Cromatografa de lquidos de alta resolucin

Tipos
Cromatografa de reparto
En fase inversa En fase normal

Cromatografa de adsorcin o lquidoslido Cromatografa inica Cromatografa de exclusin por tamaos o en geles

Instrumentacin en HPLC

Instrumentacin para cromatografa de lquidos

Solventes de elevada pureza Velocidades de flujo moderadas para un tiempo de anlisis razonable. Filtracin de las muestras (1-10 m) La FM se obliga a pasar a travs de la columna (1000-5000 psi) instrumento mas elaborado que el CG Composicin nica de fase mvil-elucin isocrtica Composicin programada de fase mvil-elucin en gradiente

Sistemas para el tratamiento de los disolventes.

Filtrado. Desgasificadores. Elucin isocrtica
Utiliza una fase mvil de composicin constante

Elucin en gradiente
Dos o mas disolventes de polaridad distinta cuya relacin cambia a lo largo de la elucin cromatogrfica

Elucin isocrtica
B=acetonitrilo

Elucin en gradiente

Instrumentacin para cromatografa de lquidos

Bomba recproca

Sistemas de bombeo
Generar presiones por encima de 6000 psi Libre de pulsaciones Intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min. Reproducible Resistente a la corrosin Tipos
Bombas reciprocas Bombas de desplazamiento Bombas neumticas

Formada por cmaras donde el solvente se bombea debido al vai-ven de un motor de pistones. Dos vlvulas de bola se abren y cierran alternativamente controlando el flujo. Presiones hasta 10,000psi Volmenes internos pequeos Produce pulsaciones

Sistema de Inyeccin

Columnas para HPLC

Acero inoxidable 10-30 cm longitud 4-10mm dimetro interno 1-10m tamao de particula-40,00060,000 platos/metro

Se introducen pequeas cantidades de muestra (0.1-100L)

Columnas analticas

Tipos de rellenos de la columna

Tipos
Pelicular
Bolas de vidrio o polmero, no porosas y esfricas. Sobre su superficie se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina o una resina de intercambio inico Se utilizan ampliamente en las precolumnas

PRECOLUMNAS
Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensin y contaminantes de las disolvente. La composicin del relleno debe ser semejante a la columna analtica

Partcula porosa
Micro-partculas de slice

Partculas de slice (tamao de poro, 10 nm) a) Agregado de partculas esfricas, rea Superficial 150 m2/g b) Estructura esponjada, rea superficial 300m2/g.
Estructura esquemtica de slice

Columnas monolticas de slice.

Eficiencia de la columna en la cromatografa lquida

Efectos del tamao de partcula de relleno.

Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografa de lquidos.

Detectores

Las propiedades son las anteriormente descritas y adems deben de tener un volumen interno pequeo para reducir el ensanchamiento de pico Basados en una propiedad de la fase mvil (refraccin, densidad etc.) Basados en una propiedad del soluto (absorbancia en UV, fluorescencia etc.)

Tipos de detectores

Detector de absorbancia Detector de fluorescencia Detector de ndice de refraccin Detector de dispersin de luz Detector electroqumico Detector por espectroscopia de masas

Detectores de absorbancia (UV-VIS)

Detector de espectrometra de masas

Cubeta de flujo en forma de Z Para minimizar el ensanchamiento de banda extra-columna, el volumen de las cubetas debe ser lo menor posible de 1 a 10 micrmetros

Detectores de absorbancia

Detectores de absorbancia ultravioleta con monocromadores

Series de diodos:
Permiten recoger el espectro completo de la muestra Cromatogramas tridimensionales tiles para la determinacin cualitativa.

Detector de absorbancia en el infrarrojo

Con transformada de Fourier

Espectro de absorcin de un efluente que contiene una mezcla de tres esteroides tomado a intervalos de 5 segundos mediante un detector de series de diodos

Detector de fluorescencia

Detector de ndice de refraccin

La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin Semejantes a los detectores de absorbancia Altamente sensitivos

Detector de ndice de refraccin

Detector de dispersin de luz

El disolvente pasa a travs de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos estn separados por una placa de vidrio montada a un ngulo tal que si las dos disoluciones difieren en ndice de refraccin se produce una desviacin del haz incidente. Responden a casi todos los solutos Son muy sensibles a la temperatura Poco sensitivos.

Detector de dispersin de luz

Detector electroqumico

El efluente de la columna pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de N2 o aire. Las finas gotas se llevan en un tubo de conduccin a temperatura controlada y ocurre la evaporacin de la FM y unas finas partculas de analito que pasan a travs de un haz de rayo lser. Mediante un fotodiodo de slice se detecta la radiacin dispersada perpendicular al flujo Mas sensitivo

Se basan en mtodos electro analticos (amperometra, voltametra, conductimetra y coulombimetra) Elevada sensitividad El analito debe contener grupos susceptibles de sufrir procesos redox

Cromatografa de lquidos de alta resolucin

Tipos
Cromatografa de reparto
En fase inversa En fase normal

Cromatografa de adsorcin o lquidoslido Cromatografa inica Cromatografa de exclusin por tamaos o en geles

Cromatografa de reparto

Mtodo mas popular. Analitos de peso molecular bajo (PM<3000) Polares o no-polares Columnas con fase estacionaria unida (liquido unido qumicamente a un soporte de slido de partculas) 3,4 o 10m de partculas de slice hidrolizadas recubiertas con siloxano
R1 Si R2 O n

Cromatografa de reparto

Fase inversa

Fase inversa (FI)

Fase mvil polar/ Fase estacionaria no polar

Fase normal (FN)

Fase mvil no polar/ Fase estacionaria polar

Mas ampliamente utilizada Solvente de alta polaridad-solutos de alta polaridad eluyen en primero. R= mas comn- C8 (n-octil) o C18 (n-octildecil) Los grupos estn en posicin perpendicular a la superficie generando una estructura de cepillo o brocha. Cuanto mayor es el numero de tomos de carbono en R mayor es la eficacia. Elucin a pH>7.5 puede ocurrir hidrlisis del siloxano

Fase Normal

FM de baja polaridad/ FE polar Solutos poco polares eluyen primero Incrementar la polaridad de la FM tienen el efecto de reducir el tiempo de elucin. R-Polar- ciano, diol, amino, dimetilamino. FM-baja polaridad- til ter, cloroformo, hexano

Establecimiento del mtodo en Cromatografa de reparto.

Establecimiento del mtodo en Cromatografa de reparto.

Mas complejo que en CG

En CG la FM solo transportaba al soluto En HPLC la FM interacciona con el soluto

Seleccin de columna - basado en las fuerzas intermoleculares de los 3 componentes ( soluto, FE, FM). La polaridad de la FE debe ser semejante a la de los analitos y FM polaridad distinta.

Seleccin de la fase mvil Solventes polares interaccionan mas con analito polares- eluyen ms rpido pero con menor resolucin Cuantitativamente se describe la polaridad con el ndice de polaridad P
Varia de 2 ( no-polar) a 10.2 ( altamente polar) En una mezcla
PAB= APA+ B P B En HPLC el factor de capacidad kpuede ser manipulado cambiando la composicion del solvente Mejor relacion resolucion/tiempo cuando k=2-5

Cromatografa de absorcin

Cromatografa liquido-slido FE= slice o almina Seleccin de la FM

Para optimiza ky se varia la composicion de la FM-se utiliza la fuerza del eluyente o. Se eligen dos solventes compatibles uno con opequena y otro con ogrande. Se varian hasta obtener una k adecuada.

Cromatografa de adsorcin

Aplicaciones
Compuestos no polares con masas <5000 Muestras solubles en disolventes no polares Capaz de diferenciar entre compuestos ismeros

Cromatografa inica

Separacin de iones FE= resinas de intercambio inico FM= disoluciones acuosas con algn disolvente orgnico o disoluciones reguladoras. Detector de conductividad.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO RESINAS

Cromatografa inica

El uso de detectores de conductividad tienen el inconveniente de que requieren una elevada concentracin de electrolito en la FM para eluir al analito
La conductividad de la FM enmascara a la de los analitos

Solucin: COLUMNAS SUPRESORAS inmediatamente despus de la columna analtica.

Relleno de resina de intercambio inico que convierte los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas

Cromatografa inica

Cromatografa de exclusin por tamaos

Separacin de compuestos de alto peso molecular- protenas y polmeros, cidos grasos, azucares FE= partculas polimricas o de slice que contienen una red de poros
Las molculas son atrapadas en los poros y eliminadas por el flujo de FM. molculas > poro son excluidas- salen antes molculas < poro penetran y eluyen despus. Molculas ~ poro se retienen, tiempo de elucion intermedio.

Cromatografa de exclusin