Introduccin a la Biologa Celular y Molecular

TP6: Western blot

Objetivos
Familiarizarse con la tcnica de western blot. Determinar los niveles de IgG en sueros murinos Comparar la sensibilidad del western blot vs el SDS page

Introduccin
La transferencia de protenas o blotting supone la inmovilizacin de las protenas (o cidos nuclicos) sobre membranas sintticas, seguido de la deteccin empleando sistemas especialmente diseados para la tincin de blots. El mtodo para protenas ms potente es el denominado Western blot en el que las protenas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (s, el viejo y conocido SDS-PAGE) y posteriormente se transfieren a una membrana, mediante la aplicacin de un campo elctrico perpendicular al gel (electroblotting). Una vez completada esta operacin la protenas de inters son reveladas por el agregado de un anticuerpo especfico. El nombre Western (oeste, occidental) le fue dado por el investigador W. Neal Burnette (Analytical Biochemistry, 112:195-203, 1981) como un juego de palabras por los nombres Southern y Northern de las tcnicas que se usan con el mismo fin pero que son aplicadas a los cidos nucleicos. Luego que Edwin Southern diseara la tcnica que lleva su nombre para detectar ADN, por oposicin se denomin Northern a la tcnica aplicada al ARN. Finalmente como una broma, la tcnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para protenas fue denominada Western. El electroblotting es el mtodo donde las protenas son transferidas desde el gel a la membrana electroforticamente. La ventaja de este proceso es su corta duracin (de 30 minutos a pocas horas), lo que reduce notablemente el efecto de difusin de las bandas. El procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre una esponja plana papel de filtro empapado en buffer de transferencia, el gel, la membrana en contacto directo con el gel, ms papel de filtro y finalmente una esponja plana. Este conjunto se recoge entre dos capas de plstico Figura 1: Disposicin del cassette para la electrotransferencia perforado y se introduce en una

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cuba en el que se encuentra una solucin salina (buffer de transferencia) y dos electrodos planos (diseados para conseguir un campo uniforme en toda la superficie del gel). Se dispone de forma que el gel quede hacia el nodo (-) y la membrana hacia el ctodo (+) (figura 1). La carga neta de las protenas en el caso de los geles de SDS-PAGE es negativa debida a la carga del SDS. La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separacin entre electrodos), que suele corresponder a 0,3 a 2 Ampere de 1 a 4 horas. La velocidad de transferencia es inversamente proporcional al tamao de la protena. El proceso provoca un fuerte calentamiento de la solucin por lo que se recomienda refrigerar el sistema y recircular el buffer (esto es, se agrega un agitador magntico y un refrigerante congelado en la cuba). Una vez realizada la transferencia la membrana se puede analizar inmediatamente o bien conservarla en fro (2 a 8 C) durante meses. Existen diferentes combinaciones de soluciones de transferencia y de membranas para cada aplicacin. En la siguiente tabla se incluyen algunas de las ms caractersticas: Gel SDS-PAGE (Lammeli) O'Farrell 2D SDS-PAGE 25 mM Tris, 192 mM glicina, pH 8.3 O'Farrell 2D 25 mM fosfato sdico, pH 6.5 Native PAGE (protenas 15 mM borato sdico, pH 9.2 acdicas o bsicas) IEF, Native-PAGE (protenas bsicas), geles de urea cidos 0,7% cido actico Buffer de transferencia 25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% v/v metanol, pH 8.3 Membrana Nitrocelulosa Papel de intercambio inico PVDF Nitrocelulosa, Nylon, Papel de intercambio inico, PVDF, papel diazo-modificado papel diazo-modificado papel diazo-modificado Nitrocelulosa, Nylon, papel diazo-modificad

El grosor del gel es un factor que influye notablemente en la transferencia, siendo muy ineficiente a partir de geles de 2 mm de espesor, y tanto ms eficiente cuanto ms fino es el gel, con un lmite mnimo de 0,4 mm aproximadamente, debido a los problemas de manipulacin. Es importante incorporar en el gel a transferir un control de la transferencia que habitualmente es la calle donde se ha cargado el marcador de peso molecular que al transferirlo se tie sobre la membrana para ver si la transferencia de toda la gama de pesos moleculares ha sido correcta. Existen algunas variantes a la transferencia electrofortica descrita previamente. El sistema ms extendido es el 'Semi-Dry blotting' en el que los geles son sometidos a una intensidad de corriente elevada entre dos electrodos planos entre los que se coloca una pila formada por papel, el gel, la membrana y ms papel, empapados en el buffer de transferencia. El nico lquido que hay es el que empapa los papeles. La ventaja de este sistema es su rapidez, consiguiendo transferencias en pocos minutos. Dot blot Existen tambin otros mtodos para transferir o aplicar protenas sobre una membrana. El ms sencillo es aplicarlas directamente en forma de una pequea gota de una solucin concentrada sobre la membrana. La absorcin de la gota provoca la adhesin de la protena a la membrana, quedando en forma de una mancha o dot (es el caso del dot blot). Existen dispositivos que facilitan la aplicacin de las protenas directamente a la membrana, aplicando una succin

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que facilita la penetracin de la solucin, y reciben los nombres de dot blot o slot blot en funcin de que la protena quede aplicada en forma de una gota circular o de una lnea. En la imagen se muestran dos de estos dispositivos:

Dispositivo para 'dot blot' de la empresa BioRad

Esquema de un dispositivo de 'slot

blot' y ejemplo

Membranas Trabajar con las protenas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre el emplearlas dentro del gel Las membranas pueden incubarse fcilmente con anticuerpos para la deteccin de protenas especficas Son ms rpidas de teir y desteir Se detectan cantidades menores de protenas, ya que se concentran en la superficie y no se diluyen en todo el espesor del gel Las membranas son mucho ms fciles de manipular que el gel Una membrana que se emplea frecuentemente es la nitrocelulosa, aunque cuando se requieren soportes ms robustos, por ejemplo cuando la membrana ha de ser reutilizada diversas veces se recurre al Nylon. Sin embargo las membranas de Nylon se bloquean con ms dificultad que las de nitrocelulosa y suelen presentar mayor background (marca inespecfica). Las membranas de PVDF tienen gran capacidad de unin a protenas y gran resistencia mecnica y en general son las ms utilizadas actuamente. En general las membranas son hidrofbicas y requieren un tratamiento previo con metanol antes de sumergirlas en soluciones acuosas. Deteccin de inespecfica protenas totales sobre la membrana Habitualmente se emplean tcnicas de tincin de protenas sobre las membranas como control de la transferencia. En este caso, se tien la totalidad de las protenas presentes, de manera inespecfica. Los colorantes que permiten teir las protenas en los geles de poliacrilamida no son utilizables en las membranas pues se unen irreversiblemente a stas. Para teir las protenas en las membranas se emplean: Rojo Ponceau (se pronuncia puns), Tinta china o Negro Amido.

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El Rojo Ponceau se emplea en forma de solucin acuosa. La tincin es rpida pero no es permanente y puede desaparecer en el procesamiento posterior. Como la tincin desaparece es compatible con casi todos los procedimientos de deteccin con anticuerpos. El mtodo de tincin con tinta china es reproducible, sensible y permanente, y no interfiere con los procedimientos de inmunodeteccin, pero puede tapar la tincin colorimtrica del proceso inmunoqumico. La tincin se basa en la adherencia preferente de las partculas coloidales de carbn de la tinta sobre las protenas inmovilizadas. La destincin se hace en PBS. El negro amido es menos sensible que la tinta china. Las bandas aparecen negras sobre un fondo azul claro. Despus de la tincin puede desteirse con una solucin de metanol/cido actico. Este mtodo de tincin es incompatible con la inmunodeteccin posterior. Existen otros productos comerciales como AuroDye-R de Amersham que acta como colorante para protenas sobre las membranas. Se trata de una solucin coloidal estabilizada de oro a pH 3. A este pH las partculas de oro estn cargadas negativamente y se unen especficamente a las protenas. No se puede usar sobre membranas de Nylon pues se une inespecficamente a las cargas de la membrana. El color obtenido es rojo oscuro. Existen sistemas de amplificacin de seal. Este mtodo tiene una sensibilidad similar al de la tincin con plata de los geles. Bloqueo de la membrana La membrana posee gran afinidad por las protenas, lo que es una ventaja al momento de transferir las protenas de inters en el protocolo de westerblot. Sin embargo, los pasos posteriores de deteccin involucran la incubacin de la misma con anticuerpos (que tambin son protenas) que deberan unirse especficamente con las protenas a detectar. Una etapa comn a todos los procedimientos de inmunodeteccin es el bloqueo, para prevenir la unin no especfica del sistema de deteccin a la membrana. El paso de bloqueo evita que los anticuerpos y otras protenas involucradas en la deteccin se peguen inespecficamente a la membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado background o falsos positivos. El bloqueo implica la saturacin del sistema con protenas no especficas. Se han descrito numerosas soluciones bloqueantes que han resultado efectivas. El factor esencial a tener en cuenta es elegir un sistema de bloqueo compatible con el sistema de deteccin empleado. Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema de deteccin son las soluciones de leche descremada y las soluciones de albmina srica bovina (BSA). Tambin se recomienda el bloqueo en Tween-20 (es un detergente) si hay demasiado background. Sin embargo es conveniente usar con cuidado los detergentes no inicos como pues pueden solubilizar las protenas transferidas a la membrana. En la tabla siguiente se recogen algunas de las soluciones de bloqueo comnmente empleadas: Agente bloqueante Caractersticas 5% de leche descremada en PBS /TBS. Muy econmico. Con poco Leche en polvo 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antgenos. Econmico. 5% de leche desnatada en PBS/TBS - 01% Tween-20. Con Leche / Tween-20 poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antgenos. 0.1% Tween-20, 0.02% azida sdica en PBS/TBS. Econmico. Permite la Tween-20 tincin despus de la inmunodeteccin. Puede quedar un 'background' residual.

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BSA Suero de caballo

3% BSA, 0,02% azida sdica en PBS. Bueno. Relativamente econmico. 10% suero de caballo, 0,02% azida sdica en PBS. Sin 'background'. Moderadamente caro. Incompatible con algunos anticuerpos antiinmunoglobulinas.

Deteccin especfica de protenas sobre la membrana (REVELADO) En la tcnica de Western blot se emplea comnmente el sistema de inmunodeteccin indirecta. En este mtodo se emplea un anticuerpo para localizar la protena de inters (anticuerpo primario) y un segundo anticuerpo que detecta el anticuerpo primario (anticuerpo secundario). Este anticuerpo es el que posee alguna una marca capaz de producir una seal detectable El tipo de anticuerpos empleado en la deteccin de las protenas transferidas a la membrana no es determinante. Existen anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales pueden ser altamente especficos y en general, son ms sensibles que los monoclonales. Sin embargo los anticuerpos monoclonales, a diferencia de los policlonales, mantienen siempre sus propiedades de reconocimiento independientemente del lote. Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos obtenidos inoculando en la especie productoras inmunoglobulinas de la especie a detectar (anticuerpos anti-especie). Tambin se emplean los fragmentos Fab2, producidos mediante digestin con pepsina de los anticuerpos puros, y que, al carecer de regin Fc no interfieren con algunos componentes de los tejidos que pueden estar presentes en las muestras biolgicas complejas, reduciendo el background. Eleccin del sistema de revelado El revelado empleados comnmente en Westernblot est asociados a enzimas, que catalizan una reaccin en la que se forma un precipitado coloreado, o en la que se emite luz. Las dos enzimas ms empleados para marcar los anticuerpos son la peroxidasa de rbano y la fosfatasa alcalina. La utilizacin de sustratos colorimtricos se basan en la formacin de un producto coloreado insoluble que precipita sobre la membrana en el lugar de accin del enzima. Este tipo de reacciones es irreversible, ya que una vez formado el precipitado, no puede reutilizarse la membrana. La reaccin quimioluminiscente ocurre cuando la energa de una reaccin qumica se emite en forma de luz. El sustrato quimioluminicente ms utilizado es el luminol. La reaccin de oxidacin de este sustrato catalizada por la que se emplea con la peroxidasa de rbano (HRP) en presencia de perxido de hidrgeno. Inmediatamente despus de su oxidacin, el luminol se encuentra en un estado excitado del que pasa a la situacin basal, reducida, ms estable, emitiendo luz. Si esta reaccin se produce sobre una membrana, y sta se pone en contacto con una pelcula de autorradiografa, queda impresionada. Este sistema tiene la ventaja de que permite eliminar el sistema de anticuerpos secundarios (striping) y volver a analizar la membrana con otros anticuerpos (reprobing); es decir, es reversible. Ejemplo de la tcnica Western Blot. En la figura 2 se muestra un ejemplo de esta tcnica, donde puede observarse el perfil proteico (2.A) de dos muestras de clulas tumorales tratadas con un inhibidor de una protena (Akt) que interviene en una va de sealizacin importante para la sobrevida celular y que fueron reveladas con Coomassie Blue. En la figura 2.B se muestran los mismos extractos celulares pero luego de la corrida electrofortica las protenas se transfirieron a una membrana de PVDF y se realiz un western blot incubando con una solucin de anticuerpos policlonales contra Akt

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activado. La banda que se observa en 2.B corresponde a la protena Akt. Se puede apreciar el efecto del inhibidor sobre estas clulas por la disminucin del tamao de la banda en la calle del Tratado si se la compara con la muestra Control.
Control Tratado A Control Tratado B Figura 2: Comparacin entre la visualizacin de una mezcla de un extracto crudo de protenas de clulas tumorales y el reconocimiento de los niveles de una protena particular del mismo extracto proteico.

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm

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Procedimiento
1. Se realizar un SDS-PAGE en un gel 7%. Se sembrarn 10 muestras conteniendo 1 l de diluciones 1/2 de suero de ratn, partiendo desde una dilucin 1/10. 2. Retirar el gel entre los vidrios con cuidado y realizar un lavado con TBS. Reservar hasta el armado del cassette. 3. En un tupper colocar el transfer buffer 1 x fro con metanol y colocar el cassette, las esponjas y el papel de filtro. 4. Activar la membrana con metanol (hasta cubrir) e incubar durante 15 segundos. Realizar 5 lavados rpidos con agua destilada. Colocar en el tupper preparado para armar el cassette de transferencia. 5. Armar el cassette siguiendo el orden: tapa negra, esponja, papel de filtro, membrana, gel, papel de filtro, esponja, tapa transparente. Controlar que no queden burbujas entre los elementos colocados ya que el aire impide la transferencia. 6. Cerrar el cassette y colocarlo en la cuba con ms transfer buffer y el refrigerante. 7. Correr a 37 mA durante 30 minutos en agitacin. 8. Teir las membranas con rojo ponceau por 30 segundos 9. Lavar el colorante con H2Od hasta ver las bandas. Analizar la calidad de la transferencia visualmente y anotar las observaciones. 10. Una vez que se realiz la transferencia, marcar con lpiz de manera de identificar el orden de siembra. 11. Dejar en solucin de bloqueo (5% de leche en polvo) 30 min a temperatura ambiente. 12. Realizar 2 lavados de 30 segundos con TBS. 13. Incubar las membranas con 5 ml del anticuerpo marcado con biotina (Goat anti Mouse IgG) preparado en solucin de bloqueo, durante 45 minutos a 37C en agitacin. 14. Realizar 3 lavados de 3 minutos con TBS-T. 15. Incubar las membranas con streptoavidina-peroxidasa (preparado en solucin de bloqueo) durante 20 minutos a 37C con agitacin. 16. Para revelar mediante quimioluminiscencia se deben preparar dos soluciones en tubos diferentes correctamente rotulados. Solucin 1: 100 l de Luminol 44 l de cido p-cumrico 1 ml de Tris- HCl 1M pH 8.5 Llevar a volumen final 10 ml com H2O En oscuridad: Solucin 2 : 6,1 l de H2O2 1ml de Tris-HCl 1M pH 8.5 Llevar a volumen final 10 ml com H2O

17. Unir ambas soluciones y colocar la membrana asegurando que el lquido cubra perfectamente
toda la membrana. Incubar durante 3 minutos.

18. Retirar la membrana y colocarla dentro del cassette. Colocar la placa fotogrfica y revelar.