Norma Flores Estévez

Teis Doctoral, 2002

Protocolo de aislamiento de BCMNV

Procedimiento
Extracción cruda:
Colectar tejido de hoja (se recomiendan 200g)        ___________ g
Moler tejido en vaso de licuadora enfriado con:

2X vol:buffer fosfato de potasio 0.5M Ph 7.5 ___________
0.2M de sulfito de sodio  ___________
200mM de DIECA ___________

Moler en velocidad alta durante 1 minutos
Agregar 1 vol/peso de CC14  ___________
Agregar 0.8 vol/peso de CHC13 ___________
Moler en velocidad alta durante 1 minutos
Centrifugar  en botellas GSA a 3500 rpm durante 5 min.
Guardar sobrenadante y filtrar a través de fibra de vidrio
Agregar:
6%  (wt/vol) PEG 8000 –––––––––
0.25 M de NaCl _________

Agitar a 4 oC durante 2 horas.
Transferir a botellas GSA, centrifugar a 8000 rpm durante 10 min.
GUARDAR PASTILLAS
Resuspenderlas bien con fosfato de potasio0.5M, pH7.5 en 1/4 del 
volumen original 
Centrifugar en rotor  GSA durante 10 min a 8000 rpm.
GUARDAR SOBRENADANTES, medir volumen. _________ 

Agregar lo siguiente:

8% (wt/vol) PEG 8000 ___________ 

0.1 M NaCl  ___________
Agitar a 4 oC durante 1 horas.
Centrifugar en rotor GSA durante 10 minutos a 8000 rpm
 Norma Flores Estévez
Teis Doctoral, 2002

GUARDAR PASTILLAS
Resuspender pastillas en 6 ml. De HEPES 20 mM (pH7.5)

Purificación del virus en gradiente de CsCl:

Preparar solución con CsCl con lo siguiente:
11.6 g CsCl
27.0 mls de HEPES (pH7.5)
Agregar a tubos SW 50.1 lo siguiente:
3.5 ml de solución  CsCl
Agregar solución viral en la superficie de la solución CsCl
Centrifugar a 36 000 rpm durante 18 horas a 4oC.

Aislamiento del virus del gradiente de CsCl:

La banda viral debe de mostrarse a 1 cm de la base del tubo.
Colectar la banda con un aguja no. 18 y jeringa de 1 ml, evitando la 
banda de "basura" arriba de la viral.
Dializar la muestra en Hepes 2 Mm hasta el día siguiente 

Cuantificación del virus:

Volumen de solución viral:               ___________ mls
Diluir 1:500 ó 1:100 en 500 µl de H2O
Registrar absorbancia 260/280 de la dilución:

Abs. 260 nm = ____________
Abs. 280 nm = ____________
260/280 = ____________  (virus puro 260/280= 1.18).
Para estimar la concentración de virus:

Abs. 260 nm X Factor de dilución =      _______ mg/ml 
                    2.4
Rendimiento =     _________mg/  100g tejido