CUARTA PARTE

BIOMASA: EXTRACCION & CUANTIFICACION DE ACIDOS DEOXYRIBONUCLEICOS (ADN) TOTALES

UNA FORMA RAPIDA PARA ESTIMAR la biomasa total presente en una muestra es mediante la extraccin y cuantificacin de cidos deoxyribonucleicos (ADN) totales. Slo organismos vivos y viables poseen cidos nucleicos por lo que el anlisis de este constituyente celular es representativo de la abundancia de organismos en un ambiente natural. En trminos generales, las clulas son quebrantadas y homogenizadas con enzimas y detergentes. El ADN puede entonces ser precipidado y separado del debris celular. Finalmente, el ADN es cuantificado por espectrofotometra. Materiales & Equipos: Muestras ambientales (lodos activados, ros, charcas, suelo, etc.) Tubos de ensayo con 9 ml de 0.85 NaCl (para muestras de suelo) Agua destilada Solucin de TE-sucrosa (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8, 25% sucrosa) Solucin de TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) Solucin de Lisozima (5 mg/ml en 0.25 Tris, pH 8) Solucin 0.25 M de EDTA Solucin al 10% del detergente SDS Solucin de 10 mg/ml de RNasa A Solucin de 10 mg/ml de Pronasa E Solucin de 8 M de acetato de potasio

EXTRACCION ADN GENOMICO

Solucin al 95% de etanol Solucin de 5M NaCl Caldo fresco de TSB con Escherichia coli Microtubos estriles Micropipeteadores de 10, 100 y 1,000 l Puntas pre-eterilizadas para micropipetas Microcentrfuga Baos trmico a 37C Vortex Espectrofotmetro Cuvetas para espectrofotmetro

METODOLOGIA
1. Muestras: Colecte aspticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios lugares u obtenga muestras de agua (100 a 500 ml) de lagos, ros o charcas. Como control, trabaje con un cultivo freco de E. coli en medio de LB (5 ml). 2. Obtencin de biomasa: Para muestras lquidas, proceda a concentrar la biomasa mediante centrifugacin por 30 segundos a 14 Krpm de un mililitro de muestra (o del cultivo puro). Descarte el sobrenandante y aada 1 ml adicional de la muestra. Repita el paso de centrifugacin y descarte nuevamente el sobrenadante. Repita estos pasos hasta lograr obtener un precipitado en el fondo del microtubo que corresponda a aproximadamente 15-30 l de solucin. Anote el volumen total centrifugado para cada muestra. Para muestras de suelo, las clulas podrn ser removidas y homgenizadas aadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que contenga 9 ml de solucin salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex. Proceda entonces siguiendo las instrucciones anteriores para muestras lquidas. 3. Extraccion de ADN total: Procese cada muestre siguiendo las siguientes instrucciones. a. Aada 100 l de TE-sucrosa y resuspenda el precipidado celular agitando moderadamente con un vortex o manualmente. El TE es una solucin amortiguadora que mantendr de manera estable el ADN genmico. La sucrosa al 25% sirve para desestabilizar la envoltura celular mediante un choque osmtico. b. Aada 40 l de lisozima, 40 l de EDTA y mezcle usando el vortex. La lisozima es una enzima que cataliza el rompimiento de enlaces covlentes de la pared celular. Nuevamente, la intencin final es romper la envoltura celular y permitir que se libere el ADN a la solucin. El EDTA es un agente quelante que acta removiento traza de metales necesarios por endonucleasas para actuar. De

EXTRACCION ADN GENOMICO

esta manera se previene que las endonucleasas que estn presentes en el citoplasma de la clula acten degradando el constituyente celular de intres. c. Aada 175 l de agua destilada, 50 l de SDS y 5 l de RNasa. Mezcle bien e incube por 10 min a 37C. El SDS es un detergente que ayuda a solubilizar los constituyentes membranosos y de esta manera completar la destruccin de la envoltura celular. Previo a purificar el ADN, la solucin se trata con RNasa, enzima que hidroliza el ARN (cidos ribonucleicos), para eliminar y evitar interferencia de este constituyente celular en el anlisis final. ch. Aada 10 l de Pronasa E, mezcle e incube por 10 minutos adicionales a 37C. La Pronasa es una enzima que media la hidrlisis de protenas. De esta manera se mejora el rendimiento en la purificacin del ADN. d. Aada 165 l de TE (sin sucrosa), 120 l de 5M NaCl y 440 l de 8M acetato de potasio. Mezcle bien invirtiendo el tubo en repetidas ocasiones. Incube en hielo por 15 minutos. e. Centrifugue por 5 minutos a 14 Krpm. Bajo estas condiciones el ADN es soluble mientras el debris celular se precipita. f. Transfiera el sobrenadante cuidadosamente a un nuevo microtubo. Evite transferir el material blancusco y gelatinoso. g. Repita paso e y f. h. Llene el tubo con una solucin de 95% etanol y deje que el ADN se precipite durante el resto del da y la noche a temperatura ambiente. i. Centrifugue sus extractos por 15 minutos a 14 Krpm. En esta ocasin el ADN es el precipitado blancusco. Descarte el sobrenadante cuidadosamente y coloque el microtubo invertido sobre papel toalla. Permita que el tubo se seque de residuos de etanol (10 a 15 minutos aproximadamente). j. Resuspenda el ADN en 50 l de TE. Mezcle gentilmente hasta que resuspenda completamente al ADN. 4. Cuantificacin del ADN total: La cuantificacin del ADN se realizar mediante espectrofotometra utilizando el rango de luz UV. Debido a los anillos presentes en las bases nitrogenadas del ADN, esta molcula tiene absorvancia mxima a 260 nm. Para determinar pureza, se utiliza la razn de ADN/protenas. La abundancia de protenas residuales en el extracto se determina midiendo absorvancia a 280 nm. Un buen ADN (calidad y pureza) es aquel cuyo A260/A 280 es de 1.7 a 2.0. a. Transfiera 25 l del ADN puro a tubo limpio. Aada 475 l de TE y mezcle gentilmente. En este paso se diluye la cantidad de ADN a razn de 1 en 20 (factor de dilucin 1/20). b. Utilizando TE como solucin blanco, determine la aborvancia de cada muestra a 260 y 280 nm. Datos & Anlisis: Estima la biomasa de la muestra en funcin al estimado de ADN total utilizando la siguiente ecuacin:

EXTRACCION ADN GENOMICO

...donde g/ml de ADN = (Abs260 X Factor Dilucin X 50 g ADN/ml) 50 g ADN/ml es un factor de conversin

Estima ADN total: _____ g ADN/ml g = (Abs260 X 20 X 50 g ADN/ml)/(volumen muestra [ml o g]) Biomasa g ADN/ml g

Muestra E. coli Ambiente I Ambiente II

Abs 260

Abs 280

Abs 260/Abs280

Registra tus observaciones, particularmente cualquier modificacin(es) - hasta las mas pequeas - durante los pasos de este procedimiento de extraccin. El cuidado con que el ADN genmico extraido es importante. En un laboratorio de investigacin estas observaciones seran de gran utilidad para determinar "que fue bien o mal" durante los pasos de extraccin y para mejorar tu propio procedimiento en extracciones futuras. Notas - Modificaciones al procedimiento: Observaciones del ADN:

PREGUNTAS...
1. Qu significa Abs260/Abs 280 menores de 1.7? 2. Cules son las limitaciones principales de este mtodo en la estimacin de biomasa? 3. Cul de las muestras posee la mayor biomasa microbiana? Explique. 4. Qu es y cul es el rol de la lisozima y pronasa en la extraccin de ADN prokariota? 5. Qu modificacin hara usted a este protocolo de extraccin para evaluar la biomasa en una muestra de slo bacterias Gram negativo?