Beta-amiloide

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Beta amiloide

Superficie y estructura secundaria del beta-amiloide

HUGO

620

Smbolo

APP

Smbolos alt.

AD1

Datos genticos

Locus

Cr. 21 q21.2

Bases de datos

Entrez

351

OMIM

104760

RefSeq

NM_000484

UniProt

P05067

La -amiloide es un pptido de 36 a 43 aminocidos que se sintetiza a partir de la Protena precursora amiloide (APP). Aunque es generalmente conocida por su relacin con la enfermedad de Alzheimer, no existe especficamente con ese fin. Se ha encontrado evidencia de que la -amiloide tiene mltiples actividades no asociadas con la enfermedad.1

Contenido
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1 Acitividad Normal de -amiloide 2 Asociacin con Enfermedades 3 Formacin 4 Placas seniles 5 Gentica 6 Estructura 7 Estrategias de intervencin 8 Ritmos circadino del -amiloide 9 Medicin del -amiloide 10 Referencias

[editar] Acitividad Normal de -amiloide

Estas funciones no asociadas con Alzheimer incluyen la activacin de quinasas,2 3 la proteccin contra estrs oxidativo,4 5 regulacin del transporte de colesterol6 7 actuando como un factor de transcripcin8 9 y actividad antimicrobiana (especialmente asociado con su accin pro-inflamatoria).10

[editar] Asociacin con Enfermedades

La -amiloide es el principal componente de las placas seniles (depsitos que se encuentran en el cerebro de los pacientes con la enfermedad de Alzheimer). Sin embargo, existen placas similares en otras demencias como en Cuerpos de Lewy y en miositis por cuerpos de inclusin (enfermedad muscular), y, adems, la -amiloide tambin puede formar agregados que cubren vasos sanguneos cerebrales en la angiopata amiloide cerebral. Las placas se forman por una red irregular de agregados fibrilares llamadas fibras amiloides,11 un plegamiento proteico asociado a otros pptidos como los priones, protenas patgenas alteradas que tienen un plegamiento incorrecto. Investigaciones recientes sugieren que las

formas solubles de las estructuras oligomricas del pptido pueden ser agentes causales del desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.12

[editar] Formacin
A se forma por la escisin secuencial del precursor proteico amiloide (APP), siendo ste una glicoprotena transmembrana con una funcin indeterminada. El APP puede ser procesado a partir de -, - y -secretasas. En primera instancia A se forma por la accin sucesiva de y secretasas. Ambas secretasas producen el extremo C-terminal del pptido A y a su vez se incorporan a la regin transmembrana del APP con el objetivo de generar isoformas de 36 a 46 aminocidos. Las isoformas ms comunes son A 40 y A 42 en donde la isoforma ms corta se genera debido a la escisin que ocurre en el retculo endoplasmtico mientras que la isoforma larga se escinde en el rea trans-Golgi.13 La forma A40 es la ms comn, sin embargo la forma A42 es ms fibrognico y por lo tanto est asociada con el desarrollo de ciertas enfermedades. Mutaciones en el APP asociados con estadios iniciales de Alzheimer se relacionan con un aumento en la produccin de A42 por lo que la terapia para combatir el Alzheimer se basa en regular la actividad de y secretasa para que la produccin deA40 sea mayor.14

[editar] Placas seniles

Las placas seniles descritas por Alois Alzheimer en su artculo, son resultado de la acumulacin y precipitacin anormal de pptido A fuera de la clula. Debido a su mayor agregacin e insolubilidad el A42 es ms abundante en las placas que el A40. La clasificacin ms utilizada es la morfolgica, que distingue entre dos tipos de placas: las difusas y las densas, segn su capacidad de tincin con Rojo Congo y Tioflavina-S. sta divisin es relevante en la enfermedad de Alzheimer, ya que las placas densas tioflavina-S positivas estn asociadas con: efectos deletreos en el neuropilo, incremento de la curvatura y distrofia de las neuritas (axones y dendritas), prdida de sinapsis y de neuronas, y activacin y reclutamiento de astrocitos y microglia. Las placas difusas estn presentes en el cerebro de personas mayores cuyas capacidades cognitivas estn intactas, por el contrario, las placas densas (particularmente aquellas con distrofia en las neuritas) solo se encuentran en pacientes con enfermedad de Alzheimer. A pesar de esto, los lmites entre el envejecimiento normal y la demencia de Alzheimer no estn claros, pues hay personas con capacidades cognitivas conservadas en las que se pueden encontrar depsitos de amiloide. Estudios en microscopio electrnico revelan que la estructura de las placas densas est compuesta por una masa central de filamentos extracelulares que se extienden radialmente hacia la periferia. Es en la periferia donde se mezclan con neuritas distrficas (procedentes de neuronas, astrocitos y microgla destruidos), que pueden ser tioflavina-S positivas. Las neuritas distrficas asociadas a las placas son la evidencia ms notoria de neurotoxidad inducida por el A. Las neuritas distrficas pueden ser inmunorreactivas para la APP, debido a anormalidades en su citoesqueleto. stas anormalidades pueden llevar a una interrupcin del transporte axonal y por lo tanto a una acumulacin de mitocondrias y vesculas sinpticas (lo que las hace positivas para porina mitocondrial y cromogranina-A). Adems algunos axones distrficos contienen marcadores de neurotransmisores (acetilcolina, glutamato o GABA). Finalmente, las neuritas distrficas se pueden visualizar

con estudios inmunohistoqumicos para ubiquitina y protenas lisosomales, que nos indica que en ella hay un intento de degradar la acumulacin anormal de protenas y organelos. Una expresin menos evidente de los cambios en las neuritas mediados por las placas es el incremento en la curvatura de aquellas neuritas que estn localizadas en la proximidad de las placas densas.15

[editar] Gentica
Mutaciones autosmicas dominantes en el APP causan, mediante un mecanismo hereditario, la enfermedad de Alzheimer (EA). Esta forma de la enfermedad de Alzheimer representa el 10% de los casos y la mayora de los casos de EA no son causadas por este tipo de mutaciones y no siguen un patrn hereditario.16 Un aumento en los niveles totales de A o un aumento en la concentracin tanto de A40 y A4217 se relaciona completamente con la patogenia de ambos tipos de EA espordica. Debido a que A42 tiene una naturaleza mas hidrofbica se le considera la forma ms amiloidognica del pptido. Sin embargo la secuencia central KLVFFAAE es la responsable de formar amiliode por su cuenta y probablemente forma la cubierta de fibrilla. La hiptesis del amiloide propone que las placas son las responsables de causar la EA sin embargo esta teora, a pesar de tener una gran aceptacin en el sector cientfico, no est completamente fundamentada. Los depsitos intracelulares de la protena tau tambin se observan como signo en el desarrollo de la EA. Los oligmeros que forma la va del amiloide podran ser la especies citotxicas.18 Una hiptesis alternativa es que los oligmeros de amiloide son responsables del desarrollo de la enfermedad. Los roedores que han sido modificados genticamente expresan oligmeros, pero no expresan placas (APPE693Q) que desencadenan la enfermedad.19

[editar] Estructura
La protena Beta-amiloide es intrnsecamente no estructurada, lo que significa que en una solucin no adquiere una conformacin terciaria compacta, sino como un conjunto de estructuras. Por lo tanto, no puede ser cristalizada y casi todo el conocimiento sobre la betaamiloide proviene de estudios mediante Resonancia Magntica Nuclear y dinmica molecular. Los modelos derivados de la RMN son de un polipptido de 26 aminocidos, a partir de beta-amiloide (A 10-35 que muestran una estructura en espiral sin una estructura secundaria significativa20 Estudios de rplica, cambio y dinmica molecular demuestran que la beta-amiloide se puede encontrar en diversos estados.21 En simulaciones guiadas por RMN, parece que la beta-amiloide 1-40 y beta-amiloide 1-42 cuentan con estados de conformacin muy diferentes,22 con el fragmento C-terminal de la beta-amiloide 1-42 siendo ms estructurado que el de los fragmentos de la 10-40. La informacin estructural sobre el estado oligomrico de beta-amiloide es an escasa desde el 2010. En condiciones de baja temperatura y baja en sal se lograron aislar los oligmeros en pentamricos en forma de disco de esta protena, y se vio que son carentes de estructura beta.23 Por otro lado, oligmeros solubles preparados en presencia de detergentes parecen tener un contenido importante de lminas beta con caracteres paralelos y antiparalelos, diferentes de fibrillas.)24

Nuevo sistema modelo para el estudio de patologas amiloides

0 0

El investigador del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC) Rafael Giraldo (Madrid, 1963) ha probado, en un modelo bacteriano, que el ADN puede inducir la agregacin de una protena amiloide. La acumulacin de estas protenas, cuando se encuentran parcial o incorrectamente plegadas, es causa de enfermedades como la de Alzheimer, la de Parkinson o las generadas por priones (protenas patgenas que afectan al sistema nervioso y provocan las encefalopatas espongiformes transmisibles). La comunidad cientfica trata de parar la progresin de este tipo de patologas buscando factores que desencadenen la agregacin de amiloides, para encontrar la forma de contrarrestarlos y evitar as su acumulacin. El trabajo, realizado en el Centro de Investigaciones Biolgicas (del CSIC), en Madrid, describe un modelo que puede resultar relevante en esta lnea de investigacin. Las conclusiones de la investigacin aparecen publicadas en el ltimo nmero de la revista Proceedings de la Academia Nacional de Ciencias estadounidense.

Formacin de fibras amiloides en el modelo bacteriano. La interaccin transitoria de cortas secuencias de ADN (en verde) con WH1, un dominio de la protena bacteriana RepA (cintas: a-hlices en celeste, hebras- en violeta), neutraliza un grupo de residuos bsicos. (CSIC)

Grocott

pas

verhoeff

Van giesson

Figura # 6 - Masson-Fontana en el H gado a mayor aumento ( 40x ) donde se aprecian los pigmentos de lipofuscina en color negro al reducir las sales de plata.

METODOS DIRECTOS Histologa Permite la observacin del microorganismo espiralar y el estudio anatomopatolgico de la muestra gstrica y los posibles cambios originados (gastritis crnica con ndulos linfoides). Existen (8,9) diferentes tipos de tinciones que, sin ser especficas para HP, permiten su deteccin : Tincin de hematoxilina-eosina: permite el estudio histolgico y valorar la infeccin por HP. Tincin de plata Warthin-Starry: emplea el nitrato de plata, lo que permite una buena visualizacin del microorganismo. Tincin de Giemsa: es la de eleccin, ya que permite una correcta identificacin del microorganismo y es barata y rpida de ejecutar. No es adecuada para el estudio anatomopatolgico de la muestra gstrica. Tincin de Gram: precisa una muestra de biopsia fresca y no aporta informacin histolgica de la pieza. Otras tcnicas: inmunohistoqumica o inmunofluorescencia con anticuerpos mono/policlonales (8,9) frente a HP.
BIBLIOGRAFIA

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.

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16

El laboratorio Equipo Estudios Calidad Noticias Links Contacto

La tcnicas de inmunocitoqumica son tcnicas de inmunotincin que permiten demostrar una variedad de antgenos presentes en los extendidos estudiados, Se utilizan anticuerpos marcados y con la reaccin antgeno anticuerpo las estructuras que queremos demostrar se colorean con diferentes reactivos.

Estudios / Inmunocitoqumica

Inmunocitoquimica:
Las tcnicas de inmunocitoqumica permiten la identificacin, sobre muestras citolgicas, de antignicos especficos de distintas lneas de diferenciacin y funcionalismo celular. Es una tcnica sencilla que tiene diferentes aplicaciones: se emplea para la diferenciacin de tumores, cuando es necesario localizar un tumor primario desconocido, para determinar la naturaleza de micrometstasis, para tipificar linfomas y leucemias, con el fin de precisar el tratamiento, para la deteccin de factores de valor predictivo como los receptores de estrgenos y de progesterona en casos de cncer de mama, y para contribuir a establecer tratamientos adecuados en cncer de mama (Herb2). En el laboratorio se realizan:

Marcadores epiteliales: Citoqueratinas, Antgeno de membrana epitelial, Antgeno carcinoembrionario (EMA) Ca125, etc. Marcadores Mesenquimticos: Vimentina, Desmina, Actina musculoespecfica, etc.

Marcadores linfoides: Antgeno comn leucocitario (CD45), etc. Otros: S100, Hmb45, Cromogranina, Enolasa neuroespecfica (NSE). etc. Gonadotrofina Corionica, etc. Marcadores especficos de mama: Receptores de estrgeno (RE) y Receptores de Progesterona (RP), calpinina, Her2, etc.

IMPORTANTE:
Comunquese con el laboratorio para informarse de los requisitos y preparacin necesaria para el estudio.

Figura # 3 - Reaccin de PAS en un corte de hgado a mayor aumento ( 40x ) donde el pigmento y el glucgeno se tien de color magenta.

I N M U N O C I T O Q U M I C A
Lectinas
1. Introduccin

La inmunocitoqumica es una tcnica para la localizacin de molculas en los tejidos mediante el em

Proceso histolgico 2. Fijacin Mtodos de fijacin Fijadores 3. Inclusin En parafina En resina 4. Corte Microtomo para parafina Vibratomo Criotomos Ultramicrotomo 5. Tincin Tinciones generales Histoqumica Lectinas Inmunocitoqumica Hibridacin 6. Observacin Microscopio ptico Microscopio electrnico Cuestionarios

anticuerpos (protenas del tipo inmunoglobulina G). Es una tcnica que gracias a la oferta comercial de an la estandarizacin de su protocolo se ha convertido en un mtodo sencillo, rpido y muy potente. Se basa

especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a molculas y unirse a ellas. Adem

conjugacin o combinacin de los anticuerpos con enzimas o con sustancias fluorescentes permite detecta nfimas de molculas presentes en el tejido.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las tcnicas inmunocitoqumicas son del tipo G

por unas clulas del sistema inmunitario denominados linfocitos B. La produccin masiva de anticuerpos

un animal cuando le inyectamos una molcula que reconoce como extraa, es decir, nuestra molcula pro

anticuerpos pasan al suero sanguneo que se extrae del animal inmunizado y a partir del cual se purifican

producidos, los cuales se usarn posteriormente en la tcnica inmunocitoqumica. Las molculas complej

protenas tienen en su estructura varios determinantes antignicos, es decir, lugares que son capaces de de

una respuesta inmune. Ello implica que cada determinante antignico activar un clon, grupo de de linfoc

producir anticuerpos contra l. Los anticuerpos de todos los clones de linfocitos B activados por la mol

irn a parar al suero. Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoqumica se dice qu

empleando anticuerpos policlonales. Existe una tcnica que perimite aislar y cultivar en el laboratorio (in

forma inividualizada a cada uno de los clones activados durante la respuesta inmune. Cada uno de esos cu

producir un tipo de inmunoglobulina G que reconocer slo a uno de los determinantes antignicos de la

Bibliografa Glosario

inyectada. A estos anticuerpos se les denomina monoclonales ya que proceden de linfocitos que producen inmunoglobulinas idnticas.

Esquema resumido de las diferencias en la obtencin de anticuerpos policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y

Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse en dos dominos: la fraccin cristalizable y la variable

variable es el que se encarga de reconocer al determinante antignico de nuestra molcula. Hay dos sitios

que cada inmunoglubulina podra reconocer a dos molculas o determinantes antignicos, que han de se

muy prximos entre s. La fraccin cristalizable tiene una estructura similar para todas las inmunoglubuli producidas por los individuos de una misma especie.

Para que un anticuerpo se una a su determinante antignico localizado en una molcula, sta no deb

otro modo ese determinante antignico no ser reconocido por el anticuerpo. Por ello el proceso de fijaci

debe elegirse para preservar al mximo a la molcula que queremos detectar. Por ello se usan diferentes f

el tipo de molcula en la que estemos interados. Tambin es necesario considerar el mtodo de obtencin

Inclusiones en parafina pueden daar las molculas por lo que en la mayora de los casos se suele trabajar vibratomo o con secciones obtenidas por congelacin. Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la molcula que queramos detectar, no son visibles con el

por lo que la tendremos que conjugar (unirla) a otras molculas que nos den una seal visible. Estas mol

aportan visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos tipos: molculas fluorescentes y enzimas. Las prim

observar con el microscopio de fluorescencia mientras que las segundas pueden convertir determinados su

solubles en productos insolubles y coloreados. La seal aparece all donde est la sustancia fluorescente o es donde se ha unido la inmunoglubulina.

El mtodo del marcado con sustancias fluorescentes tiene una serie de ventajas que veremos ms ad

tiene la desventaje de que no son marcajes permanentes puesto que la luz emitida por la molcula fluoresc

desvanece con el tiempo. Sin embargo, las secciones procesadas con anticuerpos unidos a enzimas puede montarse y mantenerse permanentemente para su obeservacin. Las enzimas habituales que se unen a las inmunoglobulinas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.

Mtodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios unidos especficamente a una molcula del tejido.

La conjugacin directa de un marcador (enzima o fluorescente) con la inmunoglobulina se denomin deteccin directa. Hoy en da se suele emplear el mtodo de deteccin indirecta, que consiste en colocar

intermediarios entre la inmunoglobulina y la molcula marcadora. Inicialmente se us el mtodo indirecto

peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver figura anterior), pero actualmente es ms frecuente usar el mtodo d

avidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figura anterior). El mtodo indirecto permite una mayor versatilidad y mayor intensidad de seal frente a una misma cantidad de antgeno.

La inmunofluorescencia se basa en las propiedades de los fluorocromos. Son molculas que emiten

cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda. Aunque la inmunofluorescencia se puede us detectar a una sola molcula tisular, su verdadero potencial se muestra cuando necesitamos una mltiple

inmunodeteccin, es decir, dos o ms molculas presentes en una misma clula o matriz extracelular de fo

simultnea. Esto es posible porque existe una gran variedad de fluorocromos que son capaces de emitir lu ser excitados con diferentes longitudes de onda, luego seleccionando el intervalo de longitudes onda con

iluminamos un tejido podemos excitar de modo individual, y secuencial, varios fluorocromos que hayamo unidos a inmunoglubulinas diferentes, para detectar molculas diferentes. Tomando fotografas tras cada

superponiendo dichas imgenes podemos averiguar si las molculas se expresan, por ejemplo, en la mism

Deteccin de la molcula tirosina hidroxilasa mediante inmunocitoqumica usando un anticuerpo primario sin marcar, secundario conjugado con biotina y el complejo avidia-biotina-peroxidasa.

Inmunocitoqumica con deteccin indirecta y enzimtica. La seccin se obtiene de tejido previamente fijado. Inmedian se incuban en una solucin de bloqueo que satura los posibles sitios de unin inespecfica, gracias a una alta concentra como la albmina de suero bovino. Tras cada paso de unin de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa los cortes en una solucin tamponada de fosfato (tampn fosfato), en la que tambin van disueltos los anticuerpos. La peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el perxido de hidrgeno, en un producto insoluble y color microscopio tico.

Deteccin con inmunofluorescencia de dos antgenos en una seccin de tejido nervioso: la molcula tirosina hidroxilas el neuropptido Y (a la derecha), usando fluorescena y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante un m indirecto. En esta seccin la tirosina hidroxilasa aparece en cuerpos celulares (flecha) mientras que el neuropptido Y a El asterisco indica donde est la clula con tirosina hidroxilasa, pero no emite luz visible porque la foto se ha tomado il

seccin con una longitud de onda que no excita a la fluorescena.

Deteccin simultnea de dos molculas situadas en el mismo tejido mediante inmunofluorescencia. La razn de que lo primarios procedan de dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro animal, normalm inmunizados con las inmunoglobulinas de ratn y conejo, respectivamente, es lo que permite a cada anticuerpo secun unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.

Complicada de esplicar la pregunta.... Aver, los marcadores son antigenos que aparecen en la membrana de los hematies y leucocitos que al hacer una reaccion antigeno-anticuerpo podemos visualizar si tiene esos marcadores con alguna de las tecnicas que se utilizan para visualizarlos (aglutinacion, etc.). El Cd20 es un marcador que aparece en los linfocitos B. Estos linfocitos B estan en la sangre y en los tejidos linfoides (bazo, ganglios linfaticos...) Espero habertelo esplicado como para poder entenderlo. Sino, vuelve a poner la pregunta y intentare esplicartelo de nuevo de otra forma. Fuente(s): Estudio laboratorio

Inusual presentacin de un Linfoma B cutneo en un paciente joven

Unusual presentation of a cutaneous B Lymphoma in a young male M V Calzinari*, M Tellez**, A Guglielmone***, C M Velzquez*** y V N Dilsizian***
* Mdica Residente de 4 ao de Clnica Mdica. Concurrente del Servicio de Dermatologa 2 ao Curso Superior Especialista en Dermatologa. ** Jefa del Servicio de Dermatologa. *** Mdicos de Planta del Servicio de Dermatologa. Hospital Militar Central "Cirujano Mayor Dr. Cosme Argerich". Av. Luis Mara Campos 726. Ciudad Autnoma de Buenos Aires (C1426BOR). Argentina. e-mail: veronicacalzinari@hotmail.com RESUMEN: Se reporta el caso de un paciente masculino de 23 aos de edad, que se presenta con una lcera de regin latero cervical, nica, sin compromiso del estado general. Se solicita estudio histopatolgico de la lesin e inmunomarcacin, con diagnstico de Linfoma no Hodgkin B de clulas grandes cutneos primarios. Se realiza una revisin sobre los Linfomas no Hodgkin B de clulas grandes cutneos primarios, siendo anecdtica la presentacin en pacientes jvenes. PALABRAS CLAVES: Linfoma B cutneo de clulas grandes; lcera cutnea. SUMMARY: We report a case of a 23 year old male with a lateral cervical ulcer, without general involvement. Histophatological study and immunomarcation were positive to non Hodgkin Difuse Primary Cutaneous Large B-Cell Lymphoma. A revision was made about Primary Cutaneous BCell Lymphomas, being unusual this presentation in young people. KEY WORDS: Cutaneous large B cell; Lymphoma; Cutaneous ulcer.

CASO CLNICO Paciente de sexo masculino de 23 aos de edad (Fig 1), residente de la Ciudad de Buenos Aires, oriundo de Yapey, provincia de Corrientes. De profesin soldado voluntario, que desempea tareas en las caballerizas del regimiento. Sin antecedentes familiares o personales de importancia. Consulta por tumefaccin eritematosa en regin latero cervical derecha, que se produce luego de cargar una bolsa con alimento para caballos. La lesin evoluciona en el transcurso de dos meses a ndulo y ulceracin, sin adenopatas regionales y con conservacin del estado general.

Fig 1: lcera de bordes definidos, indurados y fondo limpio, indolora.

Dicha lesin consista en una lcera indolora de 6 4 cm de dimetro, de bordes sobreelevados, bien delimitados, indurados y eritematosos, de fondo limpio y secrecin serosa. Tanto el examen clnico como el laboratorial no revelaron alteraciones patolgicas. Se solicit PPD y serologa para HIV, HVB, HVC, EBV, CMV, VDRL, toxoplasmosis e histoplasmosis, que fueron negativas. Se realizaron estudios por imgenes: Rx de trax, TAC y RMN de cuello, trax y abdomen. No se evidenciaron adenomegalias ni hepatoesplenomegalia. Pensando en etiologa infecciosa se realizaron cultivos de la lesin para bacterias tpicas, BAAR y micolgico. Se remitieron las muestras al Hospital Muiz, resultando las mismas negativas. Se envi adems biopsia de la lesin informando en un primer momento proceso inflamatorio, granulomatoso compatible con histoplasmosis. Comienza tratamiento con Itraconazol 200 mg/da por seis meses (Fig 2), con escasa respuesta a la medicacin.

Fig 2: respuesta parcial durante el tratamiento con itraconazol.

La lcera comienza a aumentar de tamao complicndose con miasis sobreagregada. Realiza tratamiento especfico para dicha patologa (Fig 3).

Fig 3: aumento del tamao de la lesin luego de cuatro meses de suspender la medicacin (itraconazol).

Se decide realizar una nueva toma de biopsia por losange. Protocolo N: B126689 (Dra. Anah Vijnovich Barn). El examen microscpico revela epidermis sin atipas citolgicas (Figs 4 y 5). A nivel de dermis superficial, profunda e hipodermis se observa marcada infiltracin en grandes reas difusas con focos hemorrgicos. La infiltracin se halla conformada por clulas grandes, de ncleos grandes, vesiculosos, con nuclolo prominente. Se observan numerosos linfocitos pequeos.

Fig 4: imagen histolgica con H y E. Infiltracion drmica por clulas grandes y numerosos linfocitos pequeos.

Fig 5: imagen histolgica H y E a mayor aumento.

Las tcnicas de inmunohistoqumica muestran (Figs 6 y 7): CD20: se observa marcacin de clulas grandes y algunas pequeas; - CD3: se observa marcacin de los linfocitos pequeos; - CD30: negativo; - MIB- 1: marcacin nuclear de aproximadamente 40% de la celularidad.

Fig 6: inmunohistoqumica: expresin de CD 20 +.

Fig 7: inmunohistoqumica: expresin de CD 3+.

Se solicit por estudio de biologa molecular, el reordenamiento de genes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas por PCR

con resultado positivo y negativo para el gen del receptor de clulas T. Se realiza el diagnstico de: Linfoma no Hodgkin B difuso de clulas grandes. COMENTARIOS El Linfoma B de clulas grandes difuso constituye del 30 al 40% de los linfomas no Hodgkin del adulto; en pases en vas de desarrollo la proporcin es ms grande. Constituye del 1-3% de los linfomas en general, no ms del 20-30% de los casos de linfomas de piel de todos los tipos. 2,11 La edad media de presentacin corresponde a la sptima dcada de la vida, con un rango de 8 a 46 aos. Los casos encontrados antes de los 25 aos son anecdotarios. Ms comn en hombres que en mujeres. Aument la incidencia en las ltimas dcadas, independientemente de que el HIV sea un factor de riesgo. Los sitios de ubicacin pueden ser nodal o extranodal. El 40% inicialmente tiene localizacin extranodal, siendo el sitio ms comn el tracto gastrointestinal (estmago, regin ileocecal), pero virtualmente alguna extranodal como la piel, sistema nervioso central, huesos, testculos, tejidos blandos, glndulas salivales, genitales femeninos, pulmn, rin, hgado y bazo pueden ser primarios. Clnicamente se presentan como placas o tumores solitarios o mltiples, localizados, de color eritematoviolceo. Cuando se localiza en piernas se caracteriza por tener peor pronstico; segn la EORTC el pronstico es "intermedio". La etiologa es desconocida, puede surgir de novo o como una trasformacin secundaria de un linfoma menos agresivo, de una leucemia linfoctica crnica, de un linfoma de clulas pequeas, de un linfoma folicular, de un linfoma de la zona marginal o de un linfoma Hodgkin. Estaran implicados virus como el EVB en el comienzo del linfoma. La asociacin propuesta con Borrelia burgdorferi 9 y linfomas B tipo MALT no se ha comprobado; la antibiticoterapia no es tan efectiva aunque s lo es en la erradicacin del H. pylori en linfomas gstricos tipo MALT. Anormalidades cromosmicas esperables y sobreexpresin oncognica han sido encontrados en subtipos de linfomas B cutneos primarios como t (14-18) 8. Adems se vislumbr sobreexpresin de BCL- 2 en linfoma B cutneo primario folicular, pero en frecuencias menores que en aquellos que se encuentran en las formas sistmicas de la misma enfermedad.10 Slo tres tipos de linfoma no Hogdkin de clulas B comnmente se presentan como linfoma B cutneo primario: 1. linfoma folicular, 2. linfoma B difuso de clulas grandes y 3. linfoma MALT. Aunque algunas neoplasias de clulas B incluido el linfoma no Hogdkin o plasmocitoma, pueden presentarse

confinados a la piel, esos casos son anecdticos o muy raros. 3 Histolgicamente est compuesto por grandes clulas linfoides transformadas. Pueden ser divididas en variantes morfolgicas como el centroblstico, inmunoblstico, rico en clulas T e histiocitos y anaplsico. 1 La clula predominante representa tanto una clula grande no hendida, un inmunoblasto o una mezcla de ambos tipos celulares. Otros tipos de clulas que se pueden encontrar en esta clase de linfomas son las multilobuladas grandes hendidas y las anaplsicas grandes. En algunos casos puede haber un predominio de linfocitos T pequeos o histiocitos, recordando a un linfoma T o una enfermedad de Hodgkin de predominio linfoctico. Todos los casos expresan antgenos de lnea B como CD19, CD20 y CD22, con o sin inmunoglobulinas de superficie; normalmente no expresan CD5 ni CD10. BCL-2 y se encuentra reordenado en aproximadamente el 30% de los casos y C-MYC en una minora 4. El diagnstico de linfomas cutneos es, segn los expertos, una de las reas ms difciles de la dermatopatologa. Existen varios sistemas de clasificacin de linfomas y tumores linfoides cutneos como la Clasificacin Europea Americana Revisada de Neoplasias Linfoides (R.E.A.L. classification) que combina hallazgos clnicos, histolgicos, biolgicos, inmunohistoqumicos y citogenticas 5. La clasificacin de la Organizacin Europea para la Investigacin y Tratamiento del Cncer (E.O.R.T.C), incluye slo linfomas primarios cutneos y da nfasis a las caractersticas clnicas 6. Segn la R.E.A.L. el diagnstico de nuestro paciente es el de Linfoma Difuso de clulas B grandes y de acuerdo a la E.O.R.T.C presenta un Linfoma de clulas B grandes que con frecuencia se localiza en las piernas, tronco y en menor medida, en cabeza y cuello. Estos tumores tienen alta tasa de recurrencias pero con buen pronstico a largo plazo. La diseminacin extracutnea es raramente observada, pero si ocurre el pronstico empeora. 7 Para planificar el tratamiento es necesario dividir los casos de linfoma B cutneo primario en dos estadios: I y IV, utilizando el sistema Ann Arbor para linfomas Hogdkin. El estadio I se reserva para lesiones de poca extensin que bien podran abarcarse con radioterapia; el estadio IV correspondera a lesiones extendidas. El linfoma difuso de clulas grandes puede progresar en forma ms agresiva que los otros dos tipos de linfoma B cutneo primario, por lo que es necesario hacer un screening exhaustivo que incluya TAC de abdomen, pelvis y biopsia de mdula sea. El estadio I de linfoma B difuso de clulas grandes, debe ser tratado con pulsos breves de quimioterapia con CHOP o un equivalente por tres ciclos, seguido de irradiacin local. Aunque algunos autores sugieren

que este tratamiento resulta excesivo, en varias ocasiones se han observado recidivas al omitir la quimioterapia o se ha quitado la antraciclina. Otro agente utilizado es el Rituximab (anticuerpo monoclonal anti- CD 20). 12 Es til en forma de monoterapia, as como en combinacin con interfern alfa o poliquimioterapia. 13 La terapia combinada optimiza el control local y sistmico con menor toxicidad. 3 CONCLUSIONES El objetivo del caso es destacar la escasa frecuencia de presentacin, del Linfoma B cutneo y su manifestacin clnica atpica en un paciente inmunocompetente, en la segunda dcada de la vida, destacando la importancia del diagnstico precoz y la dificultad para su clasificacin por los diversos esquemas.
AGRADECIMIENTOS A la Dra. Isabel Santos, Jefa del Servicio de Hematologa del Hospital Militar Central. Al Dr. Daniel Gigena, Mdico de Planta del Servicio de Infectologa del Hospital Militar Central. A la Dra. Mara Cristina Corbella y a la Dra. Anah Vijnovich Barn por sus aportes en el caso.

TEMA 14 HISTOQUMICA 1. HISTOQUIMICA DE LOS HIDRATOS DE CARBONO INTRODUCCIN La histoqumica es la aplicacin de reacciones qumicas y bioqumicas en la tcnica histolgica, con el fin de localizar y determinar de manera cientfica ciertas sustancias o su actividad. En todas estas reacciones o bien se tie la sustancia que buscamos o los colorantes reaccionan qumicamente con ella, como es el caso del PAS. Los hidratos de carbono o glcidos son polialcoholes oxidados (polihidroxicetonas o polialdehidos). Los polisacridos son glcidos formados por la unin de muchas molculas de monosacridos (mas de 10). Entre los polisacridos adems de los polisacridos simples como el glucgeno destacan los polisacridos complejos. Los polisacridos complejos se dividen en 3 grandes grupos: Mucopolisacaridos que pueden dividirse en :

Mucopolisacaridos neutros Mucopolisacaridos cidos Mucoprotenas Mucolpidos.

REACCIONES HISTOQUMICAS BASADAS EN LA DEMOSTRACIN DE GRUPOS CARBONILO FORMADOS SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO POR OXIDACIN PREVIA. TCNICA DEL PAS (cido Peridico Schiff) Consiste en oxidar los tejidos mediante el cido peridico (HIO4) para incrementar el nmero de grupos carbonilo (aldehdo o cetona) presentes en ellos, de forma que puedan ser demostrados posteriormente mediante reactivo de Schiff. Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados, en una proporcin aproximada de uno por molcula de monosacrido. Precisamente por ello es necesario oxidarlos con el fin de incrementar dichos grupos, que solo pueden ser detectados por el reactivo de Schiff si se encuentran situados en carbonos contiguos y delimitados por grupos alcohlicos o amino. Para los grupos aldehidos que aparecen en posicin 1,2 glicol estas condiciones se cumplen exclusivamente tras la oxidacin de los correspondientes radicales hidroxilo.

Procedimiento Tcnico: Fijacin: Formol al 4 % o Lquido de Carnoy o Bouin. cido Peridico0.5 % p/v. Reactivo de Schiff: Fucsina bsica (CI: 42510) 1g. Agua destilada... 200 ml. Disolver la fucsina en 200 ml de agua (d) hirviendo. Dejar enfriar hasta aproximadamente 50 C. y filtrar Posteriormente agregar 20 ml de HCl 1N. Despus enfriar hasta 25 C y aadir 1g de Bisulfito sdico o Metabisulfito potsico (sdico). Mantener en la oscuridad. El liquido tarda unos 2 das o a veces 24h en tornarse de color amarillo que indica que est listo para su uso. Aadir 2g de carbn activado, mezclar y filtrar hasta que desaparezca el color. La solucin debe conservarse en el refrigerado protegido de la luz.

o o o

o o o o o

Bao de cido Sulfuroso o Agua sulfurosa: cido Clorhdrico (HCl) 1N 5 ml. Metabisulfito sdico 10 %... 6 ml. Agua (d)... 100 ml. Colorante de contraste: Hematoxilina, Orange G o Van Gieson. Tcnica de Tincin: Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes) cido peridico 0.5 % 5 min. Lavar en agua (d). Reactivo de Schiff.. 15- 30 min.

Aclarar en 3 baos de agua sulfurosa 2 min. Cada uno. Lavar en agua corriente Colorante de contraste Lavar con agua corriente. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: Material PAS +: rojo oscuro a magenta. B. Compuestos PAS +

polisacridos simples: como el glucgeno y la celulosa. Mucopolisacaridos neutros: se encuentran en el epitelio gstrico, en glndulas del duodeno y en cpsulas bacterianas, tambin en intestino y estmago. mucoprotenas como son algunas mucinas del tubo digestivo y del rbol respiratorio o bronquial, tambin la tiroglobulina que est en el tiroides y la hormona estimulante. Glucoprotenas del suero Glucolpidos: como los ganglisidos y cerebros idos. C. Compuestos PAS Los mucopolisacaridos cidos no pueden ser oxidados por el cido peridico y por eso son PAS - (ya que no aparecen los grupos carbonilos) D. Controles de la tcnica del PAS. Es imprescindible realizar preparaciones testigo o de control que confirmen los resultados obtenidos, para ello suelen ser muy tiles las tcnicas de bloqueo tales como las de bloqueo de grupos aldehdos en general y las de acetilacin de grupos aldehdos situados en posicin 1,2 glicol. Tcnica de bloqueo para aldehdos en general Se realiza tratando los grupos aldehido presentes en el tejido, tras la oxidacin con cido peridico con una solucin de cido actico saturado con Dimedona, entre 1-16 h. a 60 C. Posteriormente se lava con agua destilada y se contina con PAS normal. nicamente se teir el material PAS + formado a expensas de grupos aldehdos situados en posicin 1,2 glicol (los que proceden de glcidos). Tcnica de bloqueo mediante acetilacin para grupos 1,2 glicol. Se basa en la negatividad de la reaccin del PAS despus de la acetilacin de los grupos 1,2 glicol presentes en los hidratos de carbono. Este proceso es total o parcialmente reversible por saponificacin posterior mediante tratamiento con hidrxido potsico. Si no se ha realizado el bloqueo de los aldehdos preexistentes debe realizarse un control sin oxidar el tejido; todo lo coloreado en esta preparacin no sern grupos 1,2 glicol oxidados, sino grupos aldehdos que ya estaban presentes antes de la oxidacin. Despus se realiza el PAS oxidando y se compara los resultados de ambas preparaciones. El 2 problema en la tcnica del PAS se plantea cuando se trata de diferenciar si los grupos aldehdos aparecidos tras la oxidacin lo han hecho sobre grupos alcohlicos situados en posicin 1,2 glicol o si los oxidados han sido grupos hidroxiaminos primarios o hidroxiaminos

secundarios, compuestos no presentes habitualmente en los hidratos de carbono que son PAS +. Esta distincin pude realizarse mediante acetilacin reversible y saponificacin. Acetilar consiste en introducir un grupo acetilo en un compuesto orgnico. El anhdrido actico es un reactivo que tiene gran aplicacin para acetilar, de forma que con este reactivo se bloquean todos los grupos alcohlicos en general existentes en el tejido. CH3 - C - O - C - CH3 + ROH CH3 - C - O - R OOO Este tipo de unin se llama ster. Saponificar es romper un enlace tipo ester de forma que en condiciones idneas reaparece el grupo qumico que exista antes de la acetilacin. La acetilacin es totalmente reversible tras saponificacin para los grupos alcohlicos en posicin 1,2 glicol; totalmente irreversible para los grupos hidroxiaminos secundarios y moderadamente reversible para los hidroxiamino primarios. CH3 - C - O - R + KOH ------------ CH3 - COOK + R - OH O Procedimiento tcnico de acetilacin - saponificacin
o o o o

Soluciones: Mezcla para la acetilacin: Anhdrido actico. 13 ml. Piridina anhidra 20 ml. mezcla para la saponificacin Hidrxido potsico 1N en solucin acuosa o en alcohol 80 C. Modo de operar: Acetilacin: Desparafinar e introducir los cortes en alcohol absoluto. Secarlos y pasarlos a la piridina. Tratar con la mezcla de acetilacin de 37 - 58 C durante un tiempo que depende del material biolgico y suele estar de 30 min. a 24 h. Pasamos los cortes a la piridina. Alcohol absoluto. Hidratar. Acetilacin + saponificacin: Se repite el proceso anterior. Tratar con la disolucin de KOH durante 45 min. Enjuagar con agua. Lotes de preparaciones y resultados en los controles de la tcnica del PAS. Una preparacin a la que se le hace el PAS normal.

Otra preparacin del mismo corte. Se le hace un PAS sin oxidar para detectar grupos aldehdos ya existentes o bien se hace un mtodo de bloqueo especfico para dichos grupos. Un lote de cortes que llevan acetilacin. Un lote de cortes que llevan acetilacin + saponificacin. Resultados: Al acetilar desaparecen todos los grupos PAS+ menos los aldehdos ya existentes. Al acetilar y saponificar los grupos alcohlicos en posicin 1,2 glicol quedan como estaban, recuperan la PAS positividada. Los hidroxiamino primarios reaparecen mucho ms dbilmente y los secundarios permanecen bloqueados al ser la acetilacin irreversible. 1.3 TCNICAS PARA DETERMINAR MUCOPOLISACRIDOS CIDOS. Los mucopolisacaridos cidos son unos polisacridos que no tienen grupos alcohlicos en posicin 1,2 glicol sino grupos cidos carboxilos o sulfatados. Las tcnicas para determinar mucopolisacridos cidos son principalmente: a) Azul Alcin b) Reaccin Metacromtica

Tcnica del Azul Alcin: se ha comprobado que usando el azul alcin en condiciones de pH en torno a 2,4 -2,6 se colorean los mucopolisacridos cidos sulfatados y los carboxlicos. Si por el contrario se emplea a un pH muy bajo, en torno a 1, slo se colorea los mucopolisacridos sulfatados, los carboxlicos no se tien. Si se sigue disminuyendo el pH hasta 0,5 se incrementa la selectividad de la tincin y en este caso slo se tien los mucopolisacridos fuertemente sulfatados. Procedimiento Tcnico:

Fijacin: formol al 4%. Soluciones: Azul alcin a pH 2,5: Azul alcin (C.I. 74240) 1 g. cido Actico 3%.. 100 ml. Azul alcin a pH 1: Azul alcin. 1 g. HCl 0,1 N 100 ml. Azul alcin a pH 0,5 : Azul alcin . 1 g. HCl 0,5 N .. 100 ml. Filtrar todas las soluciones antes de usar. Las soluciones son estables durante 2 semanas aproximadamente, como colorante de contraste se puede usar una solucin de Rojo nuclear al 1 %. Modo de operar:

Desparafinar e hidratar. Tratar con la solucin deseada de azul alcin durante 30 min. Si se us la solucin a pH 2,5, lavar con agua (d) ; si se us cualquiera de los otros dos, secar slo con papel de filtro. Contrastar si se desea con rojo nuclear. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: Azul alcin a pH 2,5 los mucopolisacaridos cidos (carboxilos y sulfatos) se tien de azul. Azul alcin a pH 1 slo se tien de azul los mucopolisacaridos cidos sulfatados. Azul alcin a pH 0,5 slo se tien de azul los mucopolisacaridos cidos fuertemente sulfatados. b) Reaccin Metacromtica: La metacromasia indica un cambio de color cuando un colorante qumicamente puro tie selectivamente una estructura tisular de color diferenteal de la solucin diluida de colorante; se dice que ha ocurrido una reaccin metacromtica. La estructura responsable de este cambio se llama cromotropa. Para distinguirla de las restantes que se tien normalmente (ortocromticas) Sustancias cromotropas son los mucopolisacaridos cidos, cidos nucleicos, lpidos de carcter cido y partculas de slice. La reaccin metacromtica presenta grandes variaciones ante las ms pequeas modificaciones del medio donde reproduce, por lo tanto la reaccin metacromtica es de difcil interpretacin e incluso puede proporcionar resultados contradictorios. AZUL DE TOLUIDINA (tcnica de metacromasia que mas se hace)

Fijacin: En el caso de los mucopolisacaridos cidos pueden emplearse tejidos fijados con alcohol, Bouin alcohlico e incluso formol pero deben evitarse los fijados con agentes oxidantes.

Soluciones: Solucin Tampn de cido actico - acetato a pH 4,2: Acetato sdico. 2,7 g. H2O (d). 100 ml. cido actico 0,5 M.. 1,1 ml H2O (d). 100 ml. Solucin A. 30 ml. Solucin B. 90 ml.

Solucin a 0,2 % de azul de toluidina en la solucin tamponada anterior. Solucin acuosa al 4 % de molibdato amnico. Procedimiento Tcnico: Desparafinar e hidratar.

Teir con azul de Toluidina. 2 - 5 min. Lavar en la solucin tamponada. Tratar los cortes en la solucin de molibdato.. 10 min. Lavar con agua (d). Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: Elementos de carcter metacromtico se van a ver de rojo a prpura y el resto se va a ver azul. Los baos en alcohol etlico inhiben la metacromasia por lo que deben realizarse preparaciones testigo. Una 1 preparacin se observa tras su paso por el agua ctica antes de fijar con molibdato. Esto tiene por objeto evaluar el efecto metacromtico inmediato en fase inestable. A continuacin se sigue el procesamiento normal. Otra preparacin no se deshidrata y se monta en un medio acuoso para evitar el paso por alcohol etlico. La ltima preparacin se confecciona normalmente, es decir, deshidratando y montando por el mtodo habitual. Comparando las 3 preparaciones se puede seguir la evolucin del efecto metacromtico y la influencia del procesamiento histolgico realizado sobre ellas. Tambin se deben realizar controles de especificidad en la reaccin metacromtica. Se usan para distinguir entre mucopolisacaridos cidos carboxlicos y sulfatados. Son principalmente de 2 tipos:

Variacin de pH: consiste en realizar la tincin entorno a un pH de3, 5. en este caso la mayora de los mucopolisacaridos cidos carboxlicos pierden su metacromasia mientras que los sulfatados la conservan. Haremos 2 lotes: el 1 se tien a pH 4,5 y el 2 a 3,5. Los mucopolisacaridos cidos que siguen siendo metacromticos en el 2 lote corresponden a mucopolisacaridos cidos sulfatados ya que los carboxlicos pierden su metacromasia.

Metilacin reversible: consiste en tratar un grupo de cortes con una mezcla de alcohol metlico y cido clorhdrico, con lo que se bloquean por metilacin los grupos cidos de los mucopolisacaridos cidos. Despus se realiza mutilacin seguida de saponificacin, reapareciendo la metacromasia solamente en los mucopolisacaridos cidos carboxlicos. 1.4 TCNICA PARA DIFERENCIAR MUCOPOLISACRIDOS CIDOS, NEUTROS Y GLICOPROTENAS. TCNICA DEL AZUL ALCIAN - PAS. Procedimiento Tcnico:

Fijacin: formol al 4 %. Soluciones: Solucin azul alcin a pH 2,5. Solucin cido peridico el 0,5 %. Reactivo de Schiff.

Solucin de cido sulfuroso. Colorante de contraste. Tcnica: Desparafinar e hidratar. Solucin azul alcin a pH 2,5 30 min. Lavar con agua (d) cido peridico. 10 min. Lavar con agua (d). Reactivo de Schiff 15 - 30 min. Aclarar con 3 baos de agua sulfurosa.. 2 min. Cada uno. Lavar con agua corriente ... 5 min. Colorante de contraste (Hematoxilina Harris normalmente). Lavar, clorar y montar. Resultados: Mucopolisacaridos cidos: azul Mucopolisacaridos neutros y glicoprotenas: rojo o rosa. Resto: violeta (si se usa hematoxilina). 2. HISTOQUMICA DE PROTENAS Y ACIDOS NUCLEICOS.

METODOS HISTOQUMICOS PARA LA COLORACION DE PROTENAS. Desde la introduccin de los mtodos inmunohistoqumicos que permiten caracterizar antignicamente a la mayor parte de las protenas, todos los mtodos de coloracin puramente histoqumicas para protenas han perdido vigencia. De forma genrica las tcnicas histoqumicas para colorear protenas pueden clasificarse en 3 grupos:

Reacciones generales: pretenden colorear globalmente a las protenas presentes en un tejido. Reacciones de grupo: pretenden caracterizar, no la molcula proteica globalmente sino un corto numero de grupos reactivos especficos de dichas sustancias. Reacciones especficas: para grupos qumicos particulares propios de de determinados aminocidos, como por ejemplo el grupo fenol. Reacciones de grupo. Reaccin de Ninhidrina - Schiff. Se trata de establecer la naturaleza proteica de una determinada sustancia a partir de la demostracin en ellas de ciertos grupos qumicos que se encuentran de forma exclusiva en los polipptidos. La reaccin de la Ninhidrina - Schiff se basa en un proceso de desaminacin oxidativa de las cadenas polipeptdicas, provocado por la ninhidrina por el cual los grupos amino son sustituidos por grupos carbonilo. Tras el proceso se realiza la determinacin de los carbonilos neoformados mediante reactivo de Schiff (igual que la tcnica del PAS).

TCNICA DE LA NINHIDRINA - SCHIFF

Fijacin: alcohol o acetona. Formol tamponado y lquido de Zenker, tambin se puede utilizar pero en estos casos el tiempo de incubacin con la ninhidrina debe ser superior a 20 horas. Se pueden utilizar secciones en congelacin o en parafina. Soluciones: Solucin de ninhidrina: Ninhidrina.. 0.5 g. Etanol absoluto............... 100 ml.

Solucin de reactivo de Schiff. Procedimiento: Desparafinar e hidratar. Tratar los cortes con alcohol etlico al 70 %. Incubar a 37 C con la solucin de ninhidrina entre 6 - 24 horas, (habitualmente toda la noche). Lavar bien las secciones en agua corriente. Teir con reactivo de Schiff.. 30 - 45 min. Contrastar con hematoxilina de Harris. Posteriormente lavar con agua corriente 10 min. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados:

Grupos amino (NH2): rojo - rosa prpura. Controles: La ninhidrina solo oxida los grupos amino cuando estn prximos a un radical metilo o a un radical cido. Adems es posible la aparicin de falsos positivos en casos de preexistencia de grupos aldehdos en el tejido (R - C = O), por ello debe incluirse siempre un lote de preparaciones sin tratamiento con la ninhidrina, es decir, que se traten slo con el reactivo de Schiff. METODOS HISTOQUMICOS PARA LA DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS. Los cidos nucleicos estn compuestos por largas cadenas de unidades llamadas nucletidos, enlazadas por uniones covalentes. En general los nucletidos estn formadas por:

cido fosfrico, implicado en el mecanismo fisico-quimico de coloracin por el cual se tien intensamente con colorante bsicos como le hematoxilina. Una pentosa (5 carbonos), que puede ser ribosa (ARN) o desoxiribosa (ADN). Bases nitrogenadas ( ADN : A,C,T,G), ( ARN: A,C,G,U) En condiciones normales los cidos nucleicos se conjugan con protenas bsicas para formar nucleoprotenas, por ello la realizacin de una hidrlisis cida permite separar el componente proteico y as poder demostrar la presencia de cidos nucleicos (los cidos nucleicos se enrollan sobre las protenas y la hidrlisis es para eliminar las protenas).

Tcnicas que permiten separar el ADN de otras estructuras. Reaccin de Feulgen. Estas tcnicas se utilizan para visualizar el ncleo, el proceso de tincin se realiza en 2 fases: 1 Fase. Una hidrlisis cida del ADN: con esto se pretende mediante la actuacin del cido clorhdrico romper la estructura del ADN por el lugar en que la pentosa se une a la base nitrogenada, de forma que sobre cada molcula de azcar (pentosa) reaparece un grupo carbonilo. Estos grupos se encuentran situados a una distancia entre 1 - 1.1 nm. 2 Fase. Demostracin de los grupos carbonilos: mediante reactivo de Schiff (color rosa ADN slo). El ARN no puede ser detectado por el reactivo de Schiff tras la realizacin de la hidrlisis cida, puesto que la distancia entre grupos carbonilo es menor de 1 nm, y por tanto no se produce la reaccin con el reactivo de Schiff.

Problemas generales de esta tcnica: Hidrlisis excesiva: el cido clorhdrico es un cido fuerte, si se prolonga excesivamente el tiempo de hidrlisis se puede disgregar la molcula de ADN en su totalidad, impidiendo as su posterior deteccin. Por ello el aspecto ms importante de la tcnica es el tiempo de hidrlisis, que varia mucho segn el fijador utilizado. Envejecimiento del reactivo de Schiff: en condiciones normales es incoloro, la aparicin de una tonalidad rosada indica envejecimiento y por tanto debe desecharse, puesto que el envejecimiento lo hace inservible para detectar los grupos carbonilos. METODOS PARA LA IDENTIFICACION Y TINCION DE PIGMENTOS E IONES METLICOS. MTODOS PARA DETECTAR IONES TCNICOS. TCNICAS DEL AZUL DE PERLS. En el interior de los tejidos el hierro se puede depositar de 2 formas: En forma inica, o formando sales ferrosas y ferricas, por lo general en forma de cloruros o hidrxidos. Como hierro ligado a protenas. La tcnica del azul de Perls es la de mayor importancia para detectar hierro, ya que el hierro ferrico es el ms frecuente en los tejidos. El fundamento de esta tcnica se basa en la propiedad que tiene el ferrocianuro potasico, para transformarse en presencia de hierro frrico en ferrocianuro ferrico, o azul de Prusia por accin del cido clorhdrico que acta como desencadenante de la reaccin. CL3Fe Ferrocianuro potsico + HCL Ferrocianuro frrico. TCNICA.

Fijacin: cualquier fijador es vlido. Se pueden utilizar secciones en parafina o improntas. Soluciones: Ferrocianuro K al 10 % (conservar en nevera). cido clorhdrico : - cido clorhdrico concentrado. 2 ml. - Agua destilada...... 98 ml.

Solucin de ferrocianuro K, cido clorhdrico: mezclando a partes iguales la solucin 1 y 2. esto se debe preparar inmediatamente antes de su uso. Procedimiento Tcnico:

Desparafinar e hidratar. Tratar con la mezcla de ferrocianuro K, cido clorhdrico 10 min. Lavar con agua destilada (el Fe se ve azul). Se puede contrastar con una solucin rojo nuclear al 1 %.. 2 - 3 min. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: - Hierro frrico: azul. - Ncleos: rojo.

Observaciones: El tiempo de tincin depende de la cantidad de hierro existente en los tejidos. Siempre deben utilizarse preparaciones positivas de control. Si al echar la disolucin 3 en la porta toma color verde debemos desecharla, enjuagar y poner reactivo nuevo.

METODOS PARA LA DETERMINACIN DE CALCIO. TECNICA DE VON KOSSA. Las sales de calcio estn presentes normalmente en los huesos, dientes y sangre aunque en ocasiones tambin aparecen reas de calcificacin en tejidos desprovistos de ellas. En general las sales que con mayor frecuencia se depositan son carbonatos, oxalatos y fosfatos. TCNICA

Fijacin: formol al 4 % preferiblemente y utilizar secciones en parafina. Soluciones: Solucin acuosa de nitrato de plata al 1 %. Solucin de tiosulfato sdico al 2,5 %. Rojo neutro al 1 %. Procedimiento tcnico: Desparafinar e hidratar. Tratar con la solucin de nitrato de plata a plena luz.. 30 - 60 min. Lavar con agua destilada. Lavar en la solucin de tiosulfato.. 5 min. Volvemos a lavar con agua destilada. Contrastar con el rojo neutro. 2 - 3 min. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: - Iones calcio o calcificacin: negro. - Ncleos: rojo.

Ttulo: Tcnicas utilizadas para detectar glicoconjugados y glicanos en secciones de parafina. Autor: H.J. Aldana Marcos. Histoinforme. SAH. 12(2): 5-11. 2001. El siguiente resumen informa sobre las distintas tcnicas que puede utilizar el HT para la deteccin de hidratos de carbono en secciones de parafina. Adems nos ensea que la tcnica de PAS no slo demuestra la presencia de hidratos de carbono y que en un trabajo correcto debera comprobarse la especificidad del PAS.

TECNICAS UTILIZADAS PARA DETECTAR GLICOCONJUGADOS Y GLICANOS EN SECCIONES DE PARAFINA:

1-TECNICA DE PAS.

El PAS tie nicamente hidratos de carbono?

La tcnica de PAS (cido peridico-Schiff) es y ha sido utilizada durante mucho tiempo por numerosos investigadores como mtodo de identificacin de macromolculas con hidratos de carbono, pero como veremos la reaccin PAS positiva puede deberse a la presencia de otras molculas muy diferentes a los hidratos de carbono. Por lo tanto, segn Pearse (1985) la especificidad del PAS para la deteccin de hidratos de carbono no puede ser aceptada sin una cualificacin. Los hidroxilos libres de dos tomos de carbono adyacentes (como los grupos 1,2-glicol de las hexosas) (Fig. 1) de macromolculas tisulares pueden ser visualizadas histoqumicamente mediante la oxidacin a dialdehdos (con el cido peridico) y posterior condensacin de los grupos aldehdos con agentes cromognicos como el reactivo de Schiff (Spicer et al., 1961, Spicer, 1992). Los grupos hidroxilos adyacentes visualizados por el PAS estn presentes principalmente pero no exclusivamente- en residuos de carbohidratos (Spicer, 1961). Los azcares pequeos son solubles y, por lo tanto, no resisten los diferentes lavados durante el procedimiento.

Figura 1 El resultado positivo puede indicar la presencia de algunos glicanos (polisacridos) como el glucgeno o de glicoconjugados. Los glicoconjugados (hidratos de carbono unidos a otras molculas que no son carbohidratos) incluyen a las glicoprotenas, proteoglicanos y a los glicolpidos (Spicer, 1992). Se ha demostrado que con tiempos de oxidacin normales el PAS no reacciona con los glicosaminoglicanos (polisacridos) ni con proteoglicanos (Pearse, 1985; Spicer, 1992). Por lo tanto, la positividad del PAS se debe, en parte, a la presencia de glicoprotenas (neutras o levemente cidas ) y de glucgeno. A su vez, slo algunas glicoprotenas neutras son PAS positivas (Pearse, 1985). La reaccin se debe a las hexosas presentes en las glicoprotenas ya que las hexosaminas y cidos hexurnicos parecen no contribuir en la reaccin (Pearse, 1985). Los aminoglicoles presentes en los residuos amino terminales de la serina y treonina de protenas son susceptibles a reaccionar con el PAS pero generalmente no estn presentes en gran cantidad para contribuir significativamente a la tincin (Spicer et al, 1961). Entre otras sustancias PAS positivas pueden detectarse protenas ricas en residuos de cistena (Pearse, 1985). A nivel extracelular las glicoprotenas de la membrana basal, las fibras reticulares, las fibras colgenas y ciertas sustancias hialinas son tambin PAS positivas (Sheehan y Hrapchak, 1980). Los glicolpidos, fosfolpidos y algunos pigmentos de naturaleza lipdica como el ceroide son PAS positivos. Tambin lo son los lpidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980).

Es importante destacar que las diferencias de intensidad de la reaccin del PAS de diferentes estructuras en distintos trabajos pueden deberse a varias causas: a- El fijador utilizado (Sheenan y Hrapchak, 1980). b- La tcnica de PAS utilizada (Pearse, 1985). Por lo tanto, no creemos que cuantificar la tcnica de PAS sea de importancia, pero s lo es el hecho de que una estructura dada sea o no PAS positiva. Es til analizar las diferencias en intensidades de la reaccin, slo si la misma ha sido sometida a diferentes controles o si los tejidos han sido tratados de igual forma.

Sin lugar a dudas es clara la necesidad de realizar otras tcnicas con el fin de cualificar los resultados PAS positivos. Por ejemplo:

a) Tcnica de PAS sin oxidacin previa: permite asegurar que todos los productos PAS positivos son el resultado de una oxidacin previa. Por lo tanto se debe realizar un control sin la oxidacin previa con el cido peridico (Martoja y Martoja-Pierson, 1970).

b) Deteccin de lpidos en cortes de parafina: en general los lpidos son arrastrados por los solventes durante la inclusin en parafina. Sin embargo, no debe descartarse el hecho de que se puedan teir lpidos insolubles como algunos glicolpidos, fosfolpidos y lpidos insaturados (Spicer, 1992). Los lpidos son extrados -segn Bancroft y Stevens 1990- si se tratan las secciones con una mezcla de cloroformo y metanol o con acetona caliente. La bromacin previa a la tcnica de PAS puede utilizarse para bloquear los grupos etilnicos PAS reactivos de los lpidos insaturados (Cohn, 1955). La reaccin de Schiff con cido perfrmico para la deteccin de lpidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980) es muy til si a la vez se realiza un control negativo con bromacin. Para detectar la presencia de lpidos insolubles en cortes de parafina son tiles las tcnicas de Negro-Sudan B para cortes de parafina (Pearse, 1985), Klver-Barrera (1953) para detectar fosfolpidos y glicolpidos -como ganglisidos y cerebrsidos- (Pearse, 1985) y la reaccin modificada de Bruckner (Pearse, 1985) para detectar glicolpidos.

c) Comprobacin de grupos 1-2 glicol: segn Martoja y Martoja-Pierson (1970) es indispensable la comprobacin, mediante la reaccin de la acetilacin reversible, de que el carcter PAS positivo de una estructura se debe nicamente a las funciones 1-2 glicol. Segn este autor este punto es verificado mediante el bloqueo reversible de las funciones 1-2 glicol por acetilacin con actico anhidro y piridina anhidra. Al acetilarse los hidroxilos vecinos, el cido peridico no puede actuar y los hidratos de carbono oxidables dan PAS negativos. Mediante la saponificacin (desacetilacin) con hidrxido de potasio se restaura la PAS positividad de dichas estructuras. Segn Hale (citado por Pearse, 1985) la acetilacin bloquea todas las sustancias posiblemente PAS positivas y la desacetilacin restaura su actividad. Para Pearse (1985) esta reaccin carece de fines prcticos, aunque en su libro de histoqumica (apndice 15, de la parte primera) menciona la tcnica sealando que la reaccin negativa luego de la acetilacin indica la presencia de grupos 1-2 glicol.

d) Presencia de glucgeno: El mtodo ms til para identificar la presencia de glucgeno mediante la tcnica de PAS, es tratar los cortes con la enzima diastasa o alfa-amilasa. Estas enzimas despolimerizan el glucgeno formando azcares pequeos que son extrados con el agua de lavado luego de aplicar las enzimas. Una disminucin o negatividad de la reaccin de PAS luego de

este tratamiento indica claramente la presencia de glucgeno (Sheenan y Hrapchak, 1980, Spicer, 1992). Tambin existen otras tcnicas que permiten detectar la presencia de glucgeno en cortes de parafina. La ms utilizada es el carmn de Best (mecanismo emprico). Es selectiva para el glucgeno, aunque tambin puede teir suavemente glicoconjugados neutros y fibrina (Bancroft y Stevens, 1990). Es til aclarar que los depsitos de glucgeno intracelulares son fcilmente reconocibles en cortes ultrafinos a nivel de microscopa electrnica.

e) Azcares neutros versus azcares cidos: desde el ao 1973 Liao y col. (citados por Pearse, 1985) han demostrado que disminuyendo la concentracin del cido peridico puede oxidarse en forma especfica los residuos de cido silico de los glicoconjugados. Estos residuos son muy comunes en las glicoprotenas (Pearse, 1985) y se ha demostrado que reaccionan ms rpido a la oxidacin con el peridico que los glicoles de las hexosas, 6-deoxyhexosas o n-acetylhexosaminas de los azcares neutros (Volz et al., 1987a). La tcnica de Volz y col. (1987a) es un excelente mtodo para la oxidacin selectiva de cidos silicos tisulares con el periodato. Presumiblemente la selectividad a los residuos de cido silico de la modificacin del PAS realizada por Volz y col., se deba a un incremento en el grado de oxidacin de los residuos de silico producido por una disminucin del pH y la baja concentracin de peridico del agente utilizado. A su vez, ocurrira una disminucin en la tasa de oxidacin de los azcares neutros lo cual produce una concentracin insuficiente de grupos aldehdos capaces de ofrecer reaccin visible del reactivo de Schiff (Volz, et al., 1987a).

En algunas glicoprotenas cidas, los carbonos 7, 8 9 de los residuos de cido silico pueden hallarse acetilados (Pearse, 1985) y por lo tanto no ser reactivos a la tcnica de PAS ni a la modificacin de la misma realizada por Vols y col.. Mediante la saponificacin con hidrxido de potasio pueden desacetilarse y hacerse PAS reactivos (Culling et al., 1974). Por lo tanto un aumento de la reaccin de PAS luego de la saponificacin puede indicar la presencia de cido silico acetilado (con O-acyl steres). No debe descartarse la posibilidad que dicho aumento se deba tambin a la desacetilacin de grupos 1-2 glicol de los azucares neutros (Pearse, 1985). Una forma de reconocer la presencia de cidos silicos totales incluyendo los grupos que pueden estar acetilados es sometiendo los cortes a saponificacin (remocin de los acetilos) y luego realizar la tcnica de Volz y col. (1987a). De forma similar puede reconocerse la presencia de azcares neutros, bloqueando la reaccin del cido silico. Las etapas fundamentales son las siguientes (Volz et al., 1987b): I-saponificacin con hidrxido de potasio (eliminamos los acetilos presentes en los residuos 1-2 glicol y en el cido silico), II-oxidacin peridica selectiva segn Volz y col. (1987a) (oxidamos a aldehdos, slo los oxhidrilos de los residuos de cido silico), III-reducir mediante la utilizacin del borohidruro de sodio los aldehdos producidos en la oxidacin anterior

a alcoholes, IV-realizamos la tcnica de PAS (de esta forma slo reaccionarn los oxhidrilos vecinos de los residuos 1-2 glicol de los azcares neutros, ya que los oxhidrilos del cido silico fueron transformados a alcoholes por el borohidruro de sodio y por lo tanto no son PAS reactivos).

2) TECNICAS QUE UTILIZAN COLORANTES CATIONICOS:

Los glicoconjugados cidos y algunos glicanos (como los glicosaminoglicanos) pueden presentar en sus macromolculas (Bancroft y Stevens, 1990; Spicer, 1992):

steres cidos de sulfatos, los que son sumamente cidos steres cidos de sulfatos y carboxilos slo steres carboxilos cidos, menos cidos que los sulfatos Un grupo importante de mtodos histoqumicos visualiza los residuos cidos aninicos de estas macromolculas mediante el uso de sustancias coloreadas catinicas. La ms utilizada es el azul alcin. El azul alcin presenta la particularidad de colorear ms intensamente si el colorante es utilizado a un pH en el cual los grupos reactivos se hallan totalmente ionizados (Bancroft y Stevens, 1990). La tincin con el azul alcin a un pH de 0,5 es selectiva para las macromolculas con steres de sulfatos (Lev y Spicer, 1964). A este pH slo los steres de sulfato (muy cidos) disocian su protn, quedando ionizados. De esta forma al disminuir el pH le quita afinidad al colorante por los grupos carboxilos cuya acidez es menor y por lo tanto no pierden su protn. A pH 2,5 tanto los steres de sulfatos como los carboxilos disocian su protn y dan positivos al azul alcin (Lev y Spicer, 1964; Spicer, 1992). Los grupos carboxilos pueden ser bloqueados mediante una metilacin suave con cido clorhdrico y metanol. Si previamente a la reaccin del azul alcin pH 2,5 se someten los cortes a una metilacin suave, slo darn alcin positivos los steres de sulfato ya que los carboxilos se hallan bloqueados por metil steres (Bancroft y Stevens, 1990). Los glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados del tejido conectivo tambin sern metilados, por lo tanto, esta tcnica es til si se desea comparar los glicoconjugados de origen epitelial (Pearse, 1985; Bancroft y Stevens, 1990).

La orcena natural y el azul alcin a pH 2,5 presentan el mismo tipo de reaccin tiendo los grupos sulfatos en los glicoconjugados y glicosaminoglicanos epiteliales y los residuos de cido sulfnico

resultantes de una oxidacin de los grupos sulfuros (S-S o S-H) en el ncleo proteico de las glicoprotenas (Singh y Gorton, 1989). Si se combina el azul alcin a pH 2,5 y la orcena es posible diferenciar consistentemente las cantidades relativas de glicoconjugados y glicosaminoglicanos, sulfatados y carboxilados en un mismo preparado (Tcnica de Singh y Gorton, 1989). La orcena teir de marrn los glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados, mientras que en azul se vern teidos las glicoconjugados y glicosaminoglicanos carboxilados ya que los sulfatados -que tambin se tien con el azul alcian al pH utilizado por la tcnica- se ven enmascarados por la orcena natural. Otra tcnica muy utilizada para diferenciar sulfatados de carboxilados es la tcnica azul alcin y amarillo alcin (Bancroft y Stevens, 1990). El azul alcin se utiliza a pH 0,5 por lo tanto detectar sulfatados, el amarillo alcin se prepara a pH 2,5 de la misma forma que el azul alcin al mismo pH. El amarillo alcin detectar ambos tipos de steres. Resultados: sulfatados en azul, carboxilados en amarillo, clulas con mezcla de ambos en verde.

3) UTILIZACION DE LA TECNICA DE PAS JUNTO CON EL AZUL ALCIAN.

Esta tcnica puede diferenciar fcilmente la presencia de glicoconjugados y cidos y neutros en un mismo preparado (Bancroft y Stevens, 1990). Consiste en una primera tincin con el azul alcin a pH 2,5, seguida de la tcnica de PAS. El uso en primer lugar del azul alcin permite colorear los glicoconjugados y glicosaminoglicanos cidos. Los glicoconjugados cidos que puedan reaccionar con el PAS aparentemente son bloqueados por el azul alcin. Por lo tanto, la posterior utilizacin del PAS slo reaccionar con los glicoconjugados neutros (Bancroft y Stevens, 1990). Segn Spicer (1992) pueden reaccionar tambin glicoprotenas con hexosas PAS reactivas y grupos aninicos alcin reactivos. La interpretacin de los resultados es la siguiente (Spicer, 1992):

PAS+, azul alcin- (color rojo o rosado): ha sido interpretado como indicador de glicoprotenas neutras (raramente glicolpidos insolubles). PAS+, azul alcin+ (el color depender de la entidad dominante y puede variar del azul prpura, hacia el prpura o al violeta): glicoprotenas cidas o una mezcla de glicoprotenas cidas y neutras o una mezcla de glicoprotenas cidas y neutras ms glicosaminoglicanos. PAS-, Azul alcin+ (color azul): se juzgan como glicosaminoglicanos y glicoprotenas cidas libres de hexosas PAS reactivas. Tambin debe considerarse aqu la presencia de glicoprotenas cidas con hexosas bloqueadas por la unin del alcin a la macromolcula (Bancroft y Stevens, 1990).

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TECNICAS:

PAS segn McManus (Pearse, 1985).

1-Hidratar los portas. 2-Acido peridico al 1%- 10 3-Varios cambios de agua destilada (o agua corriente 5). Si se usa el agua corriente lavar en agua destilada antes de colocar los portas en el reactivo de Schiff. 4-Reactivo de Schiff 15. 5- Agua corriente 10. 6-Deshidratar y montar. Si quieren colorear los ncleos, luego del paso 5, colocar en agua destilada y teir en forma rutinaria con alguna hematoxilina, luego deshidratar y montar.

El mejor y ms intenso reactivo de Schiff es el de Tomasi (Pearse, 1985) Colocar 1 g de fucsina bsica en 200 ml de agua destilada hirviendo (ojo sacar un segundo del fuego cuando colocan la fucsina). Mezclar 5 y enfriar rpidamente (yo lo coloc sobre hielo) hasta exactamente 50. Filtrar y agregar 20 ml de cido clorhdrico 1M. Enfriar a 25 y agregar 1 g de metabisulfito de sodio o potasio. Colocar en frasco color caramelo y mantener en la heladera) Se puede usar as o luego de 14 a 24hs de preparado agregar 2 g de carbn activado y sacudir 1. Filtrar. Guardar en heladera.

Como comprobar si el Schiff sigue funcionando. Colocar formol puro en un vaso de precipitado y agregar unas gotas de reactivo de Schiff, debe ponerse rojo en 30 seg. Si no lo hace, descartar.

Drogas alternativas para la tcnica de PAS

Debido a que la fucsina bsica es carcinognica, se pueden utilizar otros colorantes para la preparacin del reactivo de Schiff, estos colorantes seran menos txicos. Segn la HT Rosa Villegas de Guidi y el Qco. HT Alberto A. Guidi se logra resultados muy satisfactorios, positivos y reproducibles utilizando la Tionina (Fluka) o pararosanilina (Sigma) para la preparacin del reactivo de Schiff. Tambin fue utilizado el Azur II (Fluka) y el violeta de cresilo (Chroma) aunque la reaccin fue menos intensa. Salvo la pararosanilina, que determina una coloracin PAS+ (rojo-violeta) similar a la fucsina bsica. Los otros colorantes tien las regiones PAS+ de azul.

Reactivo de Schiff con tionina (Bancroft y Stevens ,1990) Tionina 2g Metabisulfito de sodio 3,8 g Acido clorhdrico 0,15 M 200ml Dejar en agitador durante 6hs. Agregar 4 g de carbn activado mezclar y filtrar inmediatamente. Guardar en oscuridad y en heladera.

Deteccin de lpidos PAS positivos en cortes de parafina:

a) Extraccin de lpidos insaturados.

Tratar las secciones 1 hora en la siguiente mezcla (Bancroft y Stevens, 1990): Cloroformo 66 ml. Metanol 33 ml. Agua destilada 4 ml HCl concentrado 1 ml.

Tambin puede utilizarse acetona caliente durante 30.

b) Deteccin de lpidos insaturados:

Reaccin de Schiff con cido perfrmico (Sheenan y Hrapchak, 1990) 1-hidratar. 2-Oxidacin con una solucin reciente de cido perfrmico 2 a 5. (Lillie los deja durante 90) 3-Reactivo de Schiff 30. 4-Lavar en agua corriente caliente -30. 5-Colocar un cubreobjetos con un medio acuoso (glicerol gelatina)

Acido perfrmico (este cido es inestable y se descompone rpidamente): Acido frmico 90% 8 ml. H2O2 30% 31ml Acido sulfrico concentrado 0,22 ml

Resultados: lpidos insaturados- magenta.

Bromacin previa al PAS (bloqueo de lpidos insaturados):

1-llevar los cortes a xilol. 2-varios cambios en tetracloruro de carbono. 3-1 hora en una mezcla: 39 ml de tetracloruro de carbono y 1 ml de bromo. 4- 2 cambios de tetracloruro de carbono. 5-alcohol 85%- alcohol 70% 6-agua destilada.

7-Reaccin de Schiff para lpidos insaturados. Resultado: el resultado negativo confirma la presencia de lpidos insaturados en la seccin.

c) Deteccin de lpidos con negro sudan B (Pearse, 1985).

1-llevar las secciones hasta alcohol 70%. 2- Teir durante 30 a temperatura ambiente en una solucin saturada de negro sudn B en alcohol 70%. 3-lavado rpido en alcohol 70%. 4- lavar en agua corriente. 5-montar en glicerina.

Resultados: Lpidos o lipoprotenas resistentes se tien de negro o azul.

d) Mtodo de Klver-Barrera para la deteccin de fosfolpidos y glicolpidos (Pearse, 1985) 1-llevar las secciones a alcohol 100% 2-teir con una solucin al 0,1% de Luxol fast blue MBS en alcohol 96% de 6 a 18 horas en estufa (56-60C). 3-Lavar en alcohol 70% y en agua destilada. 4- diferenciar en una solucin acuosa de carbonato de litio al 0,05% entre 30a 2 horas. 5-deshidratar, aclarar y montar.

Resultados: fosfolpidos y glicolpidos en azul.

e) Tcnica de Brukner (Pearse, 1985).

1- Aplicar a cortes secos (luego de sacar la parafina) 2 a 3 gotas de una mezcla de 1 ml de una solucin acuosa de orcinol al 2% y 10 ml de cido sulfrico 2N. 2-Colocarlos en estufa o plancha caliente a 90.

Resultados: cerebrsidos y ganglisidos en rojo o rojo azulado.

Comprobacin de grupos 1,2- glicol

Saponificacin previa al mtodo de PAS (desacetilacin).

1 % de KOH en alcohol 70%, 20 a temperatura ambiente o 20% de amonaco en alcohol 80% el mismo tiempo. Esta reaccin es til para desacetilar grupos bloqueados, si aumenta la reaccin de PAS luego de la saponificacin puede ser por la presencia de cido silico con acetilos que impiden la reaccin de PAS ya que la saponificacin saca los grupos acetilos de los 1-2 glicoles dejndolos reactivos al PAS.

Acetilacin (bloqueo reversible de los grupos 1-2 glicol)

Colocar los portas 1-24 hs en 16 ml de actico anhidro y 24 ml de piridina anhidra. Lavar en agua destilada y realizar el PAS. El resultado negativo comprueba la deteccin de los grupos 1-2 glicol de las hexosas. Luego desacetilamos con la saponificacin y se debera restaurar la reaccin PAS positiva.

Como conviene realizar estos procedimientos. Tomar dos cortes del mismo tejido llevarlos hasta agua destilada.

1-Colocar ambos cortes en la mezcla de acetilacin, lavar en agua y realizar el PAS en uno solo de los cortes.. 2- Con el otro corte, luego de la acetilacin colocar en la mezcla de saponificacin, y luego realizar el PAS. Resultados: El primer corte debe dar PAS negativo, el segundo PAS positivo. Esto demostrara la presencia real de funciones 1-2 glicol-

Presencia de glucgeno

Carmin de Best

1. Hidratar las secciones. 2. Teir con hematoxilina (Ej. la de Harris 2 min) 3. lavar bien en agua de canilla 4. 5-10 minutos con solucin de carmn de Best 5. Difreenciar con la solucin diferenciadora de Best hasta que la seccin quede clara.. 6. pasaje directo a alcohol ablsoluto, 2 cambios. 7. aclarar en xilol y montar

Solucin de carmn de Best: 2 partes de carmn de Best, dos partes de amonaco y 3 partes de metanol

Carmn de Best: Carmn 2 gr. Carbonato de potasio 1 gr. Cloruro de potasio 5 gr. Agua destilada 60 ml

Hervir 5 min y luego agregar 20 ml de amonaco (mantener en frasco color caramelo (oscuridad) y en la heladera).

Solucin de diferenciacin de Best: alcohol metlico absoluto 40 ml, alcohol etlico absoluto 80 ml, agua destilada 100 ml.

Azucares neutros y azcares cidos:

a) Tcnicas de Volts:

I- Deteccin de cido silico total (Volz, et al., 1987a).

1-hidratar. 2-Saponificacin con KOH (ver antes) 3-Oxidacin peridica selectiva. Se enfran los cortes a 4C y se oxidan con una solucin 0,4 mM de cido peridico en 1M de HCL a 4C durante 1 hora. Conviene tener antes de usar una solucin stock de: HCL 2M y otra de cido peridico 0,8mM (0,1823g en 1000ml). Ambas se conservan en la heladera a 4C. Antes de usar mezclar partes iguales para hacer la solucin de oxidacin suave. 4-lavar en agua destilada a 4C 10. 5- Reactivo de Schiff 10. 6-Agua corriente -5. 7-Deshidrtar y montar.

Resultados: hidratos de carbono con cido silico en rosa.

II- Deteccin de azcares neutros (bloqueo del cido silico) (Volz et al., 1987b)

1-hidratar. 2-saponificar con KOH 15. 3-Oxidacin peridica selectiva 1 hora a 4C (igual que en la tcnica anterior) 4-agua destilada a 4C 10. 5-Reducir con una solucin reciente de borohidruro de sodio durante 30 a temperatura ambiente. (Disolver 1 g de fosfato dibsico de sodio (Na2HPO4 ) e n 100 ml de agua destilada y luego agregar 0,1 g de borohidruro de sodio. El pH de la solucin deber ser 9,4) 6- Lavar en agua corriente 5. 7-Oxidacin normal (peridico al 1%) durante 10. 8-Lavar varias veces con agua destilada. 9- Reactivo de Schiff 5. 10-Lavar con aguan corriente 5. 11-deshidratar y montar.

Resultados: slo azucares neutros en rosa

b) Deteccin de azcares con residuos cidos.

I- Azul Alcin a pH 0,5 y 2,5 (Lev y Spicer, 1964; Pearse, 1985)

Azul alcin pH 0,5 1- hidratar. 2- lavar en una solucin de HCl 0,2 M pH 0,5. 3-Azul alcin al 1% preparado en la solucin de HCl 0,2 M pH 0,5- 30.

4-lavar en la solucin de HCl. 5-Secar en la estufa. 6-Alcohol 100%- xilol, blsamo.

Para la tcnica de azul alcin pH 2,5, realizar los mismos pasos anteriores pero utilizar una solucin de cido actico al 3%, pH 2,5, para los lavados y para preparar el colorante azul alcin a pH 2,5.

Resultados: pH 0,5: Glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados en azul. PH 2,5: Glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados y carboxilados en azul.

El resultado positivo de los carboxilados puede suprimirse por la metilacin de los mismos (Bancroft y Stevens, 1990)

Metilacin suave: 1-Tomar dos cortes exactamente iguales. 2-Colocar 1 corte durante 4hs a 37 en una mezcla de 0,8 ml de HCl y 99,2 ml de metanol. El otro corte (control) se lo deja el mismo tiempo en agua destilada a 37. 3-Realizar la tcnica de azul alcin pH 2,5. Resultados: El color azul luego de la metilacin indica la presencia de grupos sulfatados, los carboxilos quedan bloqueados.

II- Orcena y azul alcin (Singh y Gorton, 1989) 1-hidratar. 2-Solucin de Permanganato de potasio al 0,25% y cido sulfrico al 1,25%.-1. 3-Acido oxlico 2% (hasta que las secciones pierdan el color de la solucin anterior)

4-Lavar en agua destilada. 5-4 horas en una solucin de orcena (1g de orcena en 100 ml de alcohol 70% ms 1 ml de HCl concentrado). 6- lavar en agua corriente. 7-Diferenciar varios segundos en alcohol acidificado (100ml de alcohol 96% ms 1 ml de actico puro). 8-lavar en agua destilada. 9-Solucin de azul alcin pH 2,5 1 a 3. 10-deshidratar y montar.

Resultados: La orcena teir de marrn los glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados, mientras que en azul se vern teidos las glicoconjugados y glicosaminoglicanos carboxilados ya que los sulfatados -que tambin se tien con el azul alcin al pH utilizado por la tcnica- se ven enmascarados por la orcena natural. La orcena tambin tie las fibras elsticas.

III- Azul alcin y amarillo alcin (Bancroft y Stevens, 1990) 1-Hidratar 2- Lavar en una solucin de HCl 0,2 M pH 0,5. 3-Azul alcin al 1% preparado en la solucin de HCl 0,2 M pH 0,5- 30. 4-lavar en la solucin de HCl. 5- Agua destilada. 6-Alcin amarillo (Alcin amarillo 1 g en 100 ml de cido actico al 3%. pH 2,5) 5 7-Agua destilada. 8-deshidratar (o secar en estufa). 9-xilol-blsamo.

Resultados: sulfatados en azul, carboxilados en amarillo, clulas con mezcla de ambos en verde.

e)- PAS y azul alcin (Bancroft y Stevens, 1990.) 1-hidratar. 2-Azul alcin pH 2,5 -5. 3-Lavar con agua corriente y luego con destilada. 4-Acido peridico al 1% -10. 5-Lavar bien en agua destilada. 6-Reactivo de Schiff (Tomasi) 15. 7-Agua corriente 10. 8-Deshidratar y montar.

Resultados: PAS+, azul alcin- (color rojo o rosado): ha sido interpretado como indicador de glicoprotenas neutras (raramente glicolpidos insolubles). PAS+, azul alcin+ (el color depender de la entidad dominante y puede variar del azul prpura, hacia el prpura o al violeta): glicoprotenas cidas o una mezcla de glicoprotenas cidas y neutras o una mezcla de glicoprotenas cidas y neutras ms glicosaminoglicanos. PAS-, Azul alcin+ (color azul): se juzgan como glicosaminoglicanos y glicoprotenas cidas libres de hexosas PAS reactivas. Tambin debe considerarse aqu la presencia de glicoprotenas cidas con hexosas bloqueadas por la unin del azul alcin a la macromolcula (Bancroft y Stevens, 1990).

Hidratos de carbono o carbohidratos.

Los carbohidratos complejos como los polisacridos y oligosacricos pueden detectarse mediante las llamadas tcnicas histoqumicas. Algunos son inmunognicos (pueden utilizarse tcnicas de inmunocitoqumica para su deteccin) debido a su gran tamao o por su unin covalente a otros componentes formando glicoconjugados (proteoglicanos, glicoprotenas, glicolpidos).

Tcnicas histoqumicas para la deteccin de hidratos de carbono:

Tcnica de PAS o APS. La reaccin de PAS o APS (Acido Perydico - reactivo de Schiff) es una de las ms utilizadas para detectar polisacridos presentes en el glucgeno, en las secreciones mucosas, en las membranas basales, etc. Los cortes se tratan primero con el cido perydico que reacciona con los azucares formando aldehdos. Luego se coloca el reactivo de Schiff que se une a los aldehdos formando un pigmento magenta insoluble. Tcnica de azul alcin. El azul alcin tie de azul hidratos de carbono asociados a grupos sulfato o carboxilos. Se utiliza para detectar glicosaminoglicanos, glicoprotenas sulfatadas o carboxiladas. Estos compuestos son muy comunes en algunas secreciones glandulares y en la matriz extracelular. El siguiente cuadro contiene tres imgenes del epitelio cilndrico del intestino delgado obtenidas con MO a 1000x. La flecha negra seala la regin ocupada con los grnulos de secrecin ubicada en el polo apical de una clula glandular caliciforme.

Tcnica de PAS con hematoxilina. Mediante Tcnica de azul alcian con Tcnica de H-E. El polo apical esta tcnica hematoxilina. Mediante esta aparece como vaco. Nada comprobamos la tcnica comprobamos que el nos dice sobre la naturaleza presencia de hidratos de material secretorio contiene qumica del producto de carbono en el material a hidratos de carbono sulfatados secretar. la flecha azul secrecin. o carboxilados. seala la membrana basal.

Si necesita ms informacin o tcnicas para detectar hidratos de carbono puede consultar: "Tcnicas utilizadas para detectar glicoconjugados y glicanos en secciones de parafina" publicado en el Histoinforme. SAH. 12(2): 5-11. 2001.

Tcnica de las lectinas: las lectinas son protenas que se unen especficamente a los hidratos de carbono. Existen cientos de lectinas diferentes, cada una reconoce un residuo especfico de un hidrato de carbono. Es una tcnica sumamente precisa para detectar hidratos de carbono. Por ejemplo, la lectina UEA 1 (Ulex europaeus) detecta fucosa, la lectina Con A (Concanavalina A) detecta la manosa, la WGA (Wheat germ agglutinin) detecta N-acetil-D-glucosamina, etc. La unin de la lectina al hidrato de carbono es similar a una reaccin antgeno-anticuerpo. Debido a que no son visibles con MO deben ser unidas a un compuesto fluorescente (fluorescena, rodamna) o a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina) demostrable posteriormente por histoqumica enzimtica.

Corte de colon observado con MO de fluorescencia. La lectina LEL se observa con fluorescencia naranja indicando la presencia de hidratos de carbono con Nacetilglucosamina.

Corte de colon observado con MO de fluorescencia. La lectina ACL se observa con fluorescencia verde indicando la presencia de hidratos de carbono con galactosil Nacetilgalactosamina.

Preparado de epitelio de la trquea observado con MO. Las clulas glandulares presentan una acumulacin apical de hidratos de carbono ricos en galactosil Nacetilgalactosamina. Se utiliz la lectina PNA, que fue evidenciada mediante reaccin enzimtica para peroxidasa.

Si desea ms informacin sobre lectinas ingrese aqu

TCNICAS HISTOLGICAS
Hematoxilina Fosfotngstica Hematoxilina de Harris + Eosina Mtodo de Grocott para fungos Mtodos de Ziehl-Nielsen e Fite para bacilos cido-resistentes Melanina (remoo) Azul de Alcian Mtodo de Weigert - Van Gieson para elstico e colgeno Tricrmico de Masson Verde Metil Pironina Giemsa - mtodo de Wolbach modificado Escarlate R mtodo de Herxheimer PAS - Reao do cido Peridico - Schiff Reticulina - mtodo de Gomori Mtodo de Von Kossa para clcio Gram - mtodo de Macallum-Goodpasture Mucicarmim Cristal Violeta Mtodo de Warthin para Treponema Sudo Negro para gorduras Pigmento de Formol em corte histolgico (remoo) Mtodo de Fontana-Masson para melanina Soluo sulfocrmica Mtodo de Grimelius para neurosecreo Azul de Toluidina para substncia metacromtica Reao de Perls para Hemossiderina AGNOR FIXADORES e especificao FERRO COLOIDAL DE MOWRY

HEMATOXILINA FOSFOTNGSTICA
Hematoxilina gua destilada cido Fosfotngstico gua destilada 1g 500 ml 20 g 500 ml

Dissolver a Hematoxilina em 500 ml de gua destilada com o auxlio de calor, sem ferver e agitando sempre. Dissolver o cido Fosfotngstico em 500 ml de gua destilada. Juntar as duas solues e agitar. Guardar e envelhecer durante 6 meses.

IODO ALCOLICO
Iodo Iodeto de Potssio lcool 95% 3g 6g 300ml

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Desparafinar e hidratar Refixar em Bicloreto de Mercrio, soluo saturada por 24 horas Passar em gua destilada 3 vezes Iodo Alcolico 5% por 5 minutos Passar em gua destilada 3 vezes Tiossulfato de Sdio 5% por 5 minutos Passar em gua destilada 3 vezes Oxidar em Permanganato de Potssio 0,25% por 5 minutos Passar em gua destilada 3 vezes cido Oxlico 5% por 10 a 20 minutos Passar em gua destilada 3 vezes Corar pela HEMATOXILINA FOSFOTNGSTICA 24 horas Salvar o corante e desidratar, diafanizar e montar.

RESULTADO: Fibras Colagenas azul escuro

HEMATOXILINA DE HARRIS
Hematoxilina lcool 95% Sulfato de Alumnio e Potssio gua Destilada xido de Mercrio 5g 50ml 100g 1000ml 2,5g

Dissolver a Hematoxilina no lcool e o Almen na gua destilada com o auxlio de calor. Misturar as duas solues e ferver o mais rpido possvel. Remover da fonte de calor e juntar o xido de Mercrio aos pouquinhos com cuidado, reaquecer at a fervura e contar um minuto. Afastar da fonte de calor e mergulhar em uma bacia com gua e gelo imediatamente.

Adicionar 4 ml de cido Actico, quando o corante estiver resfriado.

EOSINA

Eosina

2,5g

gua destilada 50 ml lcool 95% lcool 80% 200 ml 750 ml

Dissolver a EOSINA na gua destilada e acrescentar o lcool 95% Juntar os 750 ml de lcool 80% e mais 5 ml de cido Actico.

MTODO DE GROCOTT PARA FUNGOS

Fixao Formalina Solues cido Crmico Nitrato de Prata Metenamina Brax

10% soluo aquosa a 5% soluo aquosa a 5% soluo aquosa a 3% soluo aquosa a 5%

Bissulfito de Sdio soluo aquosa a 1%

SOLUO ESTOQUE DE METENAMINA-NITRATO DE PRATA

Nitrato de Prata soluo aquosa a 5% Metenamina

5 ml

soluo aquosa a 3% 100 ml

* Ao juntar as solues forma-se uma nuvem branca que se dissolve ao agitar.

SOLUO DE TRABALHO DE METENAMINA-NITRATO DE PRATA

Soluo estoque de Metenamina-Nitrato de Prata gua destilada Soluo de Brax 5% Tiossulfato de Sdio

25 ml 25 ml 2 ml soluo aquosa a 2%

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Desparafinar, hidratar pelo lcool at a gua corrente por 5 min Oxidar em soluo de cido Crmico a 5% durante uma hora Lavar em gua corrente por poucos segundos Bissulfito de Sdio a 1% durante um minuto Lavar em gua corrente 5 minutos Enxaguar em gua destilada 3 a 4 passagens Impregnar pela soluo de trabalho de METENAMINA-NITRATO DE PRATA em estufa a 60C durante 30 a 60 minutos. Controlar ao microscpio (crtico)* at que os fungos corem-se em marrom dourado. Enxaguar em 6 trocas de gua destilada Remover a prata em excesso com tiossulfato de Sdio 2% por 3 min Lavar em gua corrente por 2 minutos Corar os ncleos pela Hematoxilina de Harris por 5 segundos Lavar em gua corrente por 5 minutos Desidratar, diafanizar e montar com Entellan.

Resultado: Fungos em marrom dourado; Ncleos em azul *impregnao em excesso cora outros componentes, principalmente fibras colgenas e ncleos, e atrapalha a visualizao dos fungos.

MTODO DE ZIEHL-NIELSEN PARA BACILOS LCOOL-CIDO RESISTENTES (tuberculose, hansenase)

Corante de Ziehl-Nielsen Fenol lcool Absoluto Fucsina Bsica (p) 8 ml 20 ml 2g

gua Destilada

200 ml

Corante de Azul de Metileno gua destilada Azul de Metileno 99 ml 0,5 g

cido Actico Glacial 0,5 ml

Diferenciador lcool 70% cido Clordrico puro 99 ml 1 ml

Mistura para desparafinar Xilol Vaselina 60 ml 30 ml

Procedimento:

1. Desparafinar na mistura xilol-vaselina por 10 minutos 2 vezes 2. Secar a lmina em papel filtro dobrado 3. Corar pela Fucsina de Ziehl-Nielsen a quente: filtre o corante sobre o

4. 5. 6. 7. 8. 9.

corte na lmina em um suporte e aquea com uma chama sob a lmina at ver o vapor comear a subir da lmina. Repetir por 3 vezes com 2 minutos de espao entre os aquecimentos. Lavar em gua corrente para retirar o excesso do corante Diferenciar no lcool-cido cuidadosamente, revelando cor rsea no corte, e mergulhar na gua corrente interrompendo a diferenciao Lavar em gua corrente por 10 minutos Corar pelo Azul de Metileno por 1 minuto Retirar o excesso em gua corrente rapidamente Desidratar, diafanizar e montar.

Resultado: Bacilos em vermelho; Ncleos em azul

MTODO de FITE PARA BACILOS LCOOL-CIDO RESISTENTES

FRAGMENTOS; fixados em formol 10 % e cortes em parafina de 6 micrmetros REAGENTES:

1-Xilol-leo de Amndoa leo de Amndoa Xilol 1 parte 2 partes

2-Corante de Ziehl-Nielsen Preparo conforme tcnica anterior [4]

3-cido Sulfrico 2% lcool 70% ou gua destilada cido Sulfrico 98 ml 2 ml

NOTA: Usar gua ou lcool 70% conforme o micro organismo para ser evidenciado: se tuberculose use lcool 70%, se lepra use gua PROCEDIMENTO:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Desparafinar em 2 etapas de Xilol - leo de Amndoa por 12 minutos cada Secar por compresso utilizando papel filtro dobrado Secar ao ar Corar em soluo corante de Ziehl-Nielsen [filtrado] por 15 a 30 minutos em temperatura ambiente Lavar em gua corrente por 5 minutos Diferenciar em [3] conforme nota acima Lavar em gua corrente por 5 a 10 minutos Contracorar com Azul de Metileno por 1 minuto Lavar em gua corrente por 10 minutos Secar em papel filtro. Completar a secagem agitando a lmina ao ar e passagens em xilis Montagem em Permount ou Entellan

RESULTADO: Bacilos vermelho; Fundo azul

MELANINA (remoo)

SOLUO DE PERMANGANATO DE POTSSIO Permanganato de Potssio gua destilada 0,25 g 100 ml

SOLUO DE CIDO OXLICO cido Oxlico gua destilada 5g 100 ml

PROCEDIMENTO:

1. Desparafinar e hidratar at a gua corrente 2. Passar em gua destilada 3. Colocar na soluo de Permanganato de Potssio 0,25%, por 30 minutos a 1 4. 5. 6. 7. 8.
hora, dependendo da quantidade do pigmento Lavar demoradamente em gua corrente e passar em gua destilada Colocar na soluo de cido Oxlico a 5% at que o corte fique descorado Lavar em gua corrente por 10 minutos Passar em gua destilada Corar qualquer colorao a seguir

AZUL DE ALCIAN PH 2,7

SOLUO DE CIDO ACTICO cido Actico Glacial gua destilada 3 ml 97 ml

SOLUO DE AZUL DE ALCIAN Azul de Alcian Soluo de cido Actico a 3% 1g 100 ml

SOLUO DE SAFRANINA Safranina 0,1 g

Soluo aquosa de cido Actico a 3% 100 ml

PROCEDIMENTO:

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Desparafinar at a gua corrente e gua destilada Corar pelo Azul de Alcian por 30 minutos Lavar em gua corrente por 10 minutos Contracorar pela Safranina 0,1% por 1 minuto Passar em gua para retirar excesso Desidratar, diafanizar e montar.

MTODO DE WEIGERT - VAN GIESON PARA ELSTICO E COLGENO

Corante de WEIGERT Fucsina Bsica Resorcina 2g 4g

gua destilada 200 ml

Preparo do corante de Weigert: Misturar em uma cpsula de porcelana bem limpa os elementos acima, aquecer at ebulir esta soluo e permanecer ebulindo por 1 minuto, adicionar 25 ml de Cloreto Frrico soluo aquosa a 29%. Esfriar, filtrar em um papel filtro dobrado (sanfonado), desprezar o lquido filtrado e salvar o precipitado com o papel filtro utilizado. Abrir o papel filtro contendo o precipitado na cpsula de porcelana e acomodala na estufa para que seque completamente. De posse da cpsula com o papel filtro e o precipitado seco, adicione 200 ml de lcool 95% e com o auxlio do calor, aquea cuidadosamente a soluo at dissolver o precipitado, retire do calor e remova o papel filtro da soluo e deixe a soluo esfriar naturalmente, adicione 4 ml de cido Clordrico e adicione mais lcool 95% perfazendo o volume final de 200 ml.

Corante de VAN GIESON

Fucsina cida 1% soluo aquosa

5 ml

Soluo aquosa saturada de cido Pcrico 100 ml

HEMATOXILINA DE WEIGERT

Soluo A Hematoxilina lcool 95% 1,0 g 100 ml

Soluo B Cloreto Frrico 29% gua destilada 4,0 ml 95,0 ml

cido Clordrico concentrado 1,0 ml

PROCEDIMENTO:

1. Desparafinar em Xilol, lcool at a gua corrente 2. Corar pela Hematoxilina Frrica de Weigert por 10 minutos. Misturar as 3. 4. 5. 6. 7. 8.
solues A e B em volumes iguais no momento do uso. Lavar em gua corrente por 10 minutos Passar em lcool 95% Corar pelo corante de Weigert por 30 minutos a 1 hora. Lavar em gua corrente por 5 minutos Corar pelo corante de Van Gieson por 30 segundos Desidratar diretamente, diafanizar e montar.

RESULTADO: Fibras elsticas - azul escuro Ncleos - azul a preto Colgeno - rseo a vermelho Outros elementos - amarelo

TRICRMICO DE MASSON

SOLUO DE BOUIN

Soluo saturada de cido Pcrico Formaldedo puro cido Actico Glacial

75 ml 25 ml 5 ml

HEMATOXILINA FRRICA DE WEIGERT

Soluo A

Hematoxilina p lcool 95%

1g 100 ml

Soluo B

Soluo aquosa de Cloreto Frrico a 29% gua destilada cido Clordrico Concentrado

4 ml 95 ml 1 ml

Soluo de trabalho: juntar na hora do uso partes iguais da soluo A e B

SOLUO DE ESCARLATE DE BIEBRICH Soluo aquosa de Escarlate de Biebrich 1% Soluo aquosa de Fucsina cida 1% cido Actico Glacial 90 ml 10 ml 1 ml

SOLUO CIDA FOSFOTNGSTICA-FOSFOMOLBDICA cido Fosfotngstico 2,5 g

cido Fosfomolbdico gua destilada

2,5 g 100 ml

SOLUO DE AZUL DE ANILINA Azul de Anilina cido Actico Glacial gua destilada 2,5 g 2 ml 100 ml

SOLUO DE GUA-CIDO gua destilada cido Actico Glacial 100 ml 1 ml

PROCEDIMENTO:

1. Desparafinar e hidratar 2. Lavar em gua corrente por 5 minutos 3. Mordentar em soluo de Bouin por 1 hora na estufa a 60 graus ou
preferencialmente deixar por uma noite em temperatura ambiente

4. Lavar em gua corrente at desaparecer o amarelo deixado pela soluo de 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

Bouin Passe em gua destilada Core pela soluo de Hematoxilina Frrica de Weigert (A e B) por 10 minutos Lavar em gua corrente por 10 minutos Passe em gua destilada Corar pela soluo de Escarlate de Biebrich por 5 minutos Passe por gua destilada Diferencie pela soluo de cido Fosfotngstico-Fosfomolbdico durante 10 a 15 minutos Passe por gua destilada Corar pela soluo de Azul de Anilina durante 5 a 10 minutos Lave em gua destilada Passe pela soluo de cido Actico Glacial 1% por 3 a 5 minutos Passe por gua destilada Desidrate, diafanize e monte em resina.

RESULTADO

Ncleos - pretos Citoplasma, Queratina, Fibras intercelulares - vermelho Colageno e Muco - azul

VERDE METIL PIRONINA

Fixao: Formalina a 10 % tamponada ou Carnoy Cortes de 4 m SOLUES:

SOLUO ESTOQUE DE VERDE METIL 1% Verde Metil gua destilada 1g 100 ml

Extrair e purificar a soluo de Verde Metil

Mtodo: 1. Adicionar 100 ml de clorofrmio na soluo estoque de Verde Metil e agitar bem 2. Deixar por vrias horas no extrator ou durante a noite se possvel, acondicionado em um funil de separao 3. Descartar o clorofrmio do separador 4. Repetir a operao at que o clorofrmio saia sem cor, usualmente na terceira vez suficiente para remover as impurezas da soluo

SOLUO ESTOQUE DE PIRONINA A 1% Pironina GS gua destilada 1g 100 ml

Aquea delicadamente a soluo at dissolver o corante SOLUO DE TRABALHO VERDE METIL PIRONINA Soluo estoque purificada de Verde Metil Soluo estoque de Pironina GS 1% 70 ml 30 ml

Ajustar o pH para 4.8 usando uma soluo de Acetato de Sdio a 1%. Deixar o corante descansar por uma noite antes de usar. No filtrar.

PROCEDIMENTO: 1. Desparafinar e hidratar at a gua destilada 2. Filtrar sobre a lmina a soluo corante e deixar por 2 minutos 3. Por as lminas entre papel filtro pressionando e secar no ar durante 5 minutos 4. Diferenciar individualmente com uma ou duas gotas de gua destilada. Checar em microscpio e se os cortes esto vermelhos, diferencie rapidamente em lcool etlico a 80% -5 graus 5. Desidratar em acetona duas ou trs mergulhadas rpidas 6. Completar passando em uma mistura de partes iguais de xilol-acetona e em duas passagens de Xilol por 1 ou 2 minutos cada 7. Montar em resina RESULTADOS: cido Ribonucleico (RNA) vermelho cido Desoxiribonucleico (DNA) azul ou azul esverdeado

GIEMSA MTODO MODIFICADO DE WOLBACH

GIEMSA SOLUO ESTOQUE Giemsa p Glicerina PA Metanol 3g 198 ml 198 ml

Dissolver o p de Giemsa em Glicerina na estufa a 60 C por 2 horas e acrescentar o metanol aps a retirada da estufa. PROCEDIMENTO

1. Desparafinar e hidratar 2. Corar na soluo corante de Giemsa diluda: 10 ml de soluo estoque em 90

3. 4. 5. 6. 7.

ml de gua destilada, corar nesta soluo por 1 hora. Preparar para a diferenciao: uma cubeta plstica com gua destilada e trs gotas de cido Actico Glacial, uma cubeta plstica com lcool absoluto e trs gotas de cido Actico, uma cubeta com lcool absoluto e duas com Xilol. Mergulhar uma vez na cubeta contendo gua acidulada Mergulhar uma vez na cubeta contendo lcool acidulado Controlar no microscpio e se for necessrio repetir os passos 3 e 4 Mergulhar na cubeta de lcool absoluto at a lmina esteja limpa Mergulhar na seqncia xilol e montar em resina

RESULTADO Ncleos azul Citoplasma rosa

Bactrias azul

ESCARLATE R. MTODO DE HERXHEIMER

Soluo corante de ESCARLATE Acetona lcool 70% Escarlate R 50 ml 50 ml 0,3 g

Agitar e filtrar antes do uso, recuperar aps o uso. De tempo em tempo, adicionar pequena quantidade de acetona/lcool 70% na soluo de Escarlate R para evitar a formao de precipitado. PROCEDIMENTO:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Cortar em congelao cortes com 15 a 20 micra Colher os cortes em gua destilada Passar em lcool 50%, 2 a 5 minutos Passar os cortes diretamente para o corante de Escarlate R Diferenciar em lcool 70% rapidamente Passar em gua destilada Corar os ncleos pela Hematoxilina Harris Passar os cortes novamente para a gua destilada Colher os cortes em lminas, em uma vasilha com gua Montar com Gelatina/Glicerina

RESULTADO Ncleos azul Lpides vermelho vivo

PAS - CIDO PERIDICO + REATIVO DE SCHIFF

SOLUO CORANTE: REATIVO DE SCHIFF Aquecer 200 ml de gua destilada em um erlenmeyer de 500 ml at a ebulio. Adicionar 1 g de Fucsina Bsica (MERCK, granulada) cuidadosamente adicionando pouco a pouco, evitando a reao trmica, deixar abaixar a temperatura em 60 C aproximadamente e filtrar AGITANDO SEMPRE at que a temperatura abaixe do ambiente. Adicione 20 ml de cido Clordrico 1N * gua destilada. 92 ml cido Clordrico. 8 ml Adicione tambm 1 g de Metabissulfito de Sdio Continuar agitando por mais 3 horas e deixar em repouso durante a noite. Adicionar 1 g de carvo ativado. Agite por 1 hora, filtre o corante e estoque em

geladeira.

SOLUO DE CIDO PERIDICO 0,5% Cristais de cido Peridico gua destilada 0,5 g 100 ml

PROCEDIMENTO

1. Desparafinar e hidratar 2. Oxidar em cido Peridico 0,5% por 15 minutos 3. Lavar em gua corrente por 5 minutos e enxaguar na gua destilada por 3 4. 5. 6. 7. 8.
vezes Corar em Reativo de Schiff por 30 minutos Lavar em gua corrente por 5 minutos Contra corar pela Hematoxilina de Harris por 5 segundos Lavar em gua corrente por 5 minutos Desidratar, diafanizar e montar em resina

RESULTADO Glicognio, mucina, membrana basal, fungos - vermelho Ncleos azul

RETICULINA MTODO DE GOMORI

Fixao: formol a 10% Tcnica: Parafina, cortes em 6-8 m Soluo de Prata Amoniacal: estvel por 2 semanas Diluir em 10 ml de gua destilada 1 g de Nitrato de Prata, Diluir em 10 ml de gua destilada 1g de Hidrxido de Potssio Aos 10 ml de Nitrato de Prata a 10% juntar 2,5 ml de Hidrxido de Potssio a 10% em um erlenmeyer e nesta mistura precipitada adicionar 26 a 28 gotas de hidrxido de Amnio, agitando sempre quando for gotejando o Hidrxido de Amnio at que o precipitado desaparea quase completamente, restando alguns grnulos no fundo do erlenmeyer (se desejar dobre o volume com gua destilada, de acordo com a tcnica original) Trabalhe com a vidraria muito limpa e livre de cido Soluo de Permanganato de Potssio Permanganato de Potssio.........0,5 g gua destilada............................100 ml Soluo de Metabissulfito de Potssio Metabissulfito de Potssio...........2,0 g gua destilada............................100 ml

Soluo de Formol Formaldedo...............................20,0 ml gua destilada...........................80,0 ml Soluo de Sulfato de Amnio Frrico (Almen de Ferro) Sulfato de Amnio Frrico...........2,0 g gua destilada............................100 ml Soluo de Cloreto de Ouro Soluo de Cloreto de Ouro a 1%..........20,0 ml gua destilada..........................................80,0 ml Soluo de tiossulfato de Sdio Tiossulfato de Sdio....................2,0 g gua destilada...........................100 ml PROCEDIMENTO: 1. Desparafinar e hidratar 2. Oxidar em Permanganato de Potssio 0,5% por 5 minutos 3. Lavar em gua corrente por 2 minutos 4. Diferenciar em Metabissulfito de Potssio 2% por 5 minutos 5. Lavar em gua corrente por 2 minutos 6. Sensibilizar em Sulfato de Amnio Frrico 2% por 5 minutos 7. Lavar em gua corrente por 5 minutos e passar em gua destilada 3 vezes 8. Impregnar na soluo de Prata Amoniacal (filtrando a soluo sobre a lmina) por 30 segundos despreze a soluo utilizada 9. Lavar em gua destilada rapidamente 10. Reduzir em Formol 20% por 3 minutos 11. Lavar em gua corrente por 5 minutos 12. Passar em Cloreto de Ouro 0,2% por 10 minutos 13. Lavar em gua destilada por 3 trocas 14. Passar em Metabissulfito de Potssio por 5 minutos 15. Lavar em gua destilada 3 trocas 16. Passar em tiossulfato de Sdio 2% por 5 minutos 17. Lavar em gua corrente por 2 minutos 18. Corar pela Hematoxilina de Harris por 5 segundos 19. Desidratar, diafanizar e montar RESULTADO: Fibras reticulnicas - preto

MTODO DE VON KOSSA - PARA CLCIO

FIXAO: Formol 10% ou preferencialmente em lcool, Cortes 6 m Soluo de NITRATO DE PRATA 5% Nitrato de Prata......................5 g gua destilada.................100 ml

Soluo TIOSULFATO DE SDIO 5% tiossulfato de Sdio...............5 g gua destilada.................100 ml Soluo de SAFRANINA Safranina...............................0,1 g cido Actico Glacial............1 ml gua destilada.....................99 ml PROCEDIMENTO: 1. Desparafinar, hidratar 2. Passar por 3 vezes em gua destilada 3. Gotejar sobre o corte na lmina o Nitrato de Prata e submeta a luz solar por 30 minutos a 1 hora ou luz ultra violeta ou ainda a uma lmpada de 100 watts 4. Enxaguar em gua destilada 5. Passar em tiossulfato de Sdio 5% 6. Lavar em gua destilada por 3 vezes 7. Contra corar os ncleos pela Safranina por 5 minutos 8. Desidratar, diafanizar e montar RESULTADO: Ncleo vermelho Citoplasma rosa Clcio preto

GRAM HISTOLOGICO - MTODO DE MACALLUM GOODPASTURE

Soluo de GOODPASTURE Fucsina Bsica.................0,59 g Anilina...............................1,00 ml lcool 30%...................100,00 ml Fenol.................................1,00 ml Soluo de STIRLING Violeta de Genciana..........5,00 g Anilina................................2,00 ml lcool absoluto......................10,00 ml gua destilada......................88,00 ml Soluo Saturada de CIDO PCRICO cido Pcrico..............................1,18 g gua destilada......................100,00 ml Soluo de IODO PARA GRAM Iodo..................................1,00 g Iodeto de Potssio.........2,00 g gua destilada.........300,00 ml PREPARAR: Dissolver em 3 ml de gua destilada o IODO e em seguida dissolver na mesma soluo o IODETO DE POTSSIO, sem acrescentar mais gua, aps completar acrescente os 297 ml de gua restantes.

PROCEDIMENTO: 1. Desparafinar hidratar 2. Corar com GOODPARTURE por 10 minutos (agitar e filtrar sobre a lmina) 3. Lavar em gua destilada 4. Diferenciar em FORMALINA PA pura por 3 minutos 5. Lavar em gua destilada 6. Corar o fundo com soluo de CIDO PCRICO por 3 a 5 minutos 7. Lavar em gua destilada 8. Diferenciar em lcool 95% por 30 segundos 9. Lavar em gua destilada 10. Corar no STIRLING por 3 minutos (filtrar sobre a lmina no instante do uso) 11. Lavar em gua destilada 12. Corar na soluo de IODO/IODETO DE POTSSIO por 1 minuto 13. Enxugar as lminas em papel filtro por compresso, mas deixando um pouco mida 14. Mergulhar as lminas em uma mistura de partes iguais de XILOL E ANILINA com vrias trocas 15. Xilol com 2 trocas 16. Montar em resina NO REUTILIZE O XILOL DESTA EM OUTRA COLORAO A MISTURA DO XILOL/ANILINA MUITO TXICA RESULTADO: Bactrias Gram-positivas azul Bactrias Gram-negativas vermelho Outros elementos vermelho para prpura

MUCICARMIM
Soluo Corante de MUCICARMIM Carmim........................................1,0 g Cloreto de Alumnio Anidro........0,5 g gua destilada..........................2,0 ml Misturar em um pequeno frasco de vidro os componentes listados e aquecer em uma fonte eltrica por 2 minutos. O lquido vai ficando vermelho escuro e consistncia de xarope. Diluir o contedo do frasco em 100 ml de lcool 50% e repousar por 24 horas. Para o uso filtre em uma proveta um volume e acrescente 5 volumes de gua destilada. PROCEDIMENTO 1. Desparafinar e hidratar 2. Core pela Hematoxilina de Harris por 30 segundos 3. Lavar em gua corrente por 5 minutos 4. Corar pelo corante MUCICARMIM por 30 minutos 5. Desidratar diretamente, diafanizar e montar RESULTADO: Ncleos - azul Mucinas - rseo para vermelho Outros elementos - amarelo

CRISTAL VIOLETA

Fixao: Formalina a 10% Cortes em parafina: 4 a 6 m SOLUES: Cristal Violeta soluo estoque Cristal Violeta.................................14,0 g lcool etlico a 95%....................100,0 ml Cristal Violeta soluo funcionante Soluo estoque de Cristal Violeta.......10,0 ml gua destilada.......................................300,0 ml cido Clordrico concentrado...................1,0 ml Meio de Montagem Gelatina.................................10,0 g gua destilada...........................60,0 ml Aquecer at a gelatina dissolver e adicionar: Fenol.............................................1,0 ml PROCEDIMENTO: 1. Desparafinar e hidratar at a gua destilada 2. Corar na soluo funcionante de Cristal Violeta 5 horas 3. Lavar em gua corrente por 15 minutos 4. Montar as lminas com o meio de montagem ou se preferir deve secar as lminas no ar 5. Quando desejar examinar coloque uma gota de gua destilada e recubra com uma laminula RESULTADO: Amilide - violeta prpura Outros elementos - azul

MTODO DE WARTHIN PARA ESPIROQUETAS

Fixao: Formalina 10% tamponada Cortes em parafina de 6 m SOLUES TAMPO 1-gua Tamponada pH 3,6 Acetato de Sdio..............16,4 g gua destilada...............1000,0 ml 2-cido Actico Glacial 11,8% gua destilada..................100,0 ml cido Actico Glacial.........11,8 ml

Preparar a soluo tamponada pH 3,6 misture: Soluo-1..............3,0 ml

Soluo-2............37,0 ml gua destilada.960,0 ml 3-Nitrato de Prata 1% Nitrato de Prata...............1,0 g gua destilada...........100,0 ml A- Hidroquinona 3% Hidroquinona....................0,3 g gua Tamponada.........10,0 ml B- Gelatina 5% Gelatina neutra.............5,0 g gua destilada........100,0 ml C- Nitrato de Prata 2% Nitrato de Prata...........0,5 g gua destilada.........25,0 ml *Preparar todas as solues, manter somente a soluo de Nitrato de Prata na estufa 60-65 C e misturar as solues na ordem: Soluo Hidroquinona (A).............4 ml Soluo Gelatina (B)....................60 ml Soluo de Nitrato de Prata (C)..12 ml PROCEDIMENTO 1. Desparafinar hidratar at a gua destilada 2. Impregnar na soluo de Nitrato de Prata a 1% (preparada em gua tamponada) na estufa a 60 C por uma hora 3. Lavar rapidamente em gua bi-destilada ou deionizada 4. Revelar na soluo Hidroquinona/Gelatina/Nitrato de Prata (ABC) at ficar castanho dourado, de 3 a 4 minutos 5. Lavar em gua tamponada por 3 minutos 6. Desidratar, diafanizar e montar RESULTADO: Espiroquetas - negras Fundo - castanho amarelado

SUDO NEGRO - PARA GORDURAS

Cortes de congelao ou em parafina Preparar em uma cubeta com lcool 70% soluo saturada de SUDO NEGRO A tcnica prpria para cortes de congelao, se preferir fazer em lminas com cortes de parafina no ter o mesmo resultado. PROCEDIMENTO 1. Cortes de congelao em gua destilada 2. Colocar em lcool 50% por 2 minutos 3. Corar pelo SUDO NEGRO por 30 minutos (filtrar no uso) 4. Passar em lcool 50% por 2 minutos para diferenciar

5. Colocar em gua destilada 6. Pescar em lminas 7. Montar em glicerina/gelatina = TCNICA 18 RESULTADO: Lpides em preto

PIGMENTO DE FORMOL EM CORTES HISTOLGICOS (REMOO)

SOLUO DE LCOOL AMONIACAL Amnia PA...........................1,0 ml lcool 75%.......................200,0 ml PROCEDIMENTO 1. Desparafinar e lavar em gua corrente 2. Submeter a soluo de LCOOL AMONIACAL durante 30 minutos 3. Lavar por 10 minutos 4. Seguir a colorao ou reao...

TCNICA DE FONTANA-MASSON PARA MELANINA

SOLUO DE PRATA AMONIACAL Dissolver 10 g de Nitrato de Prata em 100 ml de gua destilada Separar 95 ml desta soluo e nesta adicionar o Hidrxido de amnio em gotas, tornando a princpio a soluo precipitada. Com a adio do Hidrxido de Amnio o precipitado dissolve-se Se a soluo ficou clara utilize os 5 ml de Nitrato de Prata 10% para torna-la opalescente Deixe em repouso por uma noite Da soluo pronta para o uso, utilize 25 ml e acrescente 75 ml de gua destilada e filtre SOLUO CORANTE DE SAFRANINA Safranina...................................0,1 g gua destilada....................100,0 ml cido Actico Glacial.............1,0 ml SOLUO DE CLORETO DE OURO 0,2% Soluo estoque de Cloreto de Ouro 1%...10,0 ml gua destilada...............................................40,0 ml SOLUO DE TIOSSULFATO DE SDIO 5% Tiossulfato de Sdio..................5,0 g gua destilada.....................100,0 ml PROCEDIMENTO 1. Desparafinar e hidratar at a gua destilada 2. Impregnar na soluo de Nitrato de Prata/Amoniacal filtrada para o uso, e por na estufa a 56 C por uma hora. Os cortes tornam-se marrom claro 3. Enxaguar em gua destilada 4. Submeter em Cloreto de Ouro 0,2% por 10 minutos

5. Enxaguar em gua destilada 3 vezes 6. Reduzir em Tiossulfato de Sdio 5% por 5 minutos 7. Enxaguar em gua destilada 3 vezes 8. Corar os ncleos pela soluo Corante de Safranina por 5 minutos 9. Enxaguar em gua destilada por 2 vezes 10. Desidratar, diafanizar e montar RESULTADO: Ncleos rosa Grnulos argentafins - preto

SOLUO SULFOCRMICA
Bicromato de Potssio....................60,0 g gua destilada..............................200,0 ml cido Sulfrico..............................200,0 ml Dissolver o Bicromato de Potssio em gua destilada e acrescentar aos poucos o cido Sulfrico, utilize o frasco prprio para suportar o calor da reao do cido com a gua, a soluo deve precipitar e nesta fase acrescente um pouco de gua destilada para que o precipitado desaparea mas fique no limite UTILIZAR ERLENMEYER COM NO MNIMO O TRIPLO DO VOLUME A SER PREPARADO Vidrarias devem ser submetidas a soluo Sulfocromica por no mnimo 20 minutos

TCNICA DE GRIMELIUS PARA GRNULOS DE NEUROSECREO

Soluo A (impregnadora) 150 ml de gua destilada 2 ml de Nitrato de Prata a 2% A gua deve ser aquecida at a ebulio e separando 50 ml desta gua adicionar 2 ml da soluo de Nitrato de Prata a 2% e aguardar a temperatura abaixar a 60 C Soluo B (reveladora) 100 ml de gua destilada 5 g de Sulfito de Sdio 1 g de Hidroquinona Aquecer os 100 ml de gua destilada at a ebulio e adicionar os sais (Sulfito de Sdio e Hidroquinona) e aguardar a temperatura abaixar at 60 C Corante Nuclear: SAFRANINA Safranina....................0,1 g gua destilada...........99 ml cido Actico...............1 ml PROCEDIMENTO: 1. Desparafinar e hidratar 2. Lavar em gua destilada exaustivamente 3. Submeter na soluo A por 3 minutos a 65 C 4. Lavar em gua destilada a 65 C 5. Submeter na soluo B por 1 minuto

6. Lavar em gua destilada a 65 C 7. Repetir na soluo A por 1 minuto a 65 C 8. Lavar em gua destilada a 65 C 9. Repetir na soluo B por 1 minuto 10. Lavar em gua destilada a 65 C 11. Lavar em gua destilada em temperatura ambiente 12. Corar os ncleos pela Safranina por 1 minuto 13. Desidratar, diafanizar e montar com resina RESULTADO: grnulos argentafins impregnados (amarelo/marrom/negro) ncleos em vermelho

AZUL DE TOLUIDINA
Fixao: Formalina a 10% Cortes em parafina de 6 m AZUL DE TOLUIDINA Azul de Toluidina.....................0,1 g gua destilada......................100 ml PROCEDIMENTO: 1. Desparainar e hidratar, aps gua destilada 2. Corar pelo Azul de Toluidina por 30 minutos 3. Enxaguar em gua destilada 4. Cubra o corte com laminula sobre uma gota de gua destilada 5. Moldure a laminula com cera aquecida Recomendamos usar uma lmina controle com um corte de cordo umbilical RESULTADO: Substncia metacromtica em rseo

PERLS PARA HEMOSSIDERINA

Fixao: Formalina a 10 % Cortes em parafina de 5 m Solues: A- Soluo FERROCIANETO DE POTSSIO Ferrocianeto de Potssio......................2,5 g gua destilada........................................25 ml B- Soluo CIDO CLORDRICO cido clordrico..................................5 ml gua destilada.................................20 ml Misturar a soluo A e B em partes iguais (25 + 25) sempre no instante do uso Soluo corante de SAFRANINA Safranina.............................0,1 g gua destilada...................99 ml cido Actico Glacial..........1 ml

PROCEDIMENTO: 1. Desparafinar e hidratar 2. Passar em gua destilada 3. Submeter a soluo Cloridrco-Ferrocianeto por 1 hora 4. Enxaguar em gua destilada por 3 vezes 5. Contracorar pela Safranina por 2 minutos 6. Passar em gua para diferenciar (controle ao microscpio) 7. Desidratar, diafanizar e montar RESULTADO: Pigmento Frrico azul Ncleos vermelho

AZUL DE TOLUIDINA Colorante que tie estructura basfilas, tales como la cromatina. Se puede comportar como colorante ortocromtico (tie de color azul) o metacromtico (tie de color violeta-rojo), dependiendo del pH y de la naturaleza qumica de la sustancia teida. Como colorante ortocromtico, se usa frecuentemente para teir tejido nervioso, donde tie la heterocromatina y los grnulos de Nissl (acmulos de cisternas de retculo endoplsmico rugoso de los somas neuronales, as como las fibras nerviosas amielnicas y clulas de gla. Tambin se utiliza para la tincin de cortes semifinos. El azul de toluidina tie metacromticamente las estructuras ricas en proteoglucanos sulfatados, como el heparn sulfato, presente - por ejemplo - en el cartlago joven (condroblastos y matriz inmadura) y en los grnulos de las clulas cebadas.

AZUL DE TOLUIDINA

Colorante que tie estructura basfilas, tales como la cromatina. Se puede comportar como colorante ortocromtico (tie de color azul) o metacromtico (tie de color violeta-rojo), dependiendo del pH y de la naturaleza qumica de la sustancia teida. Como colorante ortocromtico, se usa frecuentemente para teir tejido nervioso, donde tie la heterocromatina y los grnulos de Nissl (acmulos de cisternas de retculo endoplsmico rugoso de los somas neuronales, as como las fibras nerviosas amielnicas y clulas de gla. Tambin se utiliza para la tincin de cortes semifinos. El azul de toluidina tie metacromticamente las estructuras ricas en proteoglucanos sulfatados, como el heparn sulfato, presente - por ejemplo - en el cartlago joven (condroblastos y matriz inmadura) y en los grnulos de las clulas cebadas.

RESULTADOS: Ortocromasia: las estructuras basfilas aparecen teidas de color azul. Imagen: Soma neuronal del asta ventral de la mdula espinal de rata.

RESULTADOS:

Metacromasia. las estructuras metacromticas aparecen teidas de color violeta. Imagen: CSF de filamento primario branquial de trucha arco iris.

Plata metanamina de Gomori

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La plata metanamina de Grocott es un mtodo de tincin especial ms empleado para hongos. La reaccin tintorial est basada en que, en presencia de cido perydico, los polisacridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehdos; stos, a su vez, reducen el complejo nitrato-plata metanamina (o metenamina) produciendo una coloracin de caf a negra, debido al depsito de plata reducida en los lugares de localizacin de los aldehdos. Tambin se utiliza para la identificacin de la melanina. Este pigmento es producido en la piel por los melanocitos. En los humanos la melanina se encuentra en piel, cabello, en el recubrimiento de la retina. Aunque los seres humanos generalmente poseen una concentracin similar de melanocitos en su piel, estos expresan en algunos individuos y en algunas etnias ms frecuentemente el gen productor de melanina, por lo que se confiere una mayor concentracin de melanina en la piel.

Contenido
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1 Preparacin de la muestra 2 Reactivos 3 Procedimiento 4 Resultados 5 Bibliografa 6 Enlaces externos

[editar] Preparacin de la muestra

El tejido debe ser fijado en formol para mejores resultados, y seccionado a 5 micras.

[editar] Reactivos
1. Solucin de cido brico (solucin A): 1. 3,09 g de cido brico. 2. 250 cc de agua destilada. 2. Solucin de tetraborato sdico (solucin B): 1. 4,77 g de tetraborato sdico. 2. 250 cc de agua destilada. 3. Solucin buffer borato (comprobar que el pH sea 8.2) 1. 13 cc de solucin A. 2. 7 cc de solucin B. 4. Solucin de plata metanamina: 1. 42,5 cc de metanamina (hexametilentetranamina) 3%. 2. 2,5 cc de nitrato de plata 5%. 3. 12 cc de buffer borato (pH 8.2).

[editar] Procedimiento
Debe evitarse, durante todo el proceso, el uso de instrumentos metlicos, ya que la plata precipitara sobre ellos.
1. 2. 3. 4. Desparafinar e hidratar. Aadir cido perydico 0,5%, 12 minutos. Lavar con agua destilada. Sumergir los cortes en la solucin de plata metanamina, 1 hora mnimo a 60 C; a partir de este tiempo comprobar regularmente al microscopio. 5. Lavar con agua destilada. 6. Aadir cloruro de oro, 1 minuto. 7. Lavar con agua destilada.

8. 9. 10. 11.

Aadir tiosulfato sdico 3%, 1-2 minutos. Lavar con agua corriente. Tincin de contraste (rojo nuclear, hematoxilina, verde luz...), 1 minuto. Deshidratar, aclarar, montar.

[editar] Resultados

Reticulina, membranas basales, hongos, mucinas, glucgeno: negro. Fondo: segn tincin de contraste. Nucleos: marrn oscuro a negro

1 Tinciones ms utilizadas 2 Tcnicas para gla o 2.1 Cajal con oro sublimado o 2.2 Del Rio Hortega 2.3 Tcnica de Golgi ? Hortega ? Lavigna 3 Tcnicas para mielina o 3.1 Kluver Barrera o 3.2 Weigert o 3.3 Tetrxido de osmio o 3.4 Azul de toluidina

Tinciones ms utilizadas
Tcnicas Nota Soma Ncleo basfilo plido Pericarion intensa// basfilo. Tcnica de Nissl o basofilia Dendritas Axn

HyE

Acidfilas

Acidfilo

Tie ncleos de todas las clulas (colorante bsico (neuronas y gla) y la sust de Nissl de anilina como (REG y ribosomas libres) azul de Toloudina o de metileno que Los cuerpos de en medio cido Se usa p/ estudiar detalles citolgicos y Nissl tambin se con pH 3 citoarquitectnicos. denominan reacciona con los ergastoplasma. P de los cidos nucleicos) Tcnica de Cajal Neurofilamentos y neurotbulos del soma, axones y dendritas, se observan Ncleo negativo

Ncleo se tie dbil// en comparacin al pericarion.

El inicio

Negativo

Las prolongaciones neuronales y

formando un artificio llamado (se impregna con neurofibrillas, de color marrn. nitrato de plata, se reduce con Sc reductora de Cajal Permite el estudio de prolongaciones neuronales, No es posible observar y se vira con una Sc de cloruro de detalles citolgicos ni el ncleo celular. Posibilita observar el neuropilo!! oro)

amarillo Pericarion marrn por tener neurofibrillas.

gliales y algunos vasos aparecen impregnados de color marrn. Se tien porque tie selectiva// neurofibrillas (tambin se colorean las prolongaciones de la glia)

Esta tcnica fue la precursora de todas las tcnicas de impregnacin argntica. Tcnica de Golgi (fijacin en bloque, o sea sin cortarlo en dicromato de K+ --> impregncin con nitrato de plata --> inclusin en celoidina --> corte) Se observan neuronas, gla y vasos de color negro sobre un fondo amarillo de especto semejante al acrlico. La coloracin es selectiva, impregnndose entre el 5 y el 20 % de las neuronas y clulas gliales; pero las que lo hacen, se impregnan completamente, con todas sus prolongaciones. Se utiliza p/ estudiar campos dendrticos, espinas dendrticas y colaterales axonales sin detalles citolgicos.

? Las tcnicas de Golgi y de Cajal son un tipo de impregnacin argntica.

Tcnica de Golgi

Tcnica de Cajal

Tcnicas para gla

Cajal con oro sublimado
Cloruro de mercurio y de oro que precipitan sobre gliofilamentos. Resultado: los astrocitos y sus prolongaciones aparecen impregnados de color negro. El fondo es habitualmente incoloro o marrn, algunas veces se observa de color prpura. Se pueden ver los pies perivasculares

Del Rio Hortega

Usa nitrato de plata y carbonato de litio formando un precipitado sobre el carbonato de plata que vira con cloruro de oro ? se ven astrocitos y prolongaciones negros sobre fondo amarillo (algunas variantes en la tcnica permiten ver microglia y oligodendroglia)

Tcnica de Golgi ? Hortega ? Lavigna

Tie selectivamente oligodendrocitos

Tcnicas para mielina

Colorean la mielina pero no el axn, el cual da una imagen negativa.

Kluver Barrera
Usa violeta de cresilo (bsico) + luxol fast blue (colorante p/ lpidos de vaina de mielina) --> se colorean ncleos y sustancia de Nissl violeta y la mielina de azul.

multiples somas neuronales (flecha violeta) y ncleos pequeos gliales (flecha rosa).

\Weigert
Usa hematoxilina + agregados de mordiente + cloruro frrico --> se tien las lipoprotenas de la vaina de mielina de color negro sobre fondo amarillo plido.

Tetrxido de osmio
El osmio reacciona con los lpidos a nivel de sus enlaces insaturados. Tie los lpidos de la vaina de mielina de negro Ej: Nervio mielnico con esta tincin

Azul de toluidina
Tie mielina de azul. Ej: N perifrico

Tincin tricrmica de Masson

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La tincin tricrmica de Masson, al igual que otras tinciones tricrmicas, es una tcnica de coloracin especial que permite visualizar claramente las fibras de colgeno tipo I que forman fibras gruesas o haces, diseados para dar resistencia; tambin evidencia, aunque en menor intensidad, las fibras reticulares. Se emplean tres colorantes para diferenciar el ncleo celular, el citoplasma y las fibras de colgeno.

Contenido
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1 Fundamento 2 Tejido control y diana 3 Reactivos 4 Procedimiento o 4.1 Anlisis de resultados o 4.2 Variantes 5 Vase tambin 6 Bibliografa 7 Enlaces externos

[editar] Fundamento
Primeramente, se tien las secciones con un tinte cido tal como escarlata de Biebrich. Todos los elementos acidfilos del tejido tales como el citoplasma, el msculo y el

colgeno se unirn a los tintes cidos. Las secciones entonces se tratan con cido fosfotngstico y/o fosfomolbdico. Ya que el citoplasma es mucho menos permeable que el colgeno, los cidos fosfotngsticos y fosfomolbdicos permiten que la escarlata de Biebrich difunda del colgeno pero no del citoplasma. Los cidos fosfotngsticos y fosfomolbdicos tienen numerosos grupos cidos que probablemente acten como medio de unin entre el colgeno y el azul de la anilina, que es el tinte del colgeno. Probablemente, el pH de la solucin fosfotngstico/fosfomolbdico tambin aumente la coloracin y ayude al colgeno en la difusin o el retiro de los colorantes.

[editar] Tejido control y diana

Cualquier tejido con componente conjuntivo, en especial con contenido en fibras colgenas, puede servir como control o ser un tejido diana. Cualquier fijador es vlido, si bien es de eleccin la solucin de Bouin. El grosor de corte ptimo de las muestras es de entre 4 y 6 micras.

[editar] Reactivos
1. Solucin de hematoxilina frrica de Weigert. 2. Solucin de escarlata de Biebrich fucsina cida: 1. 90 cc de escarlata de Biebrich al 1% en agua destilada. 2. 9 cc de fucsina cida al 1% en solucin acuosa. 3. 1 cc de cido actico glacial. 3. Solucin acuosa de cido fosfomolbdico (utilizar cido fosfotngstico en la misma proporcin, si se va a teir con verde luz): 1. 5 g de cido fosfomolbdico. 2. 200 cc de agua destilada. 4. Solucin de azul de anilina: 1. 2,5 g de azul de anilina. 2. 2 cc de cido actico glacial. 3. 98 cc de agua destilada. 5. Solucin de verde luz al 2% (alternativa al azul): 1. 2 g de verde luz SF amarillento. 2. 99 cc de agua destilada. 3. 1 cc de cido actico glacial. 6. Solucin diferenciadora: solucin acuosa de cido actico glacial al 1%.

[editar] Procedimiento
1. Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada de manera habitual. 2. En material fijado en soluciones de formaldehdo o alcohlicas se recomienda hacer un mordentaje previo con lquido de Bouin durante 1 hora a 56-60 C o toda la noche a temperatura ambiente. 3. Enfriar y lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo. 4. Teir con hematoxilina frrica durante 10 minutos. Lavar en agua corriente durante 10 minutos.

5. 6. 7. 8.

9. 10. 11. 12.

Lavar en agua destilada. Teir con la solucin de escarlata-fucsina cida durante 2-5 minutos. Lavar en agua destilada. Tratar con la solucin de cido fosfomolbdico-fosfotngstico durante 10-15 minutos si se va a colorear con la solucin de azul de anilina, o en la solucin acuosa de cido fosfotngstico al 5% durante 15 minutos si se desea teir con verde luz. Teir con solucin de azul de anilina 15 minutos o con solucin de verde luz 5 minutos. Lavar en agua destilada. Diferenciar en la solucin de cido actico al 1% durante 3-5 minutos. Deshidratar, aclarar y montar.

[editar] Anlisis de resultados

Fibras de colgeno = Azul.

Por tanto, el tejido conjuntivo se teir de dicho color.

Estructuras oxidadas + Citoplasma = Rojo.

Se teirn de rojo la queratina, los glbulos rojos y el tejido muscular.

Ncleo celular = Lila, marrn.

[editar] Variantes

La tcnica presenta multitud de variantes, pero las principales modificaciones hacen referencia al uso de un diferenciador despus de la hematoxilina (por ejemplo, cido pcrico), el tiempo de las soluciones, la temperatura, etc.

Tcnica de la hematoxilina frrica de Weigert

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Fibras eslasticas teidas de azul.

La tcnica de la hematoxilina frrica de Weigert es una combinacin de tinciones utilizados en histologa que resulta til en la identificacin de fibras elsticas. Resulta de la combinacin de Orceina, Resorcinol y Fucsina.

[editar] Resultados

Fibras elsticas: Azul Ncleo celular: Azul o rojo

Tejido Conectivo Tricrmica de Gomori

Se trata de una solucin actica estabilizada que contiene Chromotrope 2R, Azul de Anilina y Acido Fosfotngstico. Listo para usar. No requiere dilucin. Colorante Histolgico. Tie citoplasma y fibras musculares de rojo, mientras que el colgeno toma un color azulado.

Tricrmica de Masson
Soluciones colorantes destinadas a la tincin segn tcnica de Masson y sus modificaciones (Lillie). Los colorantes se presentan listos para usar. No requieren diluciones. Para su empleo pueden combinarse de acuerdo a las necesidades del usuario para lograr la tincin deseada. A diferencia de otros productos comerciales que poseen slo 2 colorantes, Biopur dispone de los 4 colorantes desarrollados para la tcnica. La ventaja principal de poder realizar estas combinaciones radica en la posibilidad de teir con colores diferentes de acuerdo a los tipos de tejidos en estudio. Se dispone de soluciones de: Fucsina Acida - Punz de Xilidina Fucsina Acida - Escarlata de Biebrich Azul de Anilina Fast Green FCF

Verde de Metilo - Pironina

Se trata de una solucin de Verde de Metilo asociada con Pironina G segn Tarf-Kurnick. Colorante Histolgico. Empleado para la investigacin histolgica del cido nucleico contenido en los tejidos, as como para demostrar la presencia de clulas de la serie linftica y clulas plasmticas. Tambin es til en la identificacin de clulas plasmticas y RNA en secciones de tejidos y preparaciones citolgicas.

Carbohidratos PAS
Se trata de un kit compuesto por soluciones de:

Acido Peridico al 1% (Conservar en Refrigerador 2-10C) Reactivo de Schiff Biopur (Conservar en Refrigerador 2-10C) Para la demostracin histoqumica de componentes celulares que contienen Glicoles, tales como Carbohidratos, Glicoprotenas, etc. Permite la observacin de Membranas Basales y algunas Mucinas

Mucicarmn
Se trata de un kit que contiene soluciones de: Mucicarmn Concentrada Biopur Actica de Tartrazina Biopur Colorante Histolgico. Usado en la identificacin de sitios de tumores primarios, ayudando a la distincin de clulas escamosas indiferenciadas mucina-negativas de los adenocarcinomas mucina-positivos. La cpsula de los criptococos (hongos) se tie de rosa oscuro. La tartrazina tie el citoplasma de amarillo.

Rojo Congo
Se trata de un kit que contiene soluciones de: Rojo Congo (Alcohlica Clorurada) (Stock) Alcohlica al 80%, clorurada (Stock) Hidrxido de Sodio 0.25 M Colorante Histolgico (Bennhold-Puchtler). Destinado a la determinacin de protena amiloide en secciones de tejidos con el empleo de microscopios de luz comn o polarizada.

Bacterias Gram
Se trata de un kit para la coloracin de bacterias con la tincin segn Gram Se dispone de soluciones de: Violeta Cristal Solucin Concentrada de Iodo Decolorante Safranina La tincin de Gram fue desarrollada en el ao 1884 por Christian Gram. La tincin hoy en da es aplicada para la clasificacin como paso inicial en la identificacin de las bacterias. Tambin, como consecuencia de la tincin, las bacterias muestran su forma, tamao, etc., lo que ayuda significativamente al diagnstico.

Ziehl
Se trata de un kit compuesto por colorantes y decolorante. Se dispone de soluciones de: Fucsina Bsica Decolorante Azul de Metileno Mtodo tradicional para la deteccin del bacilo tuberculoso. Para empleo con esputo, concentrado o por extensin directa, lquido cefalorraqudeo u otros fluidos corporales, incluyendo orina cateterizada y material homogeneizado de tejidos.

Tinciones Nucleares
Se trata de soluciones de Hematoxilina a diferentes concentraciones y con aplicaciones especficas. Hematoxilina Biopur est basada en la frmula de Gill #1 conteniendo 2g/L de Hematoxilina. Se trata de una solucin acuosa preparada por va qumica en fro, evitando de esta manera la perjudicial ebullicin. No precipita. No requiere filtrado para su empleo. Posee cido actico en su frmula, permitiendo su empleo inmediato, sin necesidad de aditivo alguno. Por esto, no requiere el agregado de cidos ni de mordientes. Lista para usar. Hematoxilina Biopur encuentra aplicacin en tcnicas citolgicas fundamentalmente. Hematoxilina "Activada" Biopur est basada en la frmula de Gill #2 conteniendo 4g/L de Hematoxilina. Se trata de una solucin acuosa preparada por va qumica en fro, evitando de esta manera la perjudicial ebullicin. No precipita. No requiere filtrado para su empleo. Posee cido actico en su frmula, permitiendo su empleo inmediato, sin necesidad de aditivo alguno. Por esto, no requiere el agregado de cidos ni de mordientes. Lista para usar. Hematoxilina Activada Biopur encuentra aplicacin en tcnicas histolgicas fundamentalmente. Hematoxilina Frrica de Weigert Biopur se compone de 2 soluciones para la preparacin de la misma. Una Solucin de Hematoxilina Alcohlica y una Solucin de Cloruro Frrico. Hematoxilina Frrica de Weigert Biopur encuentra aplicacin especfica en coloraciones especiales que requieren hematoxilina (Mucicarmn, Tricrmica de Masson, Tricrmica de Gomori)

Clsicas May Grunwald - Giemsa

Se trata de productos que se complementan para la tcnica de tincin segn May-Grnwald y Giemsa. Los colorantes segn May-Grnwald y Giemsa son combinaciones de azul y azures de metileno asociados con eosina. Estabilizador es un buffer fosfatos pH 6.5 regulador del pH del agua a ser utilizada en tinciones hematolgicas. Estabilizador Biopur asegura la tincin salmn de los hemates, descartndose los accidentes de las tonalidades rojo fucsia, que dificultan la tincin de los leucocitos, y de las azuladas, que entorpecen la metacromasia.

Wright
Se trata de una solucin May-Grnwald-Giemsa compuesta. Tincin panptica diferencial en un solo paso.

Tincin 15
Se trata de un kit de tincin diferencial rpida compuesto por 3 soluciones: Fijador Solucin 1 (Xantnicos) Solucin 2 (Tiaznicos) Coloracin de extendidos. Tincin diferencial rpida (15 segundos) Puncin aspirativa Tejidos Biopsias por congelacin Muestras hematolgicas Recuento leucocitario diferencial

Shorr
En contraste con la tincin de Papanicolaou, la tincin de Shorr se usa solamente en citodiagnstico hormonal en el cual es superior. Permite lograr la diferenciacin neta de las clulas del epitelio vaginal. Tincin nuclear intensa y coloracin citoplasmtica homognea.

Coloracin Hematoxilina & Eosina Hematoxilina

Si bien tanto Hematoxilina Biopur como Hematoxilina Activada Biopur pueden ser usadas para la tcnica de coloracin Hematoxilina-Eosina, recomendamos el uso de Hematoxilina Activada Biopur dada su doble concentracin que permite lograr resultados en tiempos menores.

Eosina
Se trata de una solucin de eosina. Colorante cido. Utilizado como colorante de contraste de la hematoxilina en la tincin Hematoxilina-Eosina.