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OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

11 Nmero de publicacin: u o 51
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k 2 115 637 kInt. Cl. : C12P 23/00, A23K 1/18,

A23L 1/27, C12N 1/14, //(C12N 1/14, C12R 1:645)

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kNmero de solicitud europea: 92203995.3 u kFecha de presentacin : 17.12.92 o kNmero de publicacin de la solicitud: 0 551 676 u kFecha de publicacinode la solicitud: 21.07.93 o

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

T3

54 T tulo: Cepas de Phaa Rhodozyma que tienen una alta concentracin intracelular de astaxantina o

k k k k

y una baja concentracin intracelular de HDCO. o

30 Prioridad: 17.12.91 EP 91203312

73 Titular/es: Gist-Brocades N.V.

k k k

Wateringseweg 1 P.O. Box 1 NL-2600 MA Delft, NL

45 Fecha de la publicacin de la mencin BOPI: o o

72 Inventor/es: De Boer, Lex;

01.07.98

Van Hell, Bart y Krouwer, Andreas Jacobus Johanna

45 Fecha de la publicacin del folleto de patente: o

01.07.98

74 Agente: Elzaburu Mrquez, Fernando a

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Aviso:

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Bolet europeo de patentes, o n de la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina o o a Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar o a motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de o a o oposicin (art 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas). o
Venta de fasc culos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. C/Panam, 1 28036 Madrid n a

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DESCRIPCION Campo de la invencin o
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Esta invencin se reere a la produccin microbiana de astaxantina. Espec o o camente, se describen cepas de levaduras con un alto nivel de produccin de astaxantina y un bajo nivel de 3-hidroxi-3,4o dideshidro-,-caroten-4-ona (HDCO). Antecedentes de la invencin o

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La astaxantina es un carotenoide que se encuentra en la naturaleza, que es responsable del color rojo en el salmn, la trucha, el besugo y otros peces. En los entornos naturales, este carotenoide se obtiene o por la dieta de estos animales a base de crustceos y otros organismos que contienen astaxantina. a Los peces criados en granjas pisc colas o en piscifactor son generalmente plidos y carecen de los as a colores en la piel y en la carne que poseen sus congneres criados en el entorno natural. Esto se debe a e la carencia de astaxantina en la dieta. La adicin de astaxantina a la dieta de los peces es una manera o apropiada de solucionar el problema del color de los peces criados en entornos no naturales. La astaxantina utilizada con este propsito se puede obtener por medios semi-sintticos. Por razones o e de regulacin y debido a la creciente presin ejercida por los consumidores, puede ser favorable utilizar o o astaxantina procedente de fuentes naturales. Las fuentes naturales de astaxantina son el kril y las cscaras de langosta, algas, ores y levaduras. a La astaxantina extra de kril y langosta es muy cara. El rendimiento de astaxantina en algas es alto da pero la produccin de algas a gran escala plantea dicultades. Por lo tanto, se ha orientado la atencin o o a la utilizacin de levaduras, espec o camente Phaa rhodozyma para la produccin de astaxantina. o La levadura Phaa rhodozyma, que contiene astaxantina, se aisl por vez primera a principios de o la dcada de los setenta a partir de exudados de arboles deciduos en regiones montaosas de Japn y e n o Alaska (Pha y col. (1972) en Proceedings of the 4th IFS: Fermentation technology today, pgs. 759a 774, compilado por G. Terui, Kyoto). Se han determinado las concentraciones de astaxantina en cepas de Phaa rhodozyma de tipo salvaje. Johnson y Lewis ((1979), J. Gen. Microbiol. 155, 173-183) han encontrado que la concentracin de astaxantina, que es dependiente de las condiciones de cultivo, var o an considerablemente, pero nunca exceden de 650 g por g de peso seco de levadura. Cuando se cultiva la levadura en condiciones diferentes de crecimiento, los autores han encontrado, despus de la extraccin e o acetnica de los carotenoides, que uno de los principales contaminantes de la astaxantina es la 3-hidroxio 3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona (HDCO). En condiciones aerobias, la cantidad de HDCO es aproximadamente el 0,5-1,5 % de la cantidad de astaxantina. En condiciones microaerlas, esta cantidad crece hasta aproximadamente 26 % (Johnson y o Lewis, cita anterior), cantidad demasiado elevada. La concentracin de astaxantina de aproximadamente 650 g/g de peso seco, divulgada para las ceo pas de Phaa rhodozyma de tipo salvaje es demasiado baja para que el procedimiento sea interesante desde el punto de vista econmico. Por lo tanto, se han realizado estudios exhaustivos para aumentar el o rendimiento de astaxantina. Como se ha indicado anteriormente, Johnson y Lewis (1979) ya describieron numerosas condiciones diferentes de cultivo (pH, temperatura, fuente de carbono, presin de ox o geno y luz entre otros factores) que inuyen en la concentracin de astaxantina intracelular en Phaa. Una estrategia ms prometedora para o a obtener concentraciones ms altas de astaxantina es la mutagnesis clsica. An y Johnson ((1990) Antoa e a e nie van Leeuwenhoek 57 : 191-203) divulgan que la mutagnesis con N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) de cepas naturales de Phaa rhodozyma dio lugar a cepas con contenidos aumentados de carotenoides, divulgndose cantidades de hasta 1.050 g/g de peso seco. a Las cepas cultivadas en condiciones diferentes descritas por An y Johnson (cita anterior) se hall que o conten el 10-15 % de los carotenoides totales en forma de HDCO (aproximadamente el 30 % de la an cantidad de astaxantina). Tambin Lewis y col. ((1990) Appl. Environm. Microbiol. 56 : 2944-2945) e han indicado que la cantidad de HDCO en relacin con la de astaxantina crece debido a mutagnesis. En o e su situacin (Tabla 1) HDCO creci de 4 a 8 %. o o Lewis y col. describen cepas de Phaa rhodozyma que producen a lo sumo 725 g/g de peso seco de 2

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levadura Phaa y un porcentaje de HDCO de 7,7 % relativo a astaxantina. No se conocen efectos biolgicos para HDCO. De hecho, hasta ahora la presencia de HDCO slo se o o ha divulgado para Phaa rhodozyma. Las altas cantidades de HDCO, que parece ser que crecen debido a mutagnesis, son inaceptables como adiciones a la dieta animal. e Por lo tanto, claramente existe necesidad de astaxantina obtenida a partir de Phaa que tenga un bajo contenido de HDCO.
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La presente invencin proporciona astaxantina de esta clase. o Compendio de la invencin o La presente invencin proporciona cepas de Phaa rhodozyma que tienen alto contenido de astaxano tina con bajo porcentaje de HDCO. La presente invencin tambin proporciona una dieta o un pienso para animales que comprende clulas o e e de levadura o porciones de clulas de levadura, obtenido a partir de cepas sometidas a mutagnesis de e e Phaa rhodozyma, que tiene un alto contenido de astaxantina con un bajo porcentaje de HDCO.

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Descripcin detallada de la invencin o o Se obtuvo Phaa rhodozyma CBS 6938 a partir de Central Bureau voor Schimmelcultures (Baarn, The Netherlands).
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En trminos generales, la presente invencin describe cepas de Phaa rhodozyma que tienen un nivel e o elevado de astaxantina y un porcentaje relativamente bajo de HDCO. Dichas cepas se obtienen por un mtodo que comprende las siguientes operaciones: e
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- someter a mutagnesis una cepa de Phaa rhodozyma, e - seleccionar a simple vista una cepa con intensidad aumentada de color o seleccionar a simple vista colonias de color anaranjado (intenso) con alto contenido de astaxantina y bajo contenido de HDCO en relacin con el contenido de astaxantina, a partir de una poblacin de colonias rojas (con alto o o contenido de astaxantina y alto contenido de HDCO en relaci n con la cantidad de astaxantina), o - cultivar la cepa seleccionada en un medio uido, - extraer los carotenoides de las clulas, e

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- determinar las cantidades de carotenoides, - seleccionar una cepa con un nivel aumentado de astaxantina y un nivel bajo de 3-hidroxi-3,4dideshidro-,-caroten-4-ona.

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La mutagnesis se efect a en esta cepa de diversos modos, por ejemplo, por irradiacin UV o por e u o tratamiento con ciertas sustancias mutagnicas, por ejemplo, metanosulfonato de etilo, N-metil-N-nitroe N-nitrosoguanidina u otros anlogos de bases nucleot a dicas. Las cepas mutadas se seleccionan en base a la intensidad de color y/o la diferencia de color y los carotenoides se extrajeron, por ejemplo, por extraccin con acetona. o La seleccin en base a la diferencia de color se efecta como sigue o u Diluciones apropiadas de una suspensin de clulas sometidas a mutagnesis se cultivaron en placa o e e sobre placas de agar que conten medio sinttico. La dilucin se eligi de manera que crecieron 400-450 an e o o colonias sobre la supercie de una placa de 9,1 cm. Despus de 4-6 semanas de incubacin a 20C en la e o oscuridad, las colonias anaranjadas se aislaron a simple vista (las colonias que conten ms de 10 por an a ciento de HDCO se supon que eran rojas) y se utilizaron para experimentos en matraces agitados. a Un matraz agitado de 100 ml de capacidad que conten 25 ml de medio sinttico se inocul con una a e o cepa aislada como se ha descrito anteriormente y se incub durante 3 d (20C, 250 rpm). Seguidao as mente, se utiliz 1 ml de la suspensin de clulas para inocular 100 ml de medio sinttico en un matraz o o e e agitado de 500 ml de capacidad, protegido con pantallas, y se incub durante 4 d a 20C, 250 rpm. o as 3

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Despus de esto, se determinaron las cantidades de astaxantina, HDCO y peso seco. e La cantidad de carotenoides espec cos se determin por tcnicas cromatogrcas adecuadas tales o e a como cromatograf en capa na o HPLC. a
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Para obtener cepas con un contenido ms alto de astaxantina, se realizaron operaciones repetidas de a mutagnesis/seleccin. e o Aunque, en general, se encontraba, tanto en la bibliograf como en estos experimentos, que la cantia dad relativa de HDCO aumentaba al crecer la cantidad de astaxantina, ahora se han encontrado cepas con un alto contenido en astaxantina y con un bajo porcentaje de HDCO. Un nivel elevado de astaxantina indica que la cantidad ha aumentado en relacin con la cepa de tipo o salvaje, por ejemplo, por encima de aproximadamente 650 g/g de peso seco (como indican Johnson y a Lewis, J. Gen. Microbiol. (1979) 115, 178, Tabla 3). Preferiblemente, la cantidad est por encima de 2.000 g/g de peso seco, ms preferiblemente por encima de 8000 g/g de peso seco. a La cantidad de HDCO, que en la cepa de tipo salvaje es del orden de 0,5-1,0 % en relacin con la o cantidad de astaxantina, crece rpidamente tras la mutagnesis a niveles de hasta 35 % respecto del nivel a e de astaxantina. Un porcentaje bajo de HDCO se dene como inferior a 10 % de HDCO, preferiblemente inferior a 5 % de HDCO, ms preferiblemente inferior a 2 % respecto de astaxantina o incluso inferior a a 1 % de HDCO, por lo que la astaxantina se extrae de una cepa que contiene una cantidad de astaxantina superior a 650 g/g de peso seco. La presente invencin proporciona cepas que combinan un alto nivel de astaxantina con un bajo poro centaje de HDCO. Las cepas preferidas son aquellas que tienen un nivel de astaxantina por encima de 1500 g/g de peso seco y un porcentaje de HDCO inferior a 3 % del nivel de astaxantina. Para obtener cepas de Phaa combinando estas caracter sticas es posible someter a mutagnesis una e cepa que ya se ha seleccionado para la produccin elevada de astaxantina. se da un ejemplo de esta o situacin. o Sin embargo, tambin es posible partir de una cepa de tipo salvaje y seleccionar primero una dise minucin del porcentaje de HDCO y subsiguientemente someterla a mutagnesis para producir un nivel o e aumentado de astaxantina (manteniendo bajo el porcentaje de HDCO). La astaxantina aislada o contenida en las clulas se puede formular en dieta o pienso para animales. La e utilizacin de este pienso o dieta dar lugar al color deseado, por ejemplo, en salmnidos, besugo y huevas. o a o As la presente invencin proporciona una dieta o pienso para animales, que comprende clulas de Phaa , o e rhodozyma o porciones de clulas de Phaa rhodozyma, que contienen astaxantina en una cantidad de al e menos 852 g/g de peso seco de levadura y una concentracin de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroteno 4-ona inferior a 10 % de HDCO, preferiblemente inferior a 5 % de HDCO, ms preferiblemente inferior a a 2 % de HDCO o incluso inferior a 1 % de HDCO respecto del nivel de astaxantina en las clulas. e El mtodo tambin se puede emplear para obtener cepas que tienen un nivel bajo de astaxantina y e e un porcentaje bajo de HDCO. Los siguientes ejemplos se dan slo para ilustrar la invencin y no limitan la invencin de ningn o o o u modo. Cualquier experto en la tcnica intuir que se pueden utilizar otros mutgenos y otras cepas de e a a Phaa para obtener resultados iguales o similares. Parte experimental Medios
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Medio de biomalta Se disolvieron 122 gramos de MEX 11 (Diastatische Producten B.V. Leiden-Holland) en 1 litro de agua desmineralizada, se ajust el pH a 6,4 y se esteriliz la solucin durante 20 minutos a 120C. Para o o o la preparacin de medio de agar de biomalta, se a adi agar a una concentracin nal de 1,0 % (p/v). o n o o

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Medio de agar de dextrosa de patata (CM 11-2) Dextrosa de patata (Difco) Agua desmineralizada Agar pH antes de tratar en autoclave 39 g 1.000 ml 10 g 7,4

La esterilizacin se realiza calentando durante 20 minutos a 120C. o

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Medio sinttico e Componente del medio H-ftalato de K pH NaCl MgSO4 CaCl2 H2 SO4 NH4 Cl KH2 PO4 Acido c trico (NH4 )2 Fe(SO4 )2 ZnSO4 CuSO4 MnSO4 H3 BO3 Molibdato de Na KI Myo-inositol Acido nicot nico D-pantotenato de Ca Vitamina B1 p-Aminobenzoato Vitamina B6 Biotina Glucosa Concentracin (g/l) o 20 5,6 0,06 0,88 0,20 0,071 4,83 1 0,015 0,027 0,005 0,0075 0,0006 0,0006 0,0006 0,00015 0,059 0,003 0,003 0,003 0,002 0,0003 0,00001 33

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La esterilizacin se hizo durante 30 minutos a 110 C. o Mantenimiento de los cultivos

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Los cultivos de Phaa rhodozyma se almacenan de dos maneras: a. Se prepararon cultivos inclinados que conten medio de biomalta-agar a partir de Phaa rhodoan zyma CBS 6938 y se obtuvieron mutantes a partir de ellos. Estos cultivos inclinados se incuban 1 semana a 20C y subsiguientemente se congelan a -20C.

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b. Se preparan viales a partir de cultivos que se hacen crecer en matraces agitados de 100 ml de capacidad (con pantallas protectoras) que contienen 25 ml de medio sinttico (20 C, 250 rpm). Los e cultivos se centrifugan y suspenden en agua desmineralizada (ltrada en un sistema de ltracin o milli q, de Millipore), que contiene 10 % (v/v) de glicerol. Los viales se congelan en nitrgeno o l quido y se almacenan a -80C. Cromatografa de lquidos de alta ecacia Procedimiento de extraccin o

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Una muestra de 2,5 g de cultivo se pipete en un tubo de centrifugacin de vidrio, de 15 ml de cao o o quido sobrenadante. Se pacidad, cerrable, y se centrifug (3200 x g, 25 minutos, 15C). Se decant el l o a o a adieron 1,5 ml de acetona fr (5 C) y 5 g de esferas de vidrio (3 mm de dimetro) y se mezcl por n a 5

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vrtice. El contenido de los tubos de centrifugacin se mezcl en una mezcladora Vibrax R (IKA Modelo o o o Vibrax VXR) y la mezcladora se conect a la mxima velocidad durante 60 minutos. o a o Seguidamente, se a adi acetona (20 C) a un volumen nal de suspensin de 10 ml (sin las esferas n o de vidrio). La suspensin se homogeneiz y centrifug (3200 x g, 5 minutos, 20C). El sobrenadante se o o o utiliz para el anlisis HPLC. o a Equipo
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Columnas

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Detector Control e integracin : La integracin se realiz con el programa Maxima package, disponible o o o en el mercado por Waters Instruments. Tomador automtico a de muestras : Water 712 Wisp con sistema de refrigeracin. o Disolventes Hexilfosfato de bisetilo (16 g/l) y cido frmico (40 ml/l) en acetonitrilo. a o

: Cartucho Novapack R C 18 (5 x 100 mm) (Waters Associates, Milford, Massachusetts) : Detector sintonizable de absorbancia Waters 486

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Los disolventes ten calidad HPLC. an Operacin o Caudal Detector Temperatura Volumen de inyeccin o Patrn de astaxantina o : : : : 1 ml/min 471 nm 18C 20 l

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Como patrn, se utiliz una preparacin puricada de astaxantina (Gist-brocades, R&D department o o o CMA, Delft, The Netherlands). Brevemente, la puricacin se realiz como sigue: Astaxantina en aceite o o e o de Phaa (Aquaculture 20 123-134 (1980)), se trata con hexano. Despus de la ltracin y y el lavado, el producto cristalino se disuelve en cloruro de metileno (MTC), se aade metanol (en una relacin de n o 4 a 3 con respecto a MTC) y la mezcla se concentra a vac La astaxantina bruta obtenida se disuelve o. en cloroformo y se cromatograf sobre gel de s a lice (con tolueno/acetona 4:1). El producto secado se cristaliza de nuevo en una mezcla de MTC y metanol; opcionalmente esto se repite varias veces. En la medida de lo posible, el procedimiento se realiza al resguardo de la luz. La caracterizacin adicional del o producto se hace por HPLC. El contenido de astaxantina se expres como mg de astaxantina/kg de caldo. La cantidad de 3o hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona se calcul de la misma manera que la de astaxantina. Durante o los clculos, se hizo la suposicin de que la astaxantina tiene el mismo coeciente de extincin que la a o o 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona y, por lo tanto, se utiliz la misma muestra patrn de astao o xantina para los clculos. La cantidad de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona se expres en mg a o de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona/kg de caldo. Medicin del peso seco o

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Tubos de centrifugacin de plstico y de 12 ml de capacidad (Greiner) se secaron en una incubadora o a lice seca y despus de e durante 24 horas (105C). Los tubos se enfriaron en un desecador sobre gel de s esto se determin el peso (A) con cuatro decimales en una balanza Mattler AE200. Los tubos de centrifuo gacin se llenaron con aproximadamente 10 ml de suspensin de clulas y se determin el peso (B) como o o e o se ha descrito anteriormente. Las suspensiones de clulas se centrifugaron a temperatura ambiente (10 e minutos, 4000 rpm) y se decant el l o quido sobrenadante. Los tubos de centrifugacin con los sedimentos o e se secaron en una incubadora (24 horas, 105C). Despus de esto, los tubos se enfriaron en el desecador y se midi el peso como se ha descrito anteriormente (C). o

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Todas las mediciones de pesos secos se hicieron por duplicado. Clculo: peso seco (g/kg) = {(C-A)/(B-A)}1.000 y A, B y C se expresan en gramos. a
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Productos qumicos Las muestras patrn de astaxantina necesarias para las mediciones de HPLC se prepararon en Gisto brocades (CMA department). Todos los dems productos qu a micos utilizados en estos experimentos estn a disponibles en el mercado y tienen calidad anal tica.

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Mutagnesis e Se consigui una mejora de la cepa por mutacin clsica. Las mutaciones fueron inducidas mediante o o a la utilizacin de NTG (N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanina), EMS (metanosulfonato de etilo) o irradiacin o o ultravioleta y se consider que un o ndice de supervivencia del 10 % induc sucientes mutaciones. Se a hicieron diluciones apropiadas de suspensiones de clulas en placas de agar y despus de la incubacin e e o se compar la intensidad del color de las colonias rojas a simple vista y las colonias que mostraban la o mxima intensidad de color rojo se aislaron y utilizaron para experimentos en matraces agitados. a Ejemplo 1 Mediante rondas repetidas de mutagnesis y seleccin, se obtuvo una cepa de Phaa rhodozyma con e o alto contenido de astaxantina y alto contenido de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona, Phaa rhodozyma PF 11-3. Esta cepa se utiliz para aislar cepas con bajo contenido de 3-hidroxi-3,4-dideshidroo ,-caroten-4-ona. Se hizo crecer un cultivo de 100 ml en medio de biomalta en un matraz de 500 ml (con pantallas protectoras) durante 72 horas en una incubadora con agitacin (250 rpm, 20 C). El cultivo se o centrifug (4000 rpm, 10 minutos) y suspendi en 9 ml de tampn Tris (100 mM, pH 8,0). La densidad o o o de clulas de la suspensin se ajust a 108/ml. Subsiguientemente, se a adi 1 ml de NTG 10 mM en e o o n o tampn de acetato de Na 100 mM, pH 4,3, a 10 ml de la suspensin de clulas. A intervalos de tiempo o o e apropiados, se sacaron muestras y parte de cada muestra se diluy en medio salino siolgico y se cultiv o o o en placa sobre agar de patata-dextrosa para utilizarla en un ensayo de supervivencia. Otra parte de la muestra se congel en glicerol al 10 %. Despus de la determinacin del 10 % de supervivencia, la o e o muestra en cuestin se cultiv en placa en agar de patata-dextrosa y se incub una semana a 20C. Se o o o seleccionaron a simple vista colonias con el color rojo ms intenso y se ensayaron en un matraz agitado a de 100 ml de capacidad (con pantallas protectoras) que conten 25 ml de medio sinttico (250 rpm, a e e o 20C). Despus de 72 horas, se utiliz 1 ml de este cultivo para inocular 100 ml del mismo medio en un matraz agitado de 500 ml (con pantallas protectoras) y se incubaron en las mismas condiciones que las que se describen para el precultivo. Despus de 98 horas, se utilizaron 2,5 g del cultivo para preparar una e muestra para HPLC y se utilizaron 10 ml para la medicin del peso seco. La cepa PF 11-12 se seleccion o o despus de la mutagnesis de la cepa madre PF 11-13 y el contenido de astaxantina y 3-hidroxi-3,4e e dideshidro-,-caroten-4-ona se estim por HPLC. En la Tabla 1, se presentan los valores del contenido o de astaxantina y 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona de estas cepas y se comparan con la cepa de tipo salvaje Phaa rhodozyma CBS 6938. TABLA 1 Cepa
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Contenido de astaxantina (g/g DWT) 220 1280 1670 n.d. n.d. n.d.

Relacin de 3-hidroxi-3,4o dideshidro-,-caroten-4-ona 0,20 0,22 0,02 0,17 0,37 0,16

Phaa rhodozyma CBS 6938 Phaa rhodozyma PF 11-3

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Phaa rhodozyma PF 11-12 Phaa rhodozyma CBS 215.88 Phaa rhodozyma CBS 224.87

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Phaa rhodozyma CBS 225.87

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La relacin de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona se expresa como la relacin del contenido o o de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona y del contenido de astaxantina ms el contenido de a 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona.
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Las cepas Phaa rhodozyma CBS 215.88, CBS 224.87 y CBS 225.87 y el mtodo por el que se han e obtenido se describen en el documento de patente WO 88/08025. Brevemente, Phaa rhodozyma ATCC 24261 se someti a mutagnesis con EMS para obtener la cepa CBS 224.87. Subsiguientemente, la cepa o e CBS 224.87 se someti a mutagnesis con NTG para obtener CBS 225.87. Finalmente, la cepa CBS o e 215.88 es un reaislado de la cepa CBS 225.87. Se observa que estas cepas mutantes contienen un nivel relativamente alto de HDCO. Se comprueba que cuando la cepa mutante PF 11-12 se compara con la cepa madre PF 11-3, PF 11-12 contiene una cantidad aumentada de astaxantina, mientras que el contenido de 3-hidroxi-3,4dideshidro-,-caroten-4-ona disminuy en un factor de 10. PF 11-12 se deposit en Centraal Bureau o o voor Schimmelcultures (Baarn, The Netherlands) el 16 de diciembre de 1991, con el n mero CBS 797.91. u Ejemplo 2 Un cultivo de Phaa rhodozyma PF 11-12 se trat como se ha descrito en el Ejemplo 1, salvo que o se utilizaron 0,4 ml de EMS (Merck) como mutgeno en lugar de 1 ml de NTG 10 mM. La seleccin se a o llev a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 1. La cepa PF 11-18 se seleccion a partir de la cepa o o madre PF 11-12 y en la Tabla 2 se presentan los valores de los contenidos de astaxantina y 3-hidroxi3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona. TABLA 2

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Cepa

Contenido de astaxantina (g/g DWT) 220 1670 1800

Relacin de 3-hidroxi-3,4o dideshidro-,-caroten-4-ona 0,20 0,02 0,03

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Phaa rhodozyma CBS 6938 Phaa rhodozyma PF 11-12 Phaa rhodozyma PF 11-30

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Como en la Tabla 1. En este ejemplo, se muestra que se pueden aislar mutantes con mayor contenido de astaxantina a partir de cepas madre que contienen bajo contenido de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona (PF 11-12), mientras que el contenido de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona de la cepa mutante (PF 11-18) permanece bajo. Ejemplo 3

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Un cultivo de Phaa rhodozyma PF 11-18 se trat como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se utiliz 1 o o ml de NTG 10 mM. La seleccin se llev a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 1. La cepa PF 11-30 o o se seleccion a partir de la cepa madre PF 11-18. En la Tabla 3, se presentan los valores de astaxantina o y 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona: TABLA 3 Cepa Contenido de astaxantina (g/g DWT) 220 1800 1960 Relacin de 3-hidroxi-3,4o dideshidro-,-caroten-4-ona 0,20 0,03 0,02

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Phaa rhodozyma CBS 6938 Phaa rhodozyma PF 11-18

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Phaa rhodozyma PF 11-30 Como en la Tabla 1.

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En este ejemplo, se indica que se pueden aislar mutantes con mayor contenido de astaxantina a partir de cepas madre que contienen bajo contenido de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona (PF 11-18), mientras que el contenido de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona de la cepa mutante (PF 11-30) permanece bajo.
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Ejemplo 4 Se utiliz una cepa de Phaa rhodozyma, a saber PF 11-36, obtenida despus de la mutagnesis o e e de la cepa PF 11-12, que conten un alto nivel de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona respecto a de astaxantina, para aislar cepas con una baja relacin de contenido de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,o caroten-4-ona. Un cultivo de 100 ml se hizo crecer en medio sinttico en un matraz de 500 ml de capacidad e (con pantallas protectoras) durante 65 horas en una incubadora agitada (250 rpm, 20C). El cultivo se centrifug (4000 rpm, 10 minutos) y se suspendi en 25 ml de tampn Tris (100 mM, pH 7,5). La densidad o o o de clulas de la suspensin se ajust a 108/ml. Subsiguientemente, se a adi 1 ml de NTG 10 mM en e o o n o tampn acetato 100 mM, pH 4,3, a 10 ml de la suspensin de clulas. A intervalos apropiados, se retiraron o o e muestras y se diluyeron con tampn Tris 0,1 M, pH 7,5. Las clulas se lavaron tres veces en medio salino o e siolgico y se cultivaron en placas sobre medio de agar de biomalta para evaluar la supervivencia. Una o e a parte de la dilucin se congel en glicerol al 10 % (-80 C). Despus de determinar la muestra que conten o o 10 % de supervivencia, diluciones apropiadas de la muestra congelada se cultivaron en placa en el agar de medio sinttico (100-500) colonias/placa de 9,1 cm). Despus de 4-6 semanas de incubacin (20 C), e e o se seleccionaron a simple vista colonias de color anaranjado y se ensayaron en experimentos de matraces agitados como se ha descrito anteriormente. En la Tabla 4, se presentan los contenidos de astaxantina y las relaciones de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona de las diversas cepas aisladas de Phaa rhodozyma PF 11-36. Estos resultados indican claramente que por seleccin del color, se pueden elegir mutantes con niveles o de astaxantina comparables a los de la cepa madre. Estas cepas contienen altos niveles de astaxantina pero la relacin de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona se ha reducido fuertemente con respecto o a la cantidad de astaxantina.
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TABLA 4 Contenidos de astaxantina y relaciones de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona de las diversas cepas aisladas de Phaa rhodozyma PF 11-36.

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Cepa

Contenido de astaxantina (g/g DWT) 2.303 1.545 542 1.104 916 643 852 899 1.795 521

Relacin de 3-hidroxi-3,4o dideshidro-,-caroten-4-ona 0,14 0,05 0,05 0,07 0,08 0,06 0,05 0,07 0,07 0,06

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Phaa rhodozyma PF 11-36 Phaa rhodozyma PF 11-36-13 Phaa rhodozyma PF 11-36-15

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Phaa rhodozyma PF 11-36-17 Phaa rhodozyma PF 11-36-27

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Phaa rhodozyma PF 11-36-47 Phaa rhodozyma PF 11-36-113

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Phaa rhodozyma PF 11-36-123 Phaa rhodozyma PF 11-36-240

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Phaa rhodozyma PF 11-36-263

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TABLA 4 (Cont.) Cepa
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Contenido de astaxantina (g/g DWT) 1.200 2.205 2.180 931 970 1.580 1.408

Relacin de 3-hidroxi-3,4o dideshidro-,-caroten-4-ona 0,09 0,02 0,07 0,04 0,03 0,01 0,03

Phaa rhodozyma PF 11-36-422

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Phaa rhodozyma PF 11-36-489 Phaa rhodozyma PF 11-36-500 Phaa rhodozyma PF 11-36-653

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Phaa rhodozyma PF 11-36-672 Phaa rhodozyma PF 11-36-678

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Phaa rhodozyma PF 11-36-696

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La relacin de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona se dene como la relacin del contenido o o de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona y del contenido de astaxantina ms el contenido de a 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona.

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REIVINDICACIONES 1. Una cepa de Phaa rhodozyma que tiene una concentracin intracelular de al menos 852 g de o astaxantina por g de peso seco y un porcentaje de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona respecto de la cantidad de astaxantina menor que 10 %. 2. Una cepa de Phaa rhodozyma seg n la seg n la reivindicacin 1, que tiene una concentracin de u u o o astaxantina intracelular de ms de 1500 g por gramo de peso seco. a
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3. Una cepa de Phaa rhodozyma seg n la reivindicacin 1, que tiene un porcentaje de 3-hidroxiu o 3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona, con respecto a la cantidad de astaxantina, inferior a 5 %, ms prefea riblemente inferior a 2 %, incluso ms preferiblemente inferior a 1 %. a 4. Una cepa de Phaa rhodozyma seg n la reivindicacin 1 o 2, obtenida por mutagnesis. u o e

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5. Una cepa de Phaa rhodozyma seg n una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la cantidad de u carotenoides se ha determinado por HPLC despus de la extraccin con acetona. e o 6. Una dieta o un pienso para animales, que comprende clulas o porciones de clulas de Phaa rhoe e dozyma que contienen astaxantina en una cantidad de al menos 852 g/g de peso seco de levadura y una concentracin de 3-hidroxi-3,4-dideshidro-,-caroten-4-ona inferior a 10 %, preferiblemente inferior a o 5 %, ms preferiblemente inferior a 2 %, incluso ms preferiblemente inferior a 1 % con respecto al nivel a a de astaxantina. 7. Un mtodo para formular un pienso o una dieta, en el que se utilizan clulas o porciones de clulas e e e de una cepa de Phaa rhodozyma seg n una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. u 8. Un mtodo para producir astaxantina, que comprende la etapa de hacer crecer una cepa de Phaa e rhodozyma seg n una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y, opcionalm reivindicacin 1, que tiene u o una concentracin de astaxantina intracelular de ms de 1500 g por gramo de peso seco. o a

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposicin Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la o aplicacin del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a o Espaa y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirn ningn efecto en Espaa en n a u n la medida en que coneran proteccin a productos qu o micos y farmacuticos como e tales. Esta informacin no prejuzga que la patente est o no inclu en la mencionada o e da reserva.

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