presentaron su mayor grado de tolerancia a 24% de
glucosa teniendo un comportamiento similar, el crecimiento de las cepas es muy
uniforme ya que se encontraban con agitacin constante y a una temperatura de
30C.


40 Brix - 30C
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
0% 8% 16% 24% 32% 40%
% GLUCOSA
D
.
O

6
0
0

n
m
32
33
34
35
36
37
38

de las cepas aisladas a (40 Brix y 30C), con agitacin constante durante 24 horas incubadas a
30C.

La grafica 4 muestra la prueba de crecimiento en glucosa del grupo 40 Brix
de melaza a 45C. En esta grafica podemos observar que la cepa 39 es la que
alcanzo una mayor densidad ptica respecto a las dems en todas las
concentraciones de glucosa (0% - 40%). La densidad ptica de la cepa 39 fue
1.139 a 40% de glucosa, lo que nos indica que es una cepa tolerante a altas
concentraciones de glucosa teniendo un crecimiento aceptable, todas las cepas
restantes de este grupo no tuvieron crecimiento ya que sus valores oscilan entre
0.01.

Lo que nos indica esta grafica es que las cepas no tuvieron un buen
crecimiento ya que se encuentran en altas concentraciones de azcares (40 Brix)
y adems a altas temperaturas 45C; es muy importante considerar que estas
cepas no tenan movimiento alguno por lo que solo permanecieron en el fondo del
tubo y esto trae una limitante ya que no existe una dispersin de los organismos
en todo el medio.

40 Brix - 45C
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0% 8% 16% 24% 32% 40%
% GLUCOSA
D
.
O

6
0
0

n
m
39
40
41
42
43
44
45
46

de las cepas aisladas a (40 Brix y 45C), sin agitacin durante 24 horas a 45C.

Posteriormente ya que se obtuvieron los resultados realizamos otra prueba
de crecimiento pero ahora con sacarosa a las concentraciones siguientes (16%,
24%, 32% y 40%) evaluando el crecimiento a una densidad ptica de 600 nm
durante 72 horas. Con la finalidad de poder observar cual azcar se asimila mejor
y permite un mayor crecimiento a las cepas considerando el medio y la
temperatura a las que estn sometidas.

En la grafica 5 se muestra la prueba de crecimiento en sacarosa del grupo
24 y 26 son las que alcanzaron una mayor densidad ptica respecto a las dems
en todas las concentraciones de sacarosa (16% - 40%). La densidad ptica de la
cepa 23 fue 0.042 a 40% de sacarosa, para la cepa 24 fue de 0.034 a 32% y la
cepa 26 fue 0.026 a 40% de sacarosa.

Los resultados indicaron que en el medio con sacarosa a 45C las
levaduras no fueron capaces de crecer.

30 Brix - 45C
-0.08
-0.06
-0.04
-0.02
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
16% 24% 32% 40%
% SACAROSA
D
.
O

6
0
0

n
m
20
21
22
23
24
25
26

Grafica 5. Prueba de crecimiento realizada en medio YPD a diferentes concentraciones de
sacarosa de las cepas aisladas a (30 Brix 45C), sin agitacin durante 24 horas, a 45C de
incubacin.
La grafica 6 muestra la prueba de crecimiento en sacarosa del grupo 30
Brix de melaza a 30C. En esta grafica podemos observar que las cepas 27, 28 y
30 son las que alcanzaron una mayor densidad ptica respecto a las dems en
todas las concentraciones de sacarosa (16% - 40%). La densidad ptica de la
cepa 27 fue 2.515 a 24% de sacarosa, lo que nos indica que es una cepa
medianamente tolerante a la sacarosa teniendo un crecimiento muy bueno, para la
cepa 28 fue de 2.425 a 32% esta cepa presenta un alto grado de tolerancia en
consideracin con la anterior y para la cepa 30 fue 2.465 a 24% de sacarosa lo
cual representa un nivel de tolerancia aceptable; mientras que l as cepas 29 y 31
alcanzaron una densidad ptica un poco mas baja en las concentraciones de
sacarosa, observando que el crecimiento mas inferior fue el de la cepa 29.

Los resultados indican que a 30C de incubacin las cepas presentaron
niveles de osmotolerancia a sacarosa aceptables.


30 Brix - 30C
2
2.2
2.4
2.6
16% 24% 32% 40%
% SACAROSA
D
.
O

6
0
0

n
m
27
28
29
30
31

sacarosa de las cepas aisladas a (30 Brix 30C), con agitacin constante durante 24 horas.

En la grafica 7 se muestra la prueba de crecimiento en sacarosa del grupo
34, y 38 son las que alcanzaron una mayor densidad ptica respecto a las dems
en todas las concentraciones de sacarosa (16% - 40%). La densidad ptica de la
cepa 32 fue 2.381 a 24% de sacarosa, para la cepa 34 fue de 2.480 a 24%, la
cepa 38 fue 2.357 a 40% de sacarosa, y la cepa 38 fue de 2.401 a 24% de
sacarosa; mientras que las cepas 33, 35, 36 y 37 alcanzaron una densidad ptica
mas baja en las concentraciones de sacarosa.


40 Brix - 30C
2
2.2
2.4
2.6
16% 24% 32% 40%
% SACAROSA
D
.
O

6
0
0

n
m
32
33
34
35
36
37
38

sacarosa de las cepas aisladas a (40 Brix 30C), con agitacin constante durante 24 horas.

La grafica 8 muestra la prueba de crecimiento en sacarosa del grupo 40
Brix de melaza a 45C. En esta grafica podemos observar que la cepa 44 y 43 son
las que alcanzaron una mayor densidad ptica respecto a las dems en todas las
concentraciones de sacarosa (16% - 40%). La densidad ptica de la cepa 43 fue
1.079 a 40% de sacarosa, lo que nos indica que es una cepa tolerante a altas
concentraciones de sacarosa teniendo un crecimiento bueno y la cepa 44 fue de
1.215 a 24% de sacarosa.

En esta grafica observamos que los aislados no crecieron a
concentraciones mayores a 32% de sacarosa lo que nos indica que no soportan
altas concentraciones de este azcar.

40 Brix - 45C
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
16% 24% 32% 40%
% SACAROSA
D
.
O

6
0
0

n
m
39
40
41
42
43
44
45
46

sacarosa de las cepas aisladas a (40 Brix 45C), sin agitacin durante 24 horas crecidas a 45C.

5.4 Pruebas de tolerancia a etanol

Las pruebas de tolerancia a etanol se realizaron en medio liquido YPD con
16% de sacarosa y a diferentes concentraciones de etanol (0%, 5%, 10%, 15% y
20%). En tubos de vidrio con tapa que contenan 4 ml del medio, se encubaron
durante 72 horas a 30 y 45C con y sin agitacin respectivamente.

El grupo de cepas 30Brix 45C se elimin ya que no hubo crecimiento en
las pruebas realizadas.


Las cepas 27, 28, 30 y 31 de levaduras mostraron una tolerancia en etanol
al 5% obteniendo el pico ms alto, se observan con un crecimiento uniforme todas
excepto la cepa nmero 29 que est por debajo de las otras; los resultados
muestran que las cepas ms tolerantes disminuyen la densidad ptica en etanol al
10%, lo que indica que el crecimiento celular cesa a esa concentracin, indicando
que el etanol a la concentracin del 10% resulta txico para las clulas de
levaduras.

30 Brix - 30C
-0.1
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
1.5
1.7
1.9
2.1
2.3
2.5
0% 5% 10% 15% 20%
% ETANOL
D
.
O

6
0
0

n
m
27
28
29
30
31

Grafica 9. Prueba de tolerancia a etanol realizada en medio YPD con 16% de sacarosa diferentes
concentraciones de etanol de las cepas aisladas a (30 Brix 30C), con agitacin constante
durante 24 horas, incubadas a 30C.
En la grafica 10 se observa que el crecimiento de las cepas es uniforme
para todas las concentraciones de etanol, la concentracin ms alta es de igual
manera al 5% y cae en 10%, confirmndonos nuevamente que al 10% de etanol
resulta letal para el crecimiento celular de las levaduras.


40 Brix - 30C
-0.1
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
1.1
1.3
1.5
1.7
1.9
2.1
2.3
2.5
0% 5% 10% 15% 20%
% ETANOL
D
.
O

6
0
0

n
m
32
33
34
35
36
37
38

Grafica 10. Prueba de tolerancia a etanol realizada en medio YPD con 16% de sacarosa a
diferentes concentraciones de etanol de las cepas aisladas a (40 Brix y 30C), con agitacin
constante durante 24 horas, incubadas a 30C.

Para la grafica 11 no hay ningn crecimiento ya que al 5% de etanol se
mueren las cepas, consideremos que estas levaduras se encuentran a 45C.


40 Brix - 45C
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0% 5% 10% 15% 20%
% ETANOL
D
.
O

6
0
0

n
m
39
44
45
46

diferentes concentraciones de etanol de las cepas aisladas a (40 Brix 45C), sin agitacin

Se llevo a cabo otra prueba de tolerancia a etanol en medio YPD con un
porcentaje menor de sacarosa se utilizo el 2%, a concentraciones de etanol
diferentes (0%, 5%, 10 y 15%) medido a 600nm de absorbancia durante 72 horas
a 35C y 45C respectivamente obteniendo los resultados siguientes.

En la grafica 12 se observa que la cepa con mayor crecimiento fue la cepa
26, mientras que las cepas 24 y 25 presentan un crecimiento uniforme.


30 Brix - 45C
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0% 5% 10% 15%
% ETANOL
D
.
O

6
0
0

n
m
24
25
26

diferentes concentraciones de etanol de las cepas aisladas a (30 Brix y 45C), sin agitacin

En la grafica 13 la cepa 28 es la que tiene una mayor tolerancia respecto a
las dems, la cepa con menor tolerancia es la 29, el pico mas alto en todas las

cepas lo tenemos al 5% de etanol mientras que al 10% baja y se mantiene sin
crecimiento al 15%.

30 Brix - 30C
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
0% 5% 10% 15%
% ETANOL
D
.
O

6
0
0
n
m
27
28
29
30
31

Grafica 13. Prueba de tolerancia a etanol realizada en medio YPD con 2% de sacarosa
diferentes concentraciones de etanol de las cepas aisladas a (30 Brix y 30C), con agitacin

La grafica 14 muestra un crecimiento uniforme en todas las cepas y se
comporta de la misma manera teniendo el pico ms alto al 5% y el ms bajo al
10% mantenindose a 15% de etanol.


40 Brix - 30C
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
0% 5% 10% 15%
% ETANOL
D
.
O

6
0
0

n
m
32
33
34
35
36
37
38

Grafica 14. Prueba de tolerancia a etanol realizada en medio YPD con 2% de sacarosa
diferentes concentraciones de etanol de las cepas aisladas a (40 Brix 30C), con agitacin

La grafica 15 nos muestra que no hay crecimiento de las cepas ya que los
valores andan entre el 0.1, observndose que nuevamente que el crecimiento es
inhibido por la temperatura usada (45C).

40 Brix - 45C
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0% 5% 10% 15%
% ETANOL
D
.
O

6
0
0

n
m
39
40
41
42
43
44
45

diferentes concentraciones de etanol de las cepas aisladas a (40 Brix y 45C), sin agitacin

Realizamos otra prueba de tolerancia a etanol para las cepas que fueron
aisladas y crecidas a 45C, crecindolas a 30C ya que no presentaban una buena
tolerancia y adems no tenan agitacin para ver la influencia que esto
presentaba.

En la grafica 16 y 17 se observa que el comportamiento de las cepas es
similar en los experimentos con las mismas condiciones teniendo que el pico ms
alto se encuentra a 5% de etanol y el ms bajo a 10%, mantenindose hasta el
15% de etanol.

Estas graficas nos representan que la temperatura (45C) del experimento
si influyen sobre la tolerancia y el crecimiento de las cepas, ya que al realizarlos a
las mismas condiciones (30C) su comportamiento se presenta de manera similar.


30 Brix - 30C
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
0% 5% 10% 15%
% ETANOL
D
.
O

6
0
0

n
m
20
21
22
23
24
25
26

diferentes concentraciones de etanol de las cepas aisladas a (30 Brix y 45C), pero ahora crecidas
a 30C con agitacin constante durante 24 horas.

40 Brix - 30C
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
0% 5% 10% 15%
% ETANOL
D
.
O

6
0
0

n
m
39
40
41
42
43
44
45
46

Grafica 17. Prueba de tolerancia a etanol realizada en medio YPD con 2% de sacarosa a diferentes
concentraciones de etanol de las cepas aisladas a (40 Brix y 45C), pero ahora crecidas a 30C
con agitacin constante durante 24 horas.
5.5 Pruebas de produccin de etanol


Se realizaron varias pruebas para corroborar cuales cepas son las mejores
productoras de etanol y con ello seleccionar aquellas que tengan un mayor
crecimiento, una mayor tolerancia y por ende una mayor produccin de etanol.

Las primeras fermentaciones que realizamos fueron en 100 ml con un
mosto preparado con melaza a 20Brix, con una fuente de nitrgeno adicional
(NH
4
)
2
SO
4
durante 72 horas tomando muestras de un mililitro y midiendo los
grados Brix cada 24 horas, una vez transcurrido el tiempo seguimos con la
determinacin de etanol para ello se realizo lo siguiente:

1.- Centrifugar la muestra durante 10 minutos a 130rpm
2.- Tomar el sobrenadante
3.- Realizar una dilucin 1:5 (800l de agua destilada + 200l de muestra)
4.- Filtrar la muestra
5.- Inyectarla en el HPLC
Los datos que obtuvimos fueron los siguientes:

Tabla 5. Produccin de etanol en mostos de melaza de caa con sulfato de amonio como fuente
de nitrgeno.
Cepa Brix %
Sacarosa
%
Glucosa
%
Fructuosa
%
Etanol
Poblacin celular
(1x10
6
)
23 20 N. d. N. d. 0.05 0.5305 274
25 20 N. d. N. d. 0.05 0.5118 245
30 20 N. d. N. d. 0.048 0.5037 263
34 20 N. d. N. d. 0.048 0.5415 252
40 20 N. d. N. d. 0.046 0..5197 244
42 20 N. d. N. d. 0.034 0.3285 265

Fermentacin a 48 hrs, 30C con agitacin constante en melaza de caa a
20Brix los porcentajes de azcares remanentes y produccin de etanol fueron
determinados en HPLC. (N. d. No detectado).


De la taba 4 fueron seleccionadas las cepas 23, 34 y 40 debido a que
producen la mayor cantidad de etanol.

Se llevo a cabo otra prueba de fermentacin a las cepas productoras de
etanol en melaza a diferentes grados Brix (25, 30 y 35) durante 72 horas.

Tabla 6. Produccin de etanol en mostos de melaza de caa
Cepa Brix % Sacarosa % Glucosa % Fructuosa % Etanol
23 25 0.08 N. d. 0.035 8.84
34 25 0.012 N. d. 0.1 8.64
40 25 0.01 N. d. 0.78 8.46

Fermentacin 48 hrs, a 30C, en melaza de caa a 25Brix, podemos
observar que los azcares fueron consumidos en su totalidad.

Cepa Brix % Sacarosa % Glucosa % Fructosa % Etanol
23 30 N. d. N. d. 0.33 10.5
34 30 N. d. N. d. N. d. 9
40 30 1.33 N. d. 0.16 8.73

La fermentacin fue realizada a 72 hrs en 30C y 30Brix de melaza, el
tiempo de la fermentacin fue mayor ya que el medio tenia un porcentaje mayor de
azcares.

Cepa Brix % Sacarosa % Glucosa % Fructuosa % Etanol
23 35 3.6 0.42 0.26 9.25
34 35 3.4 0.1 0.23 9.14

40 35 4.07 0.43 0.2 9.27

Fermentacin realizada a 96 hrs, 30C y 35Brix, en melaza de caa, los
azcares remanentes no son agotados totalmente lo que nos indica que las
levaduras llegan a un punto en el que ya no toleran el etanol producido y ocasiona
la muerte celular de las levaduras.

VI. DISCUSION

El objetivo principal de este trabajo fue el aislar, seleccionar y caracterizar las
levaduras productoras de etanol a partir de melaza de caa de azcar. Lachance

(1995) encontr 10 gneros diferentes de levaduras presentes en la fermentacin
del jugo de agave. En este estudio se aislaron 27 cepas de levaduras obtenidas de
las fermentaciones realizadas en melaza de caa.

Se realiz la caracterizacin de cada una de las cepas por su velocidad de
crecimiento, osmotolerancia, tolerancia y produccin de etanol.

Las pruebas de tolerancia a etanol se realizaron en medio YPD con 16 y 2
% de sacarosa para cada grupo de cepas seleccionadas, con la finalidad de
seleccionar las mejores cepas mostrando la mayor osmotolerancia, teniendo el
mayor nmero de clulas por ml y por ser las ms tolerantes al etanol logrando
tolerar entre un 5 y 10%, se ha reportado en 1989 por Ingram y col., que las
levaduras tienen un nivel de tolerancia que se encuentra entre un 5 y 7%.

Cabe mencionar que la mayora de las levaduras utilizadas para la fermentacin
alcohlica no llegan a tolerar concentraciones mayores de 15% de etanol siendo
una limitante para la industria ya que alarga los tiempos de fermentacin y por
consiguiente trae una disminucin en los rendimientos de produccin (Rodrguez y
col, 1999.)

Existen otros factores que intervienen en la produccin de etanol por
fermentacin, adems de la tolerancia, como las caractersticas de los
microorganismos, es por ello que en las levaduras aisladas se probaron varios
parmetros para su mejor caracterizacin como fueron la termo y osmotolerancia
de las cepas.

Se podra sugerir que es importante realizar la identificacin de las cepas aisladas,
para conocer a que especies nos estamos refiriendo.


VII. CONCLUSION

La manipulacin de organismos es una herramienta importante en
biotecnologa ya que permite que estos organismos posean ciertas ventajas que

ayuden en los procesos industriales. El poder aislar levaduras procedentes de
melaza de caa de azcar ha permitido crear alternativas para el proceso de
fermentacin alcohlica para producir etanol.

La melaza de caa resulta ser un subproducto adecuado para realizar el
proceso fermentativo por levaduras para la produccin de etanol. Se aislaron
levaduras procedentes de este medio para su caracterizacin, teniendo con ello
tres cepas de levaduras capaces de tolerar altas concentraciones de etanol.

Al realizar las pruebas fermentativas se observ que las cepas con mejores
niveles de tolerancia de etanol son la 23, 34 y 40, llegando a tolerar entre un 5 y
10% reflejndose un incremento en la produccin de etanol durante la
fermentacin, obteniendo una concentracin del 10% de etanol cuando se uso
30Brix.

VIII. ANEXOS

8.1 Tablas de crecimiento con glucosa


600nm Concentracin de glucosa
Procedencia Cepas 0% 8% 16% 24% 32% 40%
30B-30C 27 1.132 2.381 2.512 2.399 2.225 2.113
28 1.063 2.336 2.401 2.499 2.406 2.167
24 horas 29 0.808 2.282 2.441 2.199 1.975 1.772
30 1.093 2.198 2.454 2.501 2.382 2.213
31 1.036 2.172 2.285 2.393 2.218 2.145

48 horas 27 1.250 2.358 2.297 2.444 2.219 2.245
28 1.281 2.383 2.364 2.469 2.353 2.288
29 1.207 2.196 2.380 2.449 2.155 2.387
30 1.279 2.436 2.272 2.332 2.181 2.375
31 1.728 2.325 2.390 2.293 2.126 2.190

72 horas 27 1.179 2.248 2.416 2.444 2.116 2.295
28 1.244 2.254 2.258 2.394 2.273 2.251
29 1.214 2.240 2.367 2.463 2.323 2.324
30 1.255 2.307 2.455 2.462 2.336 2.275
31 2.145 2.257 2.382 2.403 2.305 2.349

40B-30C 32 0.983 2.141 2.094 2.283 2.173 2.170

33 0.962 2.043 2.391 2.438 2.302 2.082
24 horas 34 0.844 2.069 2.133 2.251 2.311 2.274
35 0.793 2.123 1.938 2.287 2.150 2.107
36 0.827 2.325 2.482 2.410 2.331 2.227
37 0.817 1.941 2.428 2.354 2.206 2.198
38 0.933 2.211 1.969 2.401 2.215 2.138

48 horas 32 1.509 2.180 2.205 2.349 2.190 2.374
33 1.277 2.324 2.291 2.524 2.222 2.263
34 1.173 2.265 2.431 2.384 2.281 2.368
35 1.187 2.329 2.196 2.510 2.346 2.291
36 1.093 2.312 2.335 2.320 2.337 2.238
37 1.587 2.285 2.325 2.328 2.251 2.179
38 1.248 2.208 2.219 2.446 2.344 2.254

72 horas 32 2.119 2.313 2.418 2.444 2.037 2.202
33 1.805 2.276 2.427 2.467 2.286 2.293
34 1.199 2.292 2.426 2.418 2.367 2.291
35 1.969 2.333 2.339 2.505 2.373 2.288
36 1.075 2.286 2.451 2.495 2.350 2.297
37 1.813 2.308 2.468 2.555 2.243 2.321
38 1.232 2.240 2.443 2.447 2.366 2.250

30B-45C 20 0.009 0.011 0.010 0.007 0.006 0.008

21 0.016 0.015 0.007 0.010 0.009 0.012
24 horas 22 0.015 0.040 0.024 0.017 0.014 0.021
23 0.024 0.040 0.081 0.030 0.057 0.026
24 0.153 0.675 0.641 0.455 1.011 0.280
25 0.103 1.389 0.672 0.588 0.263 0.160
26 0.158 0.891 1.035 1.244 0.786 1.295

48 horas 20 0.020 0.044 0.004 0.003 0.010 0.003
21 0.015 0.423 0.010 0.012 0.042 0.100
22 0.017 0.425 0.241 0.298 0.313 0.603
23 0.028 0.062 0.238 0.141 0.576 0.271
24 0.173 0.972 1.091 0.858 1.345 1.469
25 0.213 1.341 0.956 0.968 1.051 1.235
26 0.023 0.942 1.132 1.461 1.136 1.484

72 horas 20 -0.173 0.221 -0.168 -0.159 0.082 -0.106
21 -0.170 0.572 -0.169 -0.076 0.156 0.216
22 -0.182 0.568 0.333 0.489 0.401 0.651
23 -0.144 -0.104 0.239 0.065 0.766 0.294
24 0.107 1.000 0.928 0.931 1.346 1.000
25 0.153 1.430 0.831 0.891 0.809 1.029
26 0.164 1.135 1.189 1.482 0.996 1.352


40B-45C 39 0.043 0.058 0.042 0.0404 0.979 1.139
40 0.015 0.028 0.025 0.019 0.021 0.024
24 horas 41 0.022 0.020 0.022 0.009 0.023 0.018
42 0.027 0.018 0.017 0.017 0.020 0.025
43 0.024 0.036 0.021 0.018 0.028 0.034
44 0.051 0.043 0.040 0.050 0.055 0.050
45 0.053 0.069 0.055 0.043 0.041 0.065
46 0.046 0.120 0.057 0.048 0.056 0.080

48 horas 39 0.043 0.052 0.094 0.812 1.152 0.981
40 0.012 0.017 0.031 0.016 0.021 0.028
41 0.010 0.010 0.018 0.012 0.011 0.022
42 0.018 0.050 0.022 0.015 0.023 0.022
43 0.042 0.039 0.039 0.042 0.048 0.056
44 0.217 0.091 0.580 0.709 0.792 0.964
45 0.131 0.679 0.859 0.582 1.031 1.264
46 0.142 1.523 1.013 1.093 1.543 1.357

72 horas 39 -0.129 -0.128 0.456 0.822 1.090 1.029
40 -0.005 -0.156 -0.182 -0.175 -0.178 -0.147
41 -0.173 -0.164 -0.152 -0.173 -0.179 -0.162
42 -0.173 -0.166 -0.165 -0.177 -0.088 -0.160
43 -0.140 -0.131 -0.129 -0.131 -0.039 -0.124
44 0.277 1.248 1.502 1.466 1.353 1.327
45 0.112 1.541 1.578 1.666 1.512 1.383
46 0.158 1.539 1.391 1.342 1.392 1.303

8.2 Tablas de crecimiento con sacarosa


600nm Concentracin de sacarosa
Procedencia Cepas 16% 24% 32% 40%
30B-30C 27 2.428 2.515 2.458 2.371
28 2.390 2.319 2.425 2.330
24 horas 29 2.267 2.121 2.195 2.313
30 2.036 2.465 2.435 2.347
31 2.146 2.419 2.397 2.328

48horas 27 2.375 2.408 2.432 2.372
28 2.316 2.452 2.391 2.330
29 2.324 2.384 2.370 2.365
31 2.246 2.314 2.348 2.421
31 2.407 2.338 2.359 2.300

72 horas 27 2.490 2.588 2.512 2.469
28 2.553 2.590 2.524 2.455
29 2.477 2.579 2.538 2.387
30 2.545 2.510 2.517 2.461
31 2.548 2.554 2.503 2.462


Procedencia cepas 16% 24% 32% 40%
40B-30C 32 2.157 2.381 2.377 2.338
33 2.053 2.151 2.432 2.335
24 horas 34 2.118 2.480 2.317 2.350
35 2.078 2.245 2.357 2.315
36 2.143 2.253 2.428 2.312
37 Se quebr 2.230 2.380 2.319
38 2.340 2.278 2.355 2.357

48 horas 32 2.359 2.530 2.286 2.363
33 2.271 2.416 2.363 2.260
34 2.291 2.338 2.470 2.277
35 2.349 2.333 2.214 2.253
36 2.482 2.373 2.324 2.282
37 Se quebr 2.355 2.592 2.215
38 2.443 2.380 2.266 2.264

72 horas 32 2.543 2.490 2.530 2.468
33 2.481 2.580 2.490 2.485
34 2.519 2.578 2.549 2.461
35 2.555 2.504 2.531 2.461
36 2.474 2.543 2.451 2.408
37 2.500 2.489 2.433 -0.113
38 2.582 2.592 2.506 2.472


30B-45C 20 -0.008 -0.037 -0.029 -0.043
21 0.001 -0.047 -0.051 -0.036
24 horas 22 -0.019 -0.034 -0.040 -0.059
23 0.064 0.066 0.025 -0.036
24 0.010 0.018 -0.013 0.001
25 0.014 -0.035 -0.041 -0.036
26 0.075 0.083 0.039 0.077

48 horas 20 0.063 0.053 0.052 0.048
21 0.173 0.024 0.053 0.055
22 0.118 0.020 0.028 0.016
23 0.309 0.292 0.160 0.039
24 0.520 0.101 0.099 0.089
25 1.077 0.150 0.072 0.073
26 0.997 0.700 0.272 0.329

72 horas 20 0.084 0.065 0.060 0.046
21 0.206 0.033 0.035 0.033
22 0.150 0.021 0.021 0.009
23 0.808 0.339 0.163 0.058
24 1.072 0.126 0.084 0.130
25 1.436 0.715 0.101 0.166
26 1.729 1.281 0.817 0.565


40B-45C 39 0.102 0.066 0.036 0.062
40 0.126 -0.011 -0.013 -0.031
24 horas 41 0.216 0.114 0.049 0.007
42 0.192 0.045 0.052 0.451
43 0.619 0.219 0.016 0.368
44 0.264 0.551 0.057 0.073
45 0.593 0.042 0.055 0.045
46 0.354 0.072 -0.002 -0.011

48 horas 39 1.284 0.610 0.723 0.243
40 1.316 0.737 0.777 0.275
41 1.280 1.505 0.838 0.357
42 1.159 0.760 0.656 1.093
43 1.309 0.954 0.409 1.079
44 1.207 1.215 0.259 0.316
45 1.019 0.315 0.349 0.243
46 0.725 0.193 0.061 0.076

72 horas 39 1.247 1.130 1.281 0.837
40 1.295 1.436 1.511 0.741
41 1.357 1.439 1.249 1.216
42 1.349 1.467 1.020 1.308
43 1.722 1.273 1.106 1.282
44 1.301 1.392 0.347 0.456
45 1.337 1.069 0.395 0.287
46 0.817 0.259 0.086 0.069

8.3 Tabla de tolerancia a etanol con 16% de sacarosa

600nm Concentracin de etanol
Procedencia cepas 0% 5% 10% 15% 20%
30B-30C 27 2.467 2.085 0.295 0.305 0.281
28 2.401 2.043 0.285 0.260 0.339
24 horas 29 2.332 1.440 0.256 0.237 0.272
30 2.429 2.112 0.215 0.252 0.256
31 2.428 1.954 0.273 0.303 0.341

48 horas 27 2.506 2.198 0.298 0.300 0.300
28 2.479 2.122 0.267 0.249 0.299
29 2.472 2.076 2.258 0.234 0.283
30 2.508 2.220 0.209 0.236 0.255
31 2.427 2.063 0.268 0.282 0.301

72 horas 27 2.502 2.152 0.298 0.320 0.308
28 2.495 2.144 0.281 0.262 0.312
29 2.462 2.135 0.267 0.240 0.302
30 2.521 2.198 0.221 0.251 0.265
31 2.477 2.113 0.276 0.299 0.309


Procedencia Cepas 0% 5% 10% 15% 20%
40B-30C 32 2.399 1.842 0.232 0.251 0.276
33 2.400 2.082 0.224 0.266 0.273
24 horas 34 2.259 1.988 0.238 0.243 0.248
35 2.405 1.851 0.265 0.270 0.287
36 2.459 1.855 0.278 0.293 0.269
37 2.380 1.924 0.211 0.231 0.257
38 2.269 1.984 0.242 0.232 0.273

48 horas 32 2.425 2.070 0.201 0.263 0.249
33 2.418 2.055 0.212 0.255 0.250
34 2.232 2.060 0.230 0.227 0.234
35 2.397 2.021 0.245 0.258 0.267
36 2.466 1.891 0.263 0.272 0.238
37 2.435 2.162 0.209 0.214 0.224
38 2.322 2.129 0.255 0.219 0.281

72 horas 32 2.523 2.150 0.228 0.255 0.271
33 2.500 2.168 0.245 0.259 0.270
34 2.335 2.163 0.236 0.257 0.249
35 2.507 2.112 0.260 0.267 0.288
36 2.563 2.008 0.267 0.280 0.253
37 2.470 2.158 0.219 0.234 0.246
38 2.338 2.119 0.248 0.230 0.291


Procedencia Cepas 0% 5% 10% 15% 20%
40B-45C 39 0.163 0.035 0.046 0.040 0.036
44 0.607 0.035 0.052 0.030 0.051
24 horas 45 0.896 0.026 0.046 0.036 0.050
46 0.194 0.032 0.030 0.035 0.044

48 horas 39 0.693 0.045 0.061 0.058 0.048
44 0.972 0.063 0.065 0.047 0.062
45 1.176 0.053 0.052 0.058 0.047
46 0.986 0.045 0.045 0.045 0.036

72 horas 39 1.094 0.055 0.070 0.066 0.067
44 1.377 0.071 0.079 0.058 0.080
45 1.417 0.060 0.072 0.075 0.070
46 1.749 0.055 0.050 0.051 0.068

8.4 Tabla de tolerancia a etanol con 2% de sacarosa

Procedencia Cepa 0% 5% 10% 15%
30B-30C 27 1.975 1.472 0.431 0.397
28 1.967 1.570 0.415 0.396
24 horas 29 1.736 1.262 0.315 0.293
30 1.892 1.485 0.382 0.383
31 1.940 1.560 0.454 0.428

48 horas 27 2.106 1.957 0.532 0.475
28 1.975 1.951 0.487 0.519
29 2.053 1.781 0.328 0.382
30 2.144 1.832 0.482 0.486
31 2.180 1.824 0.539 0.490

72 horas 27 2.227 1.998 0.561 0.535
28 2.007 2.015 0.604 0.568
29 2.199 1.973 0.438 0.475
30 2.279 2.005 0.591 0.610
31 2.298 1.881 0.580 0.599


40B-30C 32 1.874 1.426 0.345 0.450
33 1.794 1.583 0.437 0.449
24 horas 34 1.701 1.539 0.424 0.418
35 1.832 1.581 0.560 0.413
36 1.917 1.435 0.357 0.391
37 1.780 1.502 0.412 0.407
38 1.829 1.429 0.439 0.387

48 horas 32 2.083 1.764 0.389 0.505
33 1.932 1.901 0.461 0.552
34 1.923 1.838 0.516 0.500
35 2.058 1.801 0.519 0.578
36 2.163 1.622 0.427 0.481
37 2.056 1.889 0.478 0.476
38 1.945 1.784 0.502 0.500

72 horas 32 2.228 1.879 0.509 0.606
33 2.013 2.075 0.557 0.574
34 2.001 2.008 0.564 0.595
35 2.275 1.953 0.534 0.633
36 2.331 1.823 0.480 0.540
37 2.227 2.024 0.494 0.561
38 2.031 2.050 0.509 0.609


30B-45C 24 0.036 0.048 0.032 0.042
24 horas 25 0.047 0.033 0.040 0.035
26 0.161 0.052 0.055 0.055

48 horas 24 0.047 0.045 0.063 0.062
25 0.052 0.054 0.047 0.085
26 0.876 0.070 0.098 0.098

72 horas 24 0.074 0.059 0.087 0.097
25 0.074 0.090 0.080 0.104
26 1.459 0.105 0.126 0.136


40B-45C 39 0.174 0.047 0.047 0.035
40 0.159 0.021 0.035 0.033
24 horas 41 0.475 0.054 0.050 0.047
42 0.143 0.039 0.023 0.026
43 0.203 0.018 0.026 0.025
44 0.519 0.029 0.042 0.051
45 0.503 0.035 0.024 0.032

48 horas 39 1.187 0.085 0.072 0.086
40 0.878 0.065 0.079 0.066
41 2.767 0.066 0.090 0.082
42 0.895 0.080 0.053 0.059
43 1.198 0.045 0.067 0.063
44 1.196 0.065 0.081 0.104
45 1.581 0.065 0.061 0.057

72 horas 39 1.336 0.109 0.119 0.134
40 1.156 0.103 0.097 0.100
41 1.358 0.132 0.124 0.116
42 1.225 0.119 0.143 0.098
43 1.349 0.082 0.096 0.106
44 1.669 0.107 0.114 0.118
45 1.881 0.093 0.097 0.108

8.5 Tabla de tolerancia a etanol con 2% sacarosa

Cepas crecidas a 30C, cuyo origen son de 45C

30B-30C 20 2.056 1.832 0.240 0.282
21 2.064 1.831 0.348 0.248
24 horas 22 1.996 1.746 0.290 0.255
23 2.009 1.688 0.296 0.256
24 1.985 1.825 0.258 0.319
25 2.066 1.765 0.290 0.317
26 2.062 1.757 0.307 0.241

48 horas 20 2.203 1.987 0.361 0.392
21 2.237 1.987 0.349 0.402
22 2.230 2.006 0.361 0.386
23 2.206 1.974 0.313 0.368
24 2.231 1.974 0.332 0.360
25 2.231 1.931 0.336 0.361
26 2.176 1.994 0.357 0.342

72 horas 20 2.319 2.067 0.396 0.429
21 2.356 2.038 0.360 0.410
22 2.351 2.114 0.393 0.409
23 2.322 2.080 0.352 0.411
24 2.390 2.080 0.366 0.403
25 2.361 1.957 0.357 0.374
26 2.351 2.082 0.373 0.387


40B-30C 39 2.030 1.782 0.282 0.268
40 2.068 1.747 0.366 0.324
24 horas 41 2.045 1.626 0.260 0.264
42 2.021 1.613 0.253 0.277
43 2.079 1.759 0.359 0.342
44 1.993 1.786 0.289 0.250
45 1.963 1.891 0.294 0.255
46 1.915 1.697 0.272 0.243

48 horas 39 2.229 1.976 0.329 0.338
40 2.224 1.990 0.379 0.402
41 2.165 1.987 0.331 0.350
42 2.208 1.974 0.334 0.358
43 2.209 1.977 0.325 0.366
44 2.178 1.852 0.339 0.353
45 2.235 1.977 0.346 0.383
46 2.011 1.975 0.328 0.357

72 horas 39 2.350 2.065 0.370 0.366
40 2.334 2.040 0.413 0.420
41 2.355 2.103 0.359 0.382
42 2.326 2.088 0.385 0.387
43 2.363 2.105 0.358 0.385
44 2.336 1.936 0.350 0.397
45 2.413 2.070 0.372 0.423
46 2.010 2.075 0.362 0.385

IX.- LITERATURA CITADA

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Yura, T., Kanemori, M. and Morita, T. M. 2000. Bacterial stress responses.
Editores G. Strorz y R. Hengge-Aronis. ASM Press, Washington, D:C.

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