TINCIN DE GRAM

Fue creada en 1884 por el mdico dans Hans Christian Gram

Esta tincin nos permite separar a la mayora de las bacterias en dos grupos las Gram positivas que se tien de color violeta y las Gram negativas que se tie de color rosa

 La diferencia en la tincin radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

Pared celular de las bacterias Gram positivas.

Se observa la capa gruesa de peptidoglicano y la ausencia de lipopolisacaridos.

 Pared celular de las bacterias Gram negativas.

Se puede observar el entrecruzamiento de los cidos teicoicos

Las bacterias Gram (+) tienen una gruesa capa de pptidoglucano y gran cantidad de cidos teicicos que no son afectados por la decoloracin con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizndose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro

 Las bacterias Gram () tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por molculas de lipo polisacridos. Esta membrana externa es daada por el alcohol y/o acetona de la decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contra colorante

 Reactivos usados en la tincin de Gram.

Agua estril para realizar el frotis.

Cristal violeta tambin conocido como violeta de genciana. Safranina. Una mezcla de alcohol-acetona 1:1. Agua corriente para enjuagar.

Tcnica de la tincin de Gram.

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica hasta el rojo vivo y esperar a que enfre un poco. Tomar con el asa una gota de agua estril y agregarla en un portaobjetos. Flamear nuevamente el asa y esperar a que enfre. Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.

Despus agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar Suavemente con movimientos circulares.
Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar.

Tincin.
1Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido bacteriano. Dejar actuar durante 60 segundos. 2Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos. 3Enjuagar con agua corriente. 4Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.

5Agregar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.

6Enjuagar con agua corriente.

7Dejar secar a temperatura ambiente. 8Observar en un microscopio ptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersin.

Fundamento de la tincin de Gram

**Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecnicamente el

exceso de colorante y quitar el alcohol-acetona. **El colorante cristal violeta es de naturaleza bsica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria. Por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teidas de color violeta.

 **Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijacin de algn colorante sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijacin a la pared celular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague. Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en cidos ticnicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un carcter mas acidez de los cidos ticnicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante bsico cristal violeta. **La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgnico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloracin no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, les menciono las dos ms aceptadas. -Una teora dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos Gram positivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-lugol. En la pared de las bacterias Gram negativas hay poco pptido glicano y una gran cantidad de lpidos estos ltimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol.

Factores que considerar en la tincin de Gram.

No se debe sobrepasar los tiempos de tincin y decoloracin.

Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tian parcial o totalmente de color rosa. Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que: Los Gram positivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. Los gramnegativos pueden hacerse Gram positivos al aumentar la alcalinidad