TCNICA PARA LA REALIZACIN DE UNA TINCIN INMUNOHISTOQUMICA:

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

Sumergir los cortes en:

Desparafinacin e hidratacin del corte:

xilol

25min

xilol-EtOH

25min

Permite el acceso de los anticuerpos a los

componentes celulares del tejido en estudio.

EtOH 100%

10min

EtOH 90%

5min

EtOH 80%

5min

EtOH 70%

5min

Es un paso necesario para permitir localizar ciertas

sustancias y/o su actividad por la reaccin de estas
con anticuerpos conjugados a fluorocromos

Enjuagar en:
PBS 1X

10min

Adicionar sobre el corte:

Adhesin del corte y permeabilizacin de clulas:

Albmina al 0.5% en PBS 1X

1 hr

Tritn al 0.2% en PBS 1X

10min

PBS 1X

enjuague rpido

Es necesario volver a pegar el corte al portaobjetos

para poder continuar con la tcnica y para este fin se
utiliza la albmina. El tritn es usado para
permeabilizar las membranas de las clulas (por ser
un detergente) y facilitar as la penetracin de los
reactivos.

(para este paso es obligatorio marcar el permetro del

corte con lpiz de cera)

Preparar diluciones de los Acs primarios especficos

en PBS 1X y aadir de manera conjunta. Incubar 2
horas a 30C.

Adicin de *Acs primarios:

(revisar cada media hora si no se han despegado los

cortes)

Es la primera reaccin antgeno-anticuerpo que ser

necesaria para localizar selectivamente protenas que

pueden estar presentes, tanto en membranas

celulares, citoplasma, as como en la matriz
extracelular.

Enjuagar con:

Adicin de Acs secundarios:

PBS 1X (enjuague rpido)

Preparar diluciones de los Acs secundarios, ligados a

fluorocromos que emitan diferente color de
fluorescencia, y aadir de manera conjunta. Se deja a
los cortes reposar a Tam 1 hora.

Estos Acs a diferencia de los primarios estn ligados

de manera covalente a fluorocromos que no
interfieren en la capacidad de los anticuerpos para
unirse a sus correspondientes antgenos (Ags), en
este caso el Acs primarios.

Enjuagar con:
PBS 1X

5min

Colocar unas gotas de Vectashield sobre el tejido y

colocar el cubreobjetos, cuidadosamente poner
esmalte de uas alrededor del cubreobjetos para
fijarlo con el porta, envolver con aluminio y
refrigerar.

Montaje:

Permite preservar la fluorescencia de los agentes

fluorescentes utilizados (fluorescena y rodamina).

*Acs: anticuerpos, Ags: antgenos

INMUNOPEROXIDASA INDIRECTA (IPI)

Sumergir los cortes en:

Desparafinacin e hidratacin del corte:

Xilol

25min

Xilol-EtOH

25min

EtOH 100%

10min

EtOH 90%

5min

EtOH 80%

5min

Permite el acceso de los anticuerpos a los

componentes celulares del tejido en estudio.

Es un paso necesario para permitir la posterior

reaccin enzimtica y tincin para identificar el lugar
donde los anticuerpos se depositaron a travs del
estudio morfolgico del tejido.

EtOH 70%

5min

Enjuagar en:
PBS 1X

10min

Bloqueo de la actividad enzimtica endgena:

Adicionar sobre el corte:
H2O2 al 0.2-0.3% en PBS 1X

10min

PBS 1X

10min

Como en sta tcnica se utiliza como marcador una

enzima (peroxidasa conjugada con el Ac secundario)
que normalmente tambin est presente en el tejido
que se est examinando debe inhibirse su actividad
endgena antes de la inmunotincin, de lo contrario
la enzima endgena reaccionar con el sustrato
empleado para localizar la enzima marcadora dando
lugar a falsos positivos.

(para este paso es obligatorio marcar el permetro del

corte con lpiz de cera)
Adicionar sobre el corte:

Adhesin del corte y permeabilizacin de clulas:

Albmina al 0.5% en PBS 1X

1 hr

Tritn al 0.2% en PBS 1X

10min

PBS 1X

enjuague rpido

Es necesario volver a pegar el corte al portaobjetos

para poder continuar con la tcnica y para este fin se
utiliza la albmina. El tritn es usado para
permeabilizar las membranas de las clulas (por ser
un detergente) y facilitar as la penetracin de los
reactivos.

Preparar diluciones de los Acs primarios especficos

en PBS 1X y aadir por separado en diferentes
cortes. Incubar 1 hora a 30C.

Adicin de Acs primarios:

(revisar cada media hora si no se han despegado los

cortes)

Es la primera reaccin antgeno-anticuerpo que ser

necesaria para localizar selectivamente protenas
(que se desean detectar) que pueden estar presentes,
tanto en membranas celulares, citoplasma, as como
en la matriz extracelular.

Enjuagar con:

Adicin de Acs secundarios:

PBS 1X (enjuague rpido)

Preparar diluciones de los Acs secundarios y aadir

cada uno a un corte diferente. Se deja a los cortes
reposar a Tam 2 horas.

Estos Acs a diferencia de los primarios estn ligados

a la enzima peroxidasa que no interfiere en la
capacidad de los anticuerpos para unirse a sus
correspondientes antgenos (Ags), en este caso el Ac
primario.

Enjuagar con:
PBS 1X

5min

Preparar soluciones:

Inmunomarcaje de clulas positivas:

1mg DAB disuelto en 1.66ml de PBS 1X

La demostracin citoqumica de esta enzima se basa

en la accin oxidante de la peroxidasa sobre el
sustrato, bencidina (DAB: 3,3 tetrahidroclorhidrato
de diaminobenzidina), en presencia de H 2O2
(diluido), apareciendo un precipitado amarillo ocre
en el lugar donde se ha producido la reaccin (sitio
donde se llev a cabo la reaccin Ag-Ac)

400l DAB + 20l H2O2 0.2% en PBS 1X

Desarrollar cambio de color:

DAB

8min

Enjuagar con:
PBS 1X

2 enjuagues rpidos

Adicionar sobre los cortes humectados con 30 l de

PBS 1X:
DAB + H2O2

10-15 l y agitar con micropipeta.

Observar por el microscopio hasta aparicin de una

tenue coloracin beige del tejido y marcas

minsculas muy definidas de color amarillo ocre.

Enjuagar con:
PBS 1X

2 enjuagues rpidos

Esta reaccin se hace de manera individual para cada

uno de los cortes, y al final solo los cortes ya vistos
bajo el microscopio se dejan humectando con PBS
1X hasta el momento de la tincin.

Hematoxilina

30seg -1min

Tincin:

Enjuagar con:
H2O

hasta retirar exceso

Por medio de este paso facilitamos el estudio

morfolgico y estructural de los cortes que han
sufrido un inmunomarcaje por peroxidasa.

Observar por el microscopio si la coloracin

es homognea.

Se utiliza nicamente la hematoxilina (colorante

bsico) para colorear los ncleos.

Sumergir laminilla en:

Deshidratacin del corte:

EtOH 70%

1min

EtOH 80%

1min

EtOH 90%

1min

EtOH 100%

1min

Xilol-EtOH

1min

Xilol

5min

Para el correcto montaje hay que eliminar el agua de

los cortes debido a que el adhesivo a utilizar es de
carcter hidrfobo.

Montaje:

Poner 2 gotas de entellan sobre el portaobjetos y

colocar el cubreobjetos con cuidado, presionando un
poco y dejar secar.

Permite preservar la integridad de la preparacin

para su anlisis en microscopio ptico de campo
claro.