UNIVERSIDAD DE CHILE ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA MECESUP UCH0003 ASIGNATURA BIOQUIMICA APLICADA CINETICA ENZIMATICA EN HOJA DE CALCULO Autor:

Teresita Castillo 1 INTRODUCCIN

La cintica enzimtica es uno de los tpicos Fisicoqumico que tiene muchas aplicaciones en las ciencias mdicas. Las enzimas son agentes qumicos que ayudan a que los procesos bioqumicos del organismos se lleven a cabo a un velocidad compatible con la vida. Estos niveles enzimticos en plasma se analizan para detectar la enfermedad y llegar al diagnstico diferencial y pronstico de la misma. Para lograr determinar la actividad de las enzimas presente en el plasma se debe conocer los parmetros fsicos y qumicos de las enzimas. El estudio de la cintica requiere la aplicacin de conocimientos matemticos, los cules se pueden expresar en modelos grficos interactivos, para lo cul se usar el programa de hoja de clculo Excel. lo que permitir observar directamente los efecto de la manipulacin de los valores de sustrato, velocidades y constante cinticas como Km y Vm. 2 OBJETIVOS DE APRENDIZAJES

1.- Adquirir una mayor comprensin del efecto del sustrato sobre la velocidad de una reaccin enzimtica. 2.- Visualizador los cambios de la Km y Vm al manipular las concentraciones de sustrato. 3.- Analizar en los grficos de Linewaever -Burk los efectos de los inhibidores competitivos y no competitivos. 3 ACTIVIDADES DE APRENDIZAJES

1.- Cada grupo de estudiantes deber construir en el programa excel una hoja para automatizar el clculo de los parmetros Vm y Km mediante el grfico Linewaever- Burk 2.- Graficar la curva de Mickaelis Menten y Curva de Progreso

4 4.1

DESARROLLO Curva de Fenol

La lectura Do y la concentracin de Fenol presenta un comportamiento lineal entre ambos, con lo cual, conociendo la ecuacin que los une, es posible calcular la concentracin de fenol a partir de la lectura Do conocida. Tabla #1. Lecturas Fenol
Lect Do 0.043 0.056 0.119 0.264 0.371 0.495 0.608 0.727 0.935 1.178 mM fenol 0.04 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1

Curva de Fenol
Densidad Optica, Do 1.5 1 0.5 0 0 0.5

y = 1.1921x 2 R = 0.9985

1.5

mM Fenol, Sustrato

4.2

Actidadad Enzimtica Lectura Ensayo en Do: se multiplica x factor obtenido curva de fenol

DO x Factor = mM /min

4.3

Curva de Michaelis-Menten

Ecuacin de M-M
V = Vm S Km + S

La ecuacin de M- M explica la curva que se obtiene cuando los datos de velocidad se representan frente a la concentracin de sustrato. La curva resultante es una hiprbola rectangular donde es difcil determinar las constantes cinticas Vm y Km.

Tabla #2:Velocidad en funcin del Sustrato

S, mM Sustrato V, Velocidad (mmoles/min/ml)

0.078 0.117 0.195 0.39 0.78 1.17 1.56 1.95 2.92

0.00002277 0.00002388 0.00005666 0.00007366 0.00007677 0.00007955 0.0000908 0.0000927 0.0000944

Curva de Michaelis
0.0001 0.00009 0.00008 0.00007 0.00006 0.00005 0.00004 0.00003 0.00002 0.00001 0 0 1 2 Sus trato m M 3 4 Velocidad mmoles/min/ml

4.4

Grfico de Lineweaver Burk

Para determinar las constantes Vm y Km se representa la curva de Michaelis en forma lineal, la cual se realiza linealizando la expresin de M-M de la siguiente forma:
Vm S Km + S 1 Km + S = V Vm S 1 Km 1 1 = + V Vm S Vm

V =

De esta forma, la ultima expresin representa una lnea de tipo Y =mx+C, donde: Y = 1/V : Variable en eje y m = Km/Vm : Pendiente de la recta x = 1/S : Variable en eje x b = 1/Vm : Punto interseccin eje y As, graficando 1/V v/s 1/S y determinando la ecuacin de la recta (m y b) se encuentran los valores para las constantes cinticas Vm y Km. Tabla #3. Valores linealizacin de ecuacin M-M
1/S 12.8205128 8.54700855 5.12820513 2.56410256 1.28205128 0.85470085 0.64102564 0.51282051 0.34246575 1/V 43917.4352 41876.0469 17649.1352 13575.8892 13025.9216 12570.7102 11013.2159 10787.4865 10593.2203

Linewaever-Burk
60000 40000 1/V 20000 0 -5 -20000 0 5 1/S 10 15 y = 2936.2x + 8779.5 R2 = 0.9337

Igualando trminos...

1/Vm = 8779.5 Km/Vm = 2936.2

Vm = 0.0001139 mmoles/min Km = 2936.2*Vm 0.334mM

4.5

Curva de Progreso

Utilizando las expresiones ya determinadas, es posible estimar la hidrlisis del sustrato y/o las velocidades de inicio para cada tiempo. Tabla #4: Lecturas Do para distintos tiempos
Tiempo (min) 5 10 15 20 30 45 50 DO 0.26 0.48 0.425 0.615 0.848 0.838 1.124

Realizar: a.- Clculo de Fenol Producido b.- Determinar el fenol producido( mmoles)
Pendiente curva Do v/s Fenol Tiempo (min) 5 10 15 20 30 45 50 DO 0.26 0.48 0.425 0.615 0.848 0.838 1.124 1.1921
Fenol Poducido

0.21810251 0.40265078 0.35651372 0.51589632 0.71134972 0.70296116 0.94287392

Curva de progreso
Fenol Producido m m oles

1.5 1 0.5 0 0 20 40 60 Tiempo (min)