UNIVERS

SIDAD NAC
CIONAL MA
AYOR DE S
SAN MARC
COS
(Universidaad del Perú, Decana
D de Améérica)

E. A. P. CIENCIAS
C BIOLÓGIICAS
Facultaad de Cienciias Biológiccas

FISIOL
LOGIA AN
NIMAL

CLO: 7mo
CIC TUR
RNO: 2--4 PM

PRO
OFESOR
RA: Martha Valdivia Cuya

ABAJO:
TRA Informee de Laborratorio

TEM
MA: T
TOLERANC
CIA AL ESTRÉS OSM
MÓTICO EN
N GLÓBUL
LOS ROJOS
S DE
J V
VERTEBRA
ADOS: HEM
MÓLISIS

INT
TEGRANT
TES:

Cam
margo Huaaringa, Luiis Alfredo 0510005
59
Clarros Romann, Miguel 971619
9
Cotiillo Mendooza, Alejaandro 0510015
53
Echeevarria Deel Valle, Rinaldo
R Joosué 0610007
72
Gonnzales Kozzlova, Edg
gar 0510009
94
Ñacaari Encisoo, Luis Án
ngel 0510009
97

2009
9
 PRÁCTICA Nº 4

TOLERANCIA AL ESTRÉS OSMÓTICO EN GLÓBULOS ROJOS

DE VERTEBRADOS: HEMÓLISIS

OBJETIVO:

• Encontrar la tolerancia osmótica de eritrocitos de anfibios, reptiles, aves y

mamíferos.
• Determinar la velocidad de hemólisis de los eritrocitos en estudio

MATERIALES:

Del alumno: Muestras de sangre de anfibio (sapo, Telmatobius rimac), reptil (iguana,
Iguana iguana), ave (pollo, Gallus gallus),y mamífero (ratón, Mus musculus); láminas
portaobjetos, laminillas cubreobjetos, papel lente, tubos de ensayo, gradilla y Heparina
líquida.

Del laboratorio: Soluciones isosmótica y anisosmótica de NaCl, pipetas pasteur,

lancetas de punción, aguja hipodérmica, alcohol, algodón, tubos de prueba.

FUNDAMENTO TEÓRICO:

Un intercambio de materiales se efectúa, de forma continua, entre los seres vivos y su

medio ambiente. A nivel celular esto depende de varias propiedades fisiológicas
conocidas como PERMEABILIDAD CELULAR. En consecuencia, las células
cambiarán de tamaño cuando se las sitúa a diferentes concentraciones de sustancias
impermeables disueltas en agua. Este arrugamiento e hinchamiento se debe al
movimiento osmótico de agua. En este proceso intervienen dos grupos de factores: a)
las propiedades de las membranas superficiales y b) las fuerzas impulsoras. Las
membranas celulares no sólo son diferencialmente permeables a varios materiales sino
que también presentan alteraciones bajo diferentes situaciones fisiológicas y
ambientales. Las fuerzas impulsoras son de dos tipos: a) fuerzas físicas que dependen de
gradientes de concentración o difusión en soluciones acuosas y b) propiedades celulares
especiales de difusión facilitada (transportadora) y de transporte activo.

FISIOLOGÍA ANIMAL 1
PRO
OCEDIMIE
ENTO:

1.- En
E un tubo de
d ensayo see mezcló 100 ml de solu
ución salinaa isotónica ((NaCl 0.9%
%) con
unas 10 gotas de sangre. Obténienddo la sangre limpiando la zona de punción
n con
alcohhol, y luegoo se pinchó con
c una aguuja.

2.- Añádimos
A 5 gotas de laa suspensiónn de glóbullos rojos de cada organnismo, prep
parada
anterriormente, a dos tuboss de ensayoo contenien
ndo 5 ml de
d agua desstilada y 5m
ml de
cloruuro sódico 0.2M,
0 anotaamos el tiem
mpo a partiir de agregaar los glóbuulos rojos, luego
obserrvamos la impresión de una pággina escritaa a travéss del mismo y con elllo se
estabbleció que suucedió hem
mólisis.

3.- Realizamos
R el mismo procedimiennto con solu
uciones salinnas 0.1M, 00.05M, 0.025M y
0.01225M; y detterminamos la concenttración de cloruro
c sódiico que em
mpieza a pro
oducir
hemóólisis y la veelocidad dee hemólisis.

4.- Repetimos
R e procedim
el miento para los diferen
ntes individuuos: ratón ((Mus muscu
ulus),
polloo (Gallus gaallus), iguanna (Iguana iguana) y sapo (Telm
matobius rim
mac) a los cuales
c
se exxtrajo sangree de la colaa, del ala, dee la vena fem
moral, y del corazón reespectivameente.

Fig. 1: Extracción dee sangre en loos diferentes an

nimales empleeados para la práctica

FISIO
OLOGÍA ANIM
MAL 2
RES
SULTADOS
S:

1.- Registramos
R s los resultaados en tab
blas.

Fig. 2: Reesultados obttenidos

de la accción hemolíttica y
velocidad de hemolisis de las
diversas cconcentracion
nes de
NaCl empleadas en mu
uestras
de sangrre de an
nimales
pertenecienntes a cuatro clases:
AVES, MAMIFE
EROS,
S y ANFIBIOS.
REPTILES

Fig. 3:
3 Resultado del
d tratamientoo de las muesstras
de sanngre de Galluus gallus, dondde se aprecia que
tres de
d las concentrraciones emplleadas de clorruro
de soddio provocaroon hemólisis.

FISIO
OLOGÍA ANIM
MAL 3
 A B

C D

Fig. 4: Muestras de sangre de Gallus gallus vistas al microscopio después de ser sometidas a las
concentraciones antes mencionadas, 40 X. A) y B) concentraciones de NaCl 0.1 y 0.2 M respectivamente,
no presetaron hemólisis. C) Muestra sometida a NaCl 0.05 los eritrocitos presentaron hemolisis pero no
mostraron una ruptura abrupta. D) muestra sometida a NaCl 0.0125 M dio como resultado hemólisis.

2.- Discutiendo los factores que producen hemólisis.

En el hombre la reducción del número de eritrocitos y su contenido de hemoglobina es

causa de una amplia variedad de anemias, las cuales constituyen un grupo muy diverso
e importante de trastornos. Las anemias en general son debido a deficiencia nutricional
y/o genética, es decir carencia o deficiencia en la codificación de una proteína implicada
en el metabolismo del eritrocito. Generalmente del metabolismo de porfirinas o de las
enzimas que impiden el daño por estrés oxidativo. La hemolisis resultante de los
factores expuestos implica un posible daño peroxidativo y un aumento de oxidantes
intracelulares. Modificando su estructura e incrementando la susceptibilidad a ser
ingeridas por macrófagos. Ejemplo: Deficiencia del gen que codifica glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa.

FISIOLOGÍA ANIMAL 4
Es posible distinguir la hemólisis in vivo de la hemólisis in vitro comparando la muestra
hemolítica de un paciente con otras muestras del mismo paciente, llegadas al mismo
tiempo.

Hemólisis in vivo, La hemoglobina libre in vivo se une rápidamente a la haptoglobina y

el complejo se elimina de la sangre circulante (como en la anemia hemolítica). Por
consiguiente, la haptoglobina es reducida durante el proceso hemolítico intrabasal. La
medición de la baja concentración de haptoglobina permite así una evaluación
imperativa de la hemólisis (las excepciones son las deficiencias de la haptoglobina
innata y de los neonatos). De igual manera, la medición de la hemopexina y/o de la
metahemoglobina/albúmina fue utilizada para caracterizar la hemólisis in vivo.

Un aumento en la concentración de bilirrubina indirecta y conteos de reticulocitos son

signos típicos de hemólisis in vivo, lo cual a su vez conduce a una incrementada
eritropoyesis. Otras consecuencias de hemólisis in vivo, tal como un cambio en el
patrón de la isoenzima LDH, parece menos indicado para la identificación de la
hemólisis debido a su baja sensibilidad y especificidad diagnósticas.

Hemólisis in vitro, Durante la

hemólisis in vitro aumentan todos
los componentes de los eritrocitos,
incluyendo las actividades de las
concentraciones de potasio, del
lactato deshidrogenasa y del
aspartato- aminotransferasa,
sumándose a la concentración de la
hemoglobina libre en el plasma o
suero. En contraste, la concentración de haptoglobina en el plasma/suero de las muestras
hemolíticas permanece sin cambios. Sin embargo, debe tenerse en consideración que
ciertos métodos inmunológicos difieren en su capacidad para distinguir los complejos
hemoglobina/haptoglobina de la haptoglobina libre.

FISIOLOGÍA ANIMAL 5
3.- ¿Existe alguna relación entre las velocidades de hemólisis de estas tres muestras
de sangre?

La hemólisis física es debida a la destrucción de eritrocitos por hipotonicidad (dilución

de sangre con solución hipotónica). La curva obtenida se estabiliza en una recta que
representaría una relación directa entre el tiempo y la concentración. Esto sugiere que
un choque osmótico a una concentración alta produce hemolisis en un mayor tiempo
que un choque osmótico a una concentración baja de NaCl. Es decir mientras se agregue
mas sales a la dilución de la sangre inicial se pierde la hipotonicidad, necesaria para
provocar hemólisis mecánica, lo anterior se observa en aves y anfibios. Mientras en
mamíferos y reptiles, en nuestra experiencia los datos obtenidos generan una recta
constante, probablemente esto se debe a un sistema buffer subsistente después de la
dilución que le permite mantener la velocidad de hemolisis constante.
Los valores en blancos posiblemente se deben a la perdida de hipotonicidad de la
solución o estado isotónico. Estos resultados se comprobarían al aumentar el número de
individuos por especies y al realizar varias repeticiones, lo cual nos acercaría a
aclarecer la relación observada.

4.- ¿Cómo se podría determinar que una persona está hemolizando?

Se estima que 1g de hemoglobina produce 35 mg de bilirrubina. En los adultos

humanos, la formación diaria de bilirrubina es de alrededor de 250 a 350 mg
provenientes principalmente de la hemoglobina. La bilirrubina formada en los tejidos
periféricos se transporta en el hígado mediante la albumina plasmática. El metabolismo
subsecuente de la bilirrubina tiene lugar sobre todo en el hígado. Dicho metabolismo
puede dividirse en tres procesos:
- Captura de la hemoglobina por las células parenquimatosas del hígado.
- Conjugación de la bilirrubina con glucuronato en el retículo endoplasmatico
- Secreción de la bilirrubina de la bilis conjugada.

EL UROBILINOGENO Y LA BILIRRUBINA URINARIOS SON INDICADORES

CLÍNICOS
En la orina normalmente se presenta solo indicios de urobilinogeno, bilirrubina degrada
por la flora intestinal. En la obstruccion completa del conducto biliar no existe
urobilinogeno ya que la bilirrubina no tiene acceso al intestino, en el cual puede

FISIOLOGÍA ANIMAL 6
convertirse en urobilinogeno. En este caso, la presencia de bilirrubina (conjugada), sin
urobilinogeno, en la orina sugiere ictericia obstructiva, ya sea intrahepática o
extrahepatica.
En la ictericia secundaria a hemolisis, el incremento en la producción de bilirrubina da
lugar al aumento en la producción de urobilinogeno y este aparece en la orina en
grandes cantidades.

REFERENCIAS:

• Robert K. Murray, Harold A. Harper, 2004 BIOQUÍMICA ILUSTRADA

16º Ed. 751 pp.

FISIOLOGÍA ANIMAL 7