PRUEBAS BIOQUMICAS ENTEROBACTERIAS

PARA

LA

IDENTIFICACIN

DE

OBJETIVO El alumno observar algunas reacciones bioqumicas relacionadas con la fisiologa bacteriana, a la vez aprender su utilizacin para la identificacin de enterobacterias GENERALIDADES El estudio bioqumico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios bacteriolgicos es posible gracias a las reacciones fisiolgicas y qumicas que llevan a cabo los microorganismos. Para esto se emplean medios de cultivo enriquecidos con productos tiles para el metabolismo celular, los cuales adems contienen algn indicador que hace cambiar el color del medio al efectuar dichos microorganismos sus funciones. Los organismos varan en su capacidad para utilizar diferentes compuestos ( por ejemplo: carbohidratos, urea, citrato, etc.) para algunos microorganismos que se usan en su identificacin en el laboratorio. De acuerdo a los productos de su actividad qumica, las bacterias se pueden clasificar como: 1. Zimgenas: las que fermentan los carbohidratos, desdoblndolos en alcohol, cido lctico o actico. 2. Aergenas: las que producen gas como hidrgeno y dixido de carbono como resultado de su actividad metablica. 3. Anaergenas: las que no producen cantidades visibles de gas durante su actividad metablica. 4. Cromgenas: las que producen pigmentos solubles o insolubles. 5. Fotgenas: las que causan putrefaccin y producen una dbil fosforescencia ( algunas bacterias marinas) Entre las pruebas bioqumicas ms comunes tenemos: Caldos de carbohidratos con indicador de pH, rojo de fenol: Al fermentar algunos carbohidratos, muchas bacterias producirn cido, y con un medio con pH original alrededor de 7.4 al bajar ste a 6.8 por el cido que produce un cambio de color gracias a la incorporacin de un indicador de pH como es el rojo de fenol. Agar de hierro y triple azcar (TSI) El agar TSI es uno de los ms usados para ver la fermentacin de carbohidratos en la familia Enterobacteriaceae. Se pueden tener varias posibilidades de fermentacin de acuerdo a las caractersticas metablicas del microorganismo como son: Utilizacin de glucosa sola. Los microorganismos que fermentan solo la glucosa provocan en este medio una reaccin alcalina en la superficie ( roja) sobre un fondo cido (amarillo, k/a) debido a que realizan una degradacin aerbica de la glucosa en la superficie, convirtiendo el piruvato en agua y dixido de carbono. Despus de 18 a 24 horas de incubacin como la concentracin de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio, causando la liberacin de amoniaco y produciendo un pH alcalino ( rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay oxgeno, se realiza una degradacin anaerbica y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el pH disminuye quedando el pH cido ( amarillo).

Utilizacin de lactosa y/o sacarosa. Algunos microorganismos tienen la facultad de fermentar la glucosa y la lactosa resultando una reaccin cida en la superficie (amarilla) y cida en el fondo (amarilla, a/a). En este caso despus de 18 a 24 hrs como la concentracin de lactosa es alta (1.0%), o sea 10 veces ms que la de la glucosa presente, no se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el fondo como en la superficie. En el caso de usar sacarosa la reaccin sera la misma. Sin utilizacin de ninguna de las anteriores. En el caso de no utilizar ninguno de los carbohidratos presentes (glucosa, lactosa y sacarosa), lo que se usara seran las peptonas, ya sea aerbicamente o anaerbicamente. Slo utilizndolas aerbicamente dara una superficie alcalina (roja, k) sobre un fondo sin cambio (sc) o sea k/sc). Si las usara aerbicamente dara una superficie alcalina (rojo) sobre fondo alcalino (rojo) o sea k/k. En este medio tambin es posible detectar la produccin de gas por la formacin de burbujas dentro del medio, y la produccin de cido sulfhdrico, el cual reaccionar con un indicador con base de fierro dando un color negro debido al sulfuro de hierro formado. Agar de hierro y lisina (LIA) Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilacidon de los aminocidos por induccin de enzimas especficas, el resultado de esta descarboxilacin es la produccidon de una amina ( o diamina) y dixido de carbono. Tal es el caso de la produccidon de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina. En el medio LIA se puede detectar la produccn de la lisina descarboxilasa ya que se produce una reaccin coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como indicador prpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en el fondo indica una reaccidon cida por la fermentacin de una pequea cantidaad de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la accin de esta enzima sobre la lisina dar lugar a la cadaverina, la cual provocar un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa. As pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida. Prueba del citrato de Simmons Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el citrato como nica fuente de carbono en una serie de reacciones como sigue: CITRATO OXALACETATO + ACETATO OXALACETATO PIRUVATO + CO 2 PIRUVATO ACETATO + LACTATO + CO Los cidos orgnicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El pH alcalino as logrado hace que el indicador de pH en el medio, el azul de bromotimol vire de su color verde original a un azul intenso. Prueba de la ureasa La hidrlisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima especfica, la ureasa, dando lugar a dos molculas de amonio, agua y dixido de carbono. Todo esto da lugar a un cambio en el pH, lo que causa que cambie el color original del medio (amarillo) a un color rojo bugambilia por el indicador rojo de fenol. De acuerdo a la degradacin de la urea el color ser ms o menos intenso. (NH2)2C=O + 2H2O---> CO2+2NH3+H2O (NH4)2CO3

Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina) Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la produccon de indol y descarboxilacin de la ornitina. La movilidad se detectar por la presencia de turbidez alrededor del punto de inoculacin. El indol se formar si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa que desdoblar el aminocido triptfano en indol, cido pirvico y amonio. El indol es incoloro pero al reaccionar con el reactivo de Kovacs (p-dimetil-aminobenzaldehido) que se adiciona despus de que creci la bacteria, dar un color rojo violeta. Por lo que respecta a la descarboxilacon de la ornitina como el medio tiene prpura de bromocresol y una pequea cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se produce un color amarillo en el fondo (ornitina descarboxilasa negativa), sin embargo al descarboxilarse la ornitina se produce putresina la cual es alcalina y sobrepasa la acidez dada por la fermentacin de las glucosa resultando en un color morado en el fondo MATERIAL Y EQUIPO Aguja bacteriolgica Mechero de Bunsen Gradilla Medios de cultivo (4 tubos cada uno) Agar de hierro y triple azcar (TSI) Agar de hierro y lisina (LIA) Agar Citrato de Simmons Agar Urea segn Christensen Medio de MIO TCNICA 1. Marque perfectamente cada uno de sus tubos, usando una serie de TSI, LIA, Urea, Citraro y MIO 2. Inocule una serie para cada cepa como sigue: FORMA DE INOCULAR MEDIO TSI Superficie - picadura LIA Superficie - picadura Citrato de Simmons Superficie Agar Urea Superficie MIO Picadura 3. Tape los tubos procurando no apretar demasiado los tapones 4. Incube a 35 C por 24 hrs. 5. Lea e interprete los resultados de acuerdo a las tablas de identificacin PRESENTACON DE RESULTADOS 1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y despus de inocular), utilizando los colores apropiados. 2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En caso de no corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus pruebas bioqumicas, especifique de que bacteria se trata.