Universidad Tecnolgica de Puebla Carrera de Qumica rea Tecnologa Ambiental Asignatura: Microbiologa Ambiental PRCTICA NO.

7 NOMBRE: Metabolismo microbiano OBJETIVO: Identificar especies bacterianas a travs de su metabolismo, apoyndose en la aplicacin e interpretacin de pruebas bioqumicas. INTRODUCCIN: Para que una clula viva se desarrolle y reproduzca debe ser capaz de efectuar gran nmero de cambios qumicos, poder modificar los nutrientes del medio en que vive antes de que entren en ella y hacer transformaciones adicionales una vez que aqullos penetran. Algunos de los materiales son luego asimilados y pasan a formar parte de la clula mientras que otros, son descompuestos para obtener la energa que se requiere para la sntesis. Estos cambios tan complicados son efectuados por las enzimas, sustancias de origen proteico que se encuentran en las clulas en cantidades pequesimas y que pueden llevar a cabo todos los cambios que se asocian al proceso de la vida. Se les considera la parte activa de la clula. Existen algunas sustancias, tanto orgnicas como inorgnicas que, en pequeas cantidades, tienen la capacidad de acelerar las reacciones qumicas sin que se alteren ellas mismas despus de la reaccin; simplemente aceleran la velocidad hasta alcanzar el equilibrio de esta ltima sin que necesariamente la inicien. Las sustancias que se comportan as se llaman catalizadores o agentes catalticos. Las enzimas pertenecen a esta categora ya que funcionan como catalizadores del tipo orgnico y son producidas por los organismos vivos. De esta manera, se puede definir a la enzima como el agente cataltico orgnico producido por las clulas vivas. El conocimiento de las actividades bioqumicos o bioqumicas potenciales de un cultivo microbiano tiene muchas aplicaciones en Biologa, se emplea para la clasificacin y diferenciacin de los microorganismos. Algunos microorganismos producen enzimas capaces de romper grandes y complejas molculas de polisacridos (carbohidrasas), protenas (proteasas) o lpidos (lipasas).Cuando los organismos creen en medio que contienen uno de estos sustratos puede ponerse de manifiesto su degradacin debida a la presencia de enzimas. La identificacin de las Enterobacterias, que forman parte de la microbiota del intestino (Coliformes) se apoya en los procesos bioqumicos que estas bacterias realizan, considerando la definicin que describe a esta familia: Son bacterias gram negativas, la mayora bacilos, otros cocobacilos y otros pleomrficos. No son exigentes, son de fcil cultivo. Son capaces de reducir nitrato en nitrito. Son anaerbicos facultativos. No formadores de esporas Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaerbicas con o sin la produccin de gas (en especial glucosa y lactosa) Muchos gneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos gneros no son mviles. Los gneros ms representativos de esta familia son: 1

Universidad Tecnolgica de Puebla Carrera de Qumica rea Tecnologa Ambiental Asignatura: Microbiologa Ambiental Escherichia Salmonella Shigella Yersinia Enterobacter Klebsiella Proteus Citrobacter Serratia Las pruebas bioqumicas que utilizaremos para la identificacin de Enterobacterias de inters Escherichia y Salmonella- y son las siguientes: Caldo Urea Principio: determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos molculas de amonaco por accin de la enzima ureasa. Escherichia coli es ureasa negativa (no posee la enzima ureasa) Bases bioqumicas: el sustrato urea es una diamida del cido carbnico, a la que frecuentemente se menciona como carbamida. Todas las amidas (RCO-NH2) son rpidamente hidrolizadas. La hidrlisis de la urea es catalizada por una enzima especfica, la ureasa, para dar dos molculas de amonaco (base de Lewis). En solucin, la urea se hidroliza dando carbonato de amonio como producto final. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicin de los compuestos orgnicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en constitutivas (son producidas por las bacterias sin tener en cuenta la presencia o ausencia de su sustrato, la urea) o adaptativas (son producidas solamente cuando se encuentra presente su sustrato especfico). La Ureasa es considerada una enzima constitutiva, es una amidasa porque cataliza la hidrlisis de las amidas, rompe enlaces de unin entre carbono y nitrgeno. NH2 C=O + 2HOH CO 2 + H2O + 2NH3 NH2
UREA AGUA

DIX. DE CARBONO

AGUA

AMONACO

Interpretacin de resultados: una reaccin positiva se observa de color rojo rosado intenso en todo el caldo, esto debido al indicador rojo de fenol que contiene el medio (cido: color amarillo, alcalino: color rojo rosado). Una prueba negativa no produce cambio de color del caldo (amarillo paja como es el color original). Oxidasa Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.

Universidad Tecnolgica de Puebla Carrera de Qumica rea Tecnologa Ambiental Asignatura: Microbiologa Ambiental Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar a los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias. Realizacin de la prueba: Mtodo indirecto sobre papel Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aprox. en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas de reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a prpura-negruzco intenso. La reaccin positiva se produce a los 5-10 segundos.

Caldo Rojo de Metilo-Voges Proskauer Principio: Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Escherichia coli da un resultado positivo a esta prueba. Bases bioqumicas: la prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador del pH, rojo de metilo, para determinar la concentracin de iones hidrgeno (pH) presente cuando un organismo fermenta la glucosa. Todos los Coliformes, por definicin fermentan la glucosa produciendo despus de 18 a 24 h de incubacin, productos secundaros metablicos cidos, por lo tanto todos los Coliformes darn una reaccin positiva con el rojo de metilo. Sin embargo, despus de ms tiempo de incubacin como lo exige la realizacin de la prueba (2 a 5 das), aquellos organismos que son rojo de metilo positivos continan produciendo ms cidos y dan como resultado un bajo pH terminal, venciendo al sistema amortiguador de fosfato, y manteniendo un medio cido (pH: 4.2 o menos). Los organismos rojo de metilo negativos continan metabolizando los productos iniciales de la fermentacin (decarboxilacin) produciendo un pH neutro, lo que ocasiona que se eleve el pH terminal y disminuye la acides del medio (pH: 6 o ms). Reaccin general del metabolismo de la glucosa por la Escherichia coli (rojo de metilo positivo) 2 glucosa + H2O 2 cido lctico + cido actico + cido frmico + alcohol etlico + 2 CO2 + 2H2 (cido frmico H2 + CO2 Los organismos denominados Rojo de metilo (-) tambin producen cidos (actico, lctico y frmico), pero tienen una menor concentracin de iones hidrgeno porque hay una reversin hacia la neutralidad debida a la nueva degradacin de los cidos orgnicos en carbonatos y a la formacin de amonio debido a las protenas que se encuentran en el medio. Adems, por debajo de pH por debajo de 6.3 el cido actico es convertido 2,3 butanodiol, productos finales neutros; por lo tanto cesa la produccin de H2 mientras que aumenta la acumulacin de CO2. 3

Universidad Tecnolgica de Puebla Carrera de Qumica rea Tecnologa Ambiental Asignatura: Microbiologa Ambiental La validez de la prueba del rojo de metilo depende de un tiempo de incubacin suficiente como para permitir que se produzca la diferencia en el metabolismo de la glucosa. Los organismos en estudio se incubarn por lo menos 2 das a 35-37C lo que permite que todos los organismos con baja proporcin gaseosa (RM +) muestran su lmite en la concentracin de iones hidrgeno (bajo pH terminal), mientras que los que tienen una alta relacin gaseosa (RM - ) mostrarn una menor concentracin de hidrogeniones (alto pH terminal). Para la realizacin de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 35C durante un periodo de 3 das como mnimo y 5 como mximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirn para cada uno de los ensayos.

Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas (4-5) de solucin indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloracin. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo. Voges-Proskauer: A la otra porcin de cultivo se le aade:
o o

0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etlico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso. 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.

Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violceo, ms o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloracin alguna. Interpretacin de resultados. Prueba RM positiva, el cultivo es lo suficientemente cido como para permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga un definido color rojo (pH 4.4). Prueba RM negativa, color amarillo (pH 6). Precauciones. No debe intentarse interpretar un resultado con el rojo de metilo despus de menos de 48 h de incubacin. Si se realiza la prueba demasiado pronto, los resultados sern a menudo equvocos o falsamente positivos, Despus de slo 18 a 24 h de incubacin todos los resultados son RM positivos. Medio SIM, MIO Prueba de la Motilidad Principio. Determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen motilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran principalmente entre los bacilos, sin embargo algunas formas de cocos son mviles. Las bacterias pueden contener un solo flagelo o muchos. El medio de cultivo utilizado para la determinacin de motilidad debe ser semislido para permitir en su caso el movimiento de los microorganismos a un lado y otro de la lnea de inoculacin. Interpretacin de resultados. Prueba positiva (motilidad), los organismos mviles migran de la lnea de siembra y se difunden en el medio, provocando turbiedad. Pueden mostrar un crecimiento en estras vellosas. 4

Universidad Tecnolgica de Puebla Carrera de Qumica rea Tecnologa Ambiental Asignatura: Microbiologa Ambiental Prueba negativa (sin motilidad), crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la lnea de siembra, el medio circundante se mantiene claro. Prueba de Indol. Principio. Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar el indol de la molcula de triptfano, tal es el caso de la bacteria Escherichia coli. Bases bioqumicas. El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indlicos principales: indol, escatol e indolactico. Las enzimas que intervienen en este proceso reciben el nombre colectivo de triptofanasa El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las molculas que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una de las caractersticas importantes para la identificacin de microorganismos. La prueba se basa en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo, este es el principio activo de los reactivos de Kovacs o Ehrlich. El medio debe ser rico en Triptfano.

triptofanasa/desaminacin >

Indol + Acido Propinico o pirvico + NH3

Interpretacin de resultados. Prueba positiva, un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohlica. Prueba negativa, no se produce color en la capa alcohlica; la superficie toma el color del reactivo de kovacs o de Ehrlich (amarillo). Produccin de cido sulfhdrico Otro sistema de diferenciacin es la presencia del cido sulfhdrico en el medio; una sal, el citrato frrico de amonio, y una sustancia qumica, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar presentes, puesto que el resultado final es un mtodo en dos etapas. 1 Etapa: Bacteria (medio cido) + tiosulfato de sodio H2S g el cido sulfhdrico es un gas incoloro, por lo tanto, es necesario un segundo indicador para detectar en forma visible su produccin. 2 Etapa H2S + iones frricos FeS (precipitado negro insoluble). El precipitado negro del sulfuro ferroso que indica la produccin de H2S puede ocultar la condicin cida producida en la capa superior del medio, por lo tanto si se produce H2S es que existe una condicin cida, aun cuando no se le observe. Agar Hierro y Triple zcar Metabolismo de hidratos de carbono Principio. Determinar la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono especfico incorporado en un medio de crecimiento bsico, con produccin o no de gases, junto con la determinacin de posible produccin de cido sufhdrico. 5

Universidad Tecnolgica de Puebla Carrera de Qumica rea Tecnologa Ambiental Asignatura: Microbiologa Ambiental La produccin de cido sulfhdrico y/o las formas de fermentacin son generalmente caractersticas de los grupos, gneros o especies bacterianos especficos, sobre todo entre las Enterobacteriaceae. Bases bioqumicas. El medio sirve para la determinacin de las fermentaciones de los hidratos de carbono y determinacin de la produccin de cido sulfhdrico. El medio contiene dos hidratos de carbono: lactosa, con concentraciones del 1% y glucosa en concentracin de 0.1%. La fermentacin puede producirse con produccin o no de gases (CO2 + H2). La lactosa es un disacrido formado por dos unidades de monosacridos: glucosa + galactosa Glucosa cidos orgnicos (lctico, frmico, actico) + CO2 + H2 El medio de cultivo contiene peptonas, mismo que los microorganismos tambin utilizan para su desarrollo y crecimiento cuando no son capaces de degradar los azcares presentes en el medio, o en ausencia de stos. La degradacin de las peptonas producen la liberacin de amonaco (NH3) dando un pH alcalino que se identifica como color rojo debido al indicador presente en el medio (rojo de fenol: cido, amarillo y rojo, alcalino). Fermentacin solamente de la glucosa (alcalino/cido: rojo-amarillo) Se aprecia en microorganismos de fermentar solo la glucosa y no la lactosa. En el pico de flauta, en un lapso de 18 a 24 h de incubacin la baja concentracin de glucosa (0.1%) ha sido consumida por completo y el organismo comienza a utilizar las peptonas del medio, lo que aumenta el pH por la formacin de amonaco. Sin embargo, en la capa profunda, se observa un color amarillo debido a la degradacin de la glucosa (an disponible) ya que se encuentra en una proporcin al doble que en el pico de flauta. Fermentacin de la glucosa y lactosa (cido/cido): amarillo-amarillo) Algunos organismos tienen la facultad de fermentar tanto la glucosa como la lactosa, estando sta ltima en una concentracin diez veces mayor que la glucosa, por lo que en un perodo de 18 a 24 h la concentracin lactosa disponible an es suficiente para continuar manteniendo el pH cido debido a su fermentacin, despus de la fermentacin de la glucosa. No fermentacin de la lactosa ni de la glucosa (alcalina/alcalina: rojo/rojo) Algunas bacterias, sobre todo los bacilos no entricos gram negativos, son incapaces de fermentar la glucosa o la lactosa. Estas bacterias se encuentran en el tracto intestinal junto con miembros de la familia Enterobacteriaceae y es necesario para diferenciarlas de stas. Una bacteria que da un pico de flauta alcalino y una capa profunda alcalina, significa que degrada la peptonas tanto aerbicamente como anaerbicamente. Produccin de cido sulfhdrico Otro sistema de diferenciacin es la presencia del cido sulfhdrico en el medio; una sal, el citrato frrico de amonio, y una sustancia qumica, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar presentes, puesto que el resultado final es un mtodo en dos etapas. 1 Etapa: Bacteria (medio cido) + tiosulfato de sodio H2S g el cido sulfhdrico es un gas incoloro, por lo tanto, es necesario un segundo indicador para detectar en forma visible su produccin. 6

Universidad Tecnolgica de Puebla Carrera de Qumica rea Tecnologa Ambiental Asignatura: Microbiologa Ambiental 2 Etapa H2S + iones frricos FeS (precipitado negro insoluble). El precipitado negro del sulfuro ferroso que indica la produccin de H2S puede ocultar la condicin cida producida en la capa superior del medio, por lo tanto si se produce H2S es que existe una condicin cida, an cuando no se la observe. Material y reactivo Material 1 mechero bunsen 1 gradilla Balanza granataria 1 Agitador 1 Esptula 2 Matraz Erlenmeyer de 200 ml 1 Pipeta de 10 ml 25 tubos de 15x100 con tapa con rosca 1 pizeta con agua destilada 1 Probeta de 100 ml 1 matraz aforado de 100 ml 1 vidrio de reloj 1 vaso de precipitado de 100 ml 1 matraz aforado de 25 ml 1 pipeta de 1 ml Reactivos: Caldo Urea Reactivo de Ko vacs Caldo Rojo de Metilo- Voges Proskauer Agar Hierro Triple Azcar Medio MIO Medio SIM Agar EMB Agar Mac Conkey Alfa naftol Hidrxido de potasio (KOH) Alcohol etlico absoluto Agua destilada Material que deber traer el estudiante Asa bacteriolgica Cubrebocas Guantes Franela Masking tape Cerillos

Material biolgico 7

Universidad Tecnolgica de Puebla Carrera de Qumica rea Tecnologa Ambiental Asignatura: Microbiologa Ambiental Placas Petri con medio de cultivo EMB y Mac Conkey con crecimiento microbiano, provenientes de agua contaminada por materia fecal. PROCEDIMIENTO 1. Seleccionar una colonia con brillo metlico aislada- del medio EMB o una colonia del medio Mac Conkey 2. Con el asa bacteriolgica en punta picar con precisin la colonia elegida y sembrar las siguientes pruebas bioqumicas: Agar Hierro Triple Azcar. Picadura hasta el fondo y cola de pescado en pico de flauta Medio Mo: picadura en una sola va de entrada y salida Caldo Urea: agitacin *Caldo Rojo de Metilo: agitacin Caldo Lactosado: agitacin Incubar los tubos en la estufa a 35C por espacio de 24h. A los medio MIO y SIM poner unas gotas de reactivo de Kovacs para lectura de Indol. Para la prueba de Oxidasa, hacer la prueba rpida en papel Para la prueba de RMVP, proceder como se indica en la Introduccin de la prctica 3. Llevar a cabo la lectura e interpretacin de las pruebas y reportar conforme al siguiente cuadro. Nombre Produc Producci Movilid Acidez Acide Produc Degrada Rojo Oxidas de cin de n de ad por z por cin de cin de de a bacteria gas H2S Glucosa Lacto Indol la Urea Metil presunti sa o va

1. Incubar de 2 a 5 das * CUESTIONARIO: 1. Qu es una prueba bioqumica? 2. Cul es la importancia de la accin enzimtica en las pruebas bioqumicas? 3. Qu otras pruebas bioqumicas adems de las empleadas en esta prctica pueden emplearse para la identificacin de bacterias? BIBLIOGRAFA: 1. 2. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Jean F. Mac Faddin. Editorial Mdica Panamericana. 1 reimpresin, 1990 Microbiologa. Pelzar. Mc Graw Hill.