UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS DEPARTAMENTO DE QUMICA FARMACOLGICA Y TOXICOLGICA LABORATORIO DE PRODUCTOS NATURALES

DESARROLLO DE UN PRODUCTO DERMATOLGICO A PARTIR DE UN EXTRACTO ESTANDARIZADO OBTENIDO DESDE LAS HOJAS DE UGNI MOLINAE TURCZ.
MEMORIA PARA OPTAR AL TTULO DE QUMICO FARMACUTICO NICOLS RODRIGO PEREDO SANDOVAL PROFESORA PATROCINANTE PROF. EDDA COSTA C. DIRECTORES DE MEMORIA PROF. CARLA DELPORTE V. PROF. OLOSMIRA CORREA B.
SANTIAGO DE CHILE 2008

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TABLA DE CONTENIDO

Contenido Resumen Summary Captulo I 1.1 Introduccin. Captulo II Antecedentes Generales. 2.1 Clasificacin taxonmica. 2.2 Descripcin botnica. 2.3 Distribucin geogrfica. 2.4 Usos en la medicina popular. 2.5 Otros usos. 2.6. Estudios qumicos anteriores. 2.7 Estudios farmacolgicos in vivo anteriores. 2.8 Estudios farmacolgicos in vitro anteriores. Captulo III 2.1 Hiptesis. Captulo IV 3.1 Objetivo general.

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3.2 Objetivos especficos. Captulo V Materiales y mtodos. 5.1 Recoleccin. 5.2 Obtencin de los extractos. 5.3 Estandarizacin qumica del EAE. 5.4 Evaluacin de la actividad antimicrobiana de cido coroslico y cido alfitlico aisladas desde EAE, usando el mtodo de bioautografa. 5.5 Desarrollo de formulaciones. 5.5.1 Estudio de solubilidad de EAE. 5.5.2 Diseo de formulacin de emulsin. 5.5.3 Diseo de formulacin de emulsin gel. 5.6 Estudios in vivo. 5.6.1 Aspectos ticos a considerar para el trabajo con animales. 5.6.2 Determinacin de la actividad antiinflamatoria tpica. 5.6.3 Estudio de irritacin drmica en conejos. Captulo VI Resultados. 6.1 Obtencin de los extractos. 6.2 Estandarizacin qumica del EAE. 6.3 Bioautografa de cido coroslico y cido alfitlico. 6.4 Desarrollo de las formulaciones. -4-

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6.4.1 Estudio de solubilidad del EAE. 6.4.2 Diseo de formulacin de emulsin. 6.4.3 Diseo de formulacin de emulsin gel. 6.5 Estudio de actividad antiinflamatoria tpica. 6.6 Estudio de irritacin drmica en conejos . Captulo VII 7.1 Discusin. 7.2 Conclusiones. Captulo VIII Bibliografa.

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NDICE DE TABLAS
Pgina Tabla 1: microorganismos utilizados para todas las pruebas microbiolgicas. Tabla 2: secado de hojas frescas de murtilla. Tabla 3: rendimiento extractivo con solventes. Tabla 4: resultados de la actividad de cido coroslico contra el crecimiento microbiolgico. Tabla 5: resultados de la actividad de cido alfitlico contra el crecimiento microbiolgico. Tabla 6: solubilidad por gramo de extracto acetato de etilo. Tabla 7: formulaciones F1 hasta F5. Tabla 8: formulacin F7. Tabla 9: formulaciones F8 hasta F12. Tabla 10: formulaciones G1 hasta G12. Tabla 11: formulaciones G13 hasta G17. Tabla 12: formulaciones G18 hasta G30. 32 35 36 37 38 40 42 43 31 21 29 29

Tabla 13: contenido de cido asitico y cido coroslico del EAE obtenido desde hojas recolectadas en diferentes zonas geogrficas y en distinta pocas 46

Tabla 14: actividad antiinflamatoria tpica del EAE obtenido desde hojas recolectadas en julio y sus formulaciones, comparadas con el EAE obtenido desde hojas recolectadas en abril Tabla 15: resultados de la prueba de irritacin drmica en conejos. 46 47

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NDICE DE FIGURAS
Pgina Figura 1: flores, frutos y hojas de murtilla. Figura 2: cromatograma de la elucin de cido asitico. Figura 3: cromatograma de la elucin de cido coroslico. 14 30 30

Figura 4: bioautografa de Klebsiella pneumoniae en placa de cido coroslico. 32 Figura 5: bioautografa de Bacillus subtilis en placa de cido alfitlico. Figura 6: bioautografa de Escherichia coli en placa de cido alfitlico. 33 34

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NDICE DE ANEXOS
Anexo I Materias primas utilizadas en la formulacin de productos dermatolgicos. Anexo II Mtodo de manufactura de los productos dermatolgicos. Anexo III Formulacin de controles de productos dermatolgicos. Anexo IV Ensayo de irritacin drmica: Interpretacin y clculo de resultados. Anexo V 69 67 66 62 56

Tablas estadsticas de la evaluacin de la actividad antiinflamatoria frente a TPA. Anexo VI 72

Presentacin en primer simposio de farmacologa de productos naturales y BLACPMA.

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ABREVIATURAS
AA: cido araquidnico. EAE: extracto acetato de etilo. EDCM: extracto diclorometano. EH: extracto hexano. ED50: dosis eficaz 50%. MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide m.s.n.m: metros sobre el nivel del mar. PII: primary irritation index. RMN: resonancia magntica nuclear. TPA: 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato. U.V.: ultravioleta.

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RESUMEN
Ugni molinae Turcz. de nombre comn murtilla, es una especie endmica de la zona comprendida entre la VII y la X Regin de Chile, donde crece especialmente en la Cordillera de la Costa y en la Precordillera, en terrenos de pobre nutricin, poco aptos para el cultivo de otras especies. De su planta se aprovecha el fruto, el cual es comestible. Las hojas de murtilla fueron usadas por los pueblos primigenios para curar heridas y mejorar la piel deteriorada. En los estudios que se realizaron sobre las hojas de esta planta, se demostr que estas propiedades farmacolgicas se deben a la presencia de triterpenos y de flavonoides. Entre los triterpenos figura el cido asitico, el cido coroslico, y el cido alfitlico. Las acciones farmacolgicas demostradas abarcan efectos analgsicos, antiinflamatorios, antimicrobianos y cicatrizantes. Se evaluaron el cido alfitlico y el cido coroslico en pruebas microbiolgicas, en donde se comprob la actividad inhibitoria en el crecimiento de Escherichia coli y Bacillus subtilis por el primero, e inhibicin de Klebsiella pneumoniae por el segundo. Basndose en estos postulados demostrados, se desarrollaron varias formulaciones dermatolgicas en base a un extracto acetato de etilo, estandarizado qumicamente en cido asitico y cido coroslico, de las cuales se eligieron dos formulaciones que tienen buenas propiedades de estabilidad fsicas. Estas formulaciones se ensayaron in vivo en un estudio de inflamacin aguda en orejas de ratn, dando resultados satisfactorios. Estas mismas formulaciones se ensayaron en piel de conejo, en donde se comprob que las formulaciones dermatolgicas no son irritantes para la piel.

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SUMMARY: DEVELOPMENT OF A DERMATOLOGIC PRODUCT FROM A STANDARDIZED EXTRACT, OBTAINED FROM LEAVES OF UGNI MOLINAE TURCZ.
Ugni molinae Turcz., the common name is murtilla, is an endemic specie of the zone between the VII and X Region of Chile, where it grows- specially in the Cordillera de la Costa and the Precordillera, in lands of poor nutrition, unsuitable for growing to other species. From its plants the fruit is used, wich is eatable. The murtillass leaves were used by native people to heal wounds and improve the damaged skin. In the realized studies about the leaves of this plant, it was demonstrated that these pharnacological properties are due to the presence of triterpenes and flavonoids. Among the triterpenes figures the asiatic acid, corosolic acid, and the alfitolic acid. The pharmacological demonstrated actions include analgesic effects, antiinflamatory, antimicrobial, and scar healing. It was evaluated the alfitolic and corosolic acid in microbiological tests, where it was confirmed the inhibitory action of the growing of Escherichia coli and Bacillus subtilis by the first acid, and inhibition of Klebsiella pneumoniae by the second acid. Based on the demonstrated postulates, it was developed various dermatological formulations with an extract of ethyl acetate basis, chemical standardized in asiatic and corosolic acid, of wich are chosen two formulations that have good properties of physical stability. These formulations were tested in vivo in a study of acute inflammation in mouse ears, giving satisfactory results. These same formulations were tested in rabbit skin, where established that the dermatological formulations are not irritating to the skin.

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Captulo I
1.1 Introduccin
La defensa de nuestro patrimonio cultural y nuestro acervo gentico debe realizarse en forma activa, ya que la mejor manera de conocer y guardar nuestros recursos es utilizndolos, a travs de la investigacin cientfica para conocer en profundidad los detalles de cada especie, y los potenciales beneficios que nos pueda otorgar, creando nuevos elementos basados en aquellas especies que ya han sido investigadas y a las cuales efectivamente se les ha encontrado un potencial de uso, llegando finalmente a la valoracin prctica de una especie en su uso por parte de toda la sociedad, que al ver el nuevo beneficio adquirido pondr mayor vigor en apreciarlo. La ciencia farmacutica que basa su accionar en productos naturales, debe poner atencin a las voces de los pueblos ancestrales que han convivido por cientos de aos en contacto con estas especies, y que ellos observando el actuar de la naturaleza han aprendido a utilizarlas. Queda entonces por demostrar y avalar en una base cientfica el uso que hasta ese momento se le vena dando a determinada planta, y si es posible mejorar su accin, a travs de una seleccin adecuada de los genes, de la seleccin de la mejor poca de recoleccin, seleccionando la parte adecuada de la planta, y optimizando su accin usando tecnologa adecuada, entre otros. El estudio completo de una especie y su manera en que sta puede utilizarse, requiere un manejo transversal de distintas profesiones, las que complementndose entre s, pueden dar como fruto un trabajo integral. Los estudios realizados con el extracto de acetato de etilo obtenido desde las hojas recolectadas en el mes de abril, de Ugni molinae, Myrtaceae, de nombre vulgar, murtilla; por el grupo de investigacin del laboratorio de productos naturales de la facultad, demuestran que esta especie presenta actividades antiinflamatoria y analgsica, ambas por va tpica, adems de actividad antimicrobiana y cicatrizante, atribuible a varios principios activos, principalmente triterpenos, destacando entre ellos el cido asitico(Aguirre et al., 2006). Basndose en estos estudios, en esta memoria se desarrollar un producto dermatolgico de carcter antiinflamatorio en base a hojas de murtilla y se determinar la variacin estacional de los principios activos.

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Captulo II

Antecedentes Generales
2.1 Clasificacin Taxonmica (Montenegro, 2000)
Nombre cientfico Sinonimias Nombres vulgares : Ugni molinae Turcz. : Myrtus ugni Mol., Eugenia ugni Hook.et Arn. : murta, murtilla, ui o (voz mapuche), chilean guava

(ingls), chilean cranberry (ingls). Familia Orden Clase Divisin : Myrtaceae. : Myrtales. : Magnoliopsida. : Magnoliophyta.

2.2 Descripcin Botnica

Es un arbusto perenne, de diverso tamao segn la humedad del terreno, puede alcanzar hasta los dos metros de altura. Las hojas son muy brillantes y de un tono verde oscuro en su epidermis superior y un tono de verde ms claro en su epidermis inferior. Son pecioladas, opuestas, sin estpulas, de forma aovada oblonga y con el pice agudo, de unos 2 a 2,5 cm. En la cara inferior del limbo foliar se pueden apreciar las glndulas presentes. Las flores son de color rosado blanquecino y nacen en las axilas de las hojas. Presentan pednculos largos y tienen forma de campana. Son solitarias y hermafroditas. Tienen 5 spalos, unidos por la base y doblados hacia fuera formando un cliz rojizo gamospalo que contrasta con el color plido de los ptalos. La corola est compuesta por 5 ptalos, estambres numerosos y de un largo menor que el estilo. Florece entre los meses de - 13 -

noviembre y diciembre. Su fruto de agradable sabor y aroma, es una baya de colores blanquecinos, rojos, y rosadas, con la caracterstica de llevar 5 ptalos apegados en el pice (Montenegro, 2000). Figura 1: flores, frutos y hojas de murtilla.

2.3 Distribucin geogrfica

Se desarrolla en forma silvestre en el sur de Chile, se distribuye entre la VII y X Regin, especialmente en la Cordillera de la Costa y parte de la Precordillera Andina. En cuanto a sus requerimientos, esta especie se adapta a suelos marginales, lo que implica terrenos de baja fertilidad, pero con buen drenaje, con pH del suelo entre 5,6 y 6,0 (Seguel y Avendao, 2001). La murtilla crece habitualmente en terrenos despejados, en bordes de ros, formando parte del matorral. En la parte norte de su rea de dispersin habita principalmente en la cordillera de la costa formando parte del bosque maulino. Ms hacia el sur y hacia el interior del territorio forma parte de la densa formacin arbustiva que crece a orillas de los bosques (Montenegro, 2000).

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2.4 Usos en la medicina popular

En la medicina popular se le atribuyen propiedades aromticas, estimulantes, y astringentes (Muoz et al., 1981). La infusin de sus hojas se emplea para suavizar el cutis reseco y aumentar la elasticidad de la piel. La infusin de sus ramas se usa para aliviar dolencias de las vas urinarias (Montenegro, 2000).

2.5 Otros usos

Debido a las propiedades organolpticas de los frutos de murtilla, se utilizan tambin en los preparados de tipo alimentarios como mermeladas, licores y repostera en general (Montenegro, 2000).

2.6 Estudios qumicos anteriores

En los estudios previos realizados a las hojas de murtilla recolectadas en abril, se han aislado e identificado mediante tcnicas espectroscpicas los siguientes compuestos: Del extracto diclorometano purificado se aislaron, purificaron e identificaron mediante tcnicas espectroscpicas: cido oleanlico, cido urslico, cido alfitlico y cido coroslico (Aguirre et al., 2006). Del extracto acetato de etilo se han encontrado molculas con grupos qumicos polifenlicos como flavonoides, cumarinas, taninos, y cidos fenlicos como cido glico y catequina. Se aisl, e identific por mtodos espectroscpicos el cido asitico. Tambin se identific cido alfitlico y cido coroslico (Aguirre et al., 2006). Del extracto metanol se han encontrado molculas con grupos qumicos polifenlicos como flavonoides, cumarinas, taninos, y cidos fenlicos como cido glico y catequina. Hetersidos de los flavonoides miricetina, canferol y quercetina. Se vio la presencia de cido coroslico y de cido asitico (Aguirre et al., 2006). - 15 -

2.7 Estudios farmacolgicos in vivo anteriores

El grupo de investigadores del laboratorio de productos naturales demostr que distintos extractos y compuestos aislados desde las hojas de Ugni molinae recolectadas en abril, presentan efectos antiinflamatorios tpicos frente a cido araquidnico (AA) y tetradecanoilforbol acetato (TPA) (Aguirre et al., 2006); y efectos analgsicos frente a diferentes modelos in vivo (Delporte et al., 2007). El cido asitico exhibi un efecto dosis dependiente frente a la inflamacin inducida por TPA con un efecto mximo de 92,5 2 % (Delporte et al., 2007).

2.8 Estudios farmacolgicos in vitro anteriores

Los estudios in vitro realizados en las hojas de Ugni molinae recolectadas en abril (Aguirre et al., 2006) evidencian una alta actividad antioxidante de los extractos ms polares: extracto acetato de etilo, extracto metanol, extracto metanol/agua e infuso, los cuales se ha encontrado que estn constituidos principalmente por compuestos polifenlicos (flavonoides y taninos), que presentan la capacidad de atrapar radicales libres y quelar metales (Pietta, 2000). El EAE obtenido desde las hojas recolectadas en julio, mostr buenos resultados en cuanto a estimular la velocidad de proliferacin, mejorar la capacidad migratoria y el depsito de colgeno tipo I en la matriz extracelular de fibroblastos de piel humana, en ensayos realizados in vitro (Lobos, 2006).

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Captulo III

3.1 Hiptesis
El producto dermatolgico desarrollado a partir del extracto acetato de etilo desde las hojas de Ugni molinae es eficaz como antiinflamatorio.

El contenido de principios activos de las hojas de murtilla, vara de acuerdo con la poca de recoleccin.

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Captulo IV

4.1 Objetivo General

Desarrollar un producto dermatolgico a partir de un extracto de acetato de etilo estandarizado obtenido desde las hojas de murtilla recolectadas en julio del ao 2005, y evaluar su eficacia como agente antiinflamatorio e inocuidad al ser aplicado en piel.

4.2 Objetivos Especficos

Obtener desde las hojas recolectadas en julio del ao 2005, un extracto con acetato de etilo (EAE). Estandarizar qumica y farmacolgicamente el EAE. Determinar la variacin estacional de los principios activos de los EAE obtenidos con hojas recolectadas en abril y julio. Evaluar los efectos antimicrobianos de los cidos coroslico y alfitlico, presentes en el EAE. Desarrollar distintas formulaciones dermatolgicas en base al EAE. Seleccionar la formulacin que solubilice el EAE en forma ptima y que sea ms estable desde el punto de vista fisicoqumico. Evaluar la capacidad antiinflamatoria tpica de las formulaciones dermatolgicas seleccionadas. Evaluar la capacidad irritante de la piel de las formulaciones dermatolgicas seleccionadas.

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Captulo V

Materiales y mtodos
5.1 Recoleccin
La parte area de murtilla fue recolectada en julio del ao 2005 en Carillanca (3841 latitud sur, 7038 longitud oeste, 200 m s. n. m.), localidad que se ubica en la IX Regin, en las cercanas de Temuco. La recoleccin e identificacin fue realizada por la biloga Ivette Seguel. Se guard un testigo numerado como SQF- 22260 en el Herbario de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas.

5.2 Obtencin de los extractos

El material vegetal se recibi fresco, por lo que se procedi a secar en una corriente de aire a temperatura ambiente. Posteriormente se separaron las hojas. Estas hojas secas fueron molidas en un molino de martillo. Este material vegetal particulado fue extrado hasta agotamiento con disolventes de polaridad creciente en extractores de acero inoxidable de 90 L. Se inici la extraccin seriada con el disolvente menos polar, hexano (EH). El extracto obtenido se concentr y se llev a sequedad. A continuacin se procedi de la misma manera para obtener el extracto de diclorometano (EDCM) y de acetato de etilo (EAE). Todos los extractos secos fueron pesados para determinar el rendimiento. El extracto seco obtenido como producto de la maceracin con acetato de etilo, fue de inters para el desarrollo de un producto dermatolgico. Para poder tener homogeneidad en el tamao de partcula del EAE pulverizado, ste fue molido en equipo Ultraturrex a 24000 rpm, y luego se tamiz por tamiz Mesh 60, obteniendo partculas con un tamao menor a 250 m.

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5.3 Estandarizacin qumica del EAE

Debido a la significativa actividad antiinflamatoria, analgsica y cicatrizante, demostrada para el EAE en los estudios previos, y su buen rendimiento, este extracto fue seleccionado para el desarrollo de un producto dermatolgico. Con este fin fue necesario estandarizarlo qumicamente. El contenido de los triterpenos, cido asitico y cido coroslico, se determin por HPLC, siguiendo la metodologa establecida por Aguirre et al (2006). Las condiciones cromatogrficas fueron: columna Genesys (Inertsil ODS-3, 5 mm, 250 x 4,6 mm i.d.),fase mvil: acetonitrilo:agua (H3PO4 0,1 % v/v) = 60:40, flujo 0,7 mL/min, deteccin a 201 nm en un equipo HPLC Waters 600 con detector fotodiodo Waters 996.

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5.4 Evaluacin de la actividad antimicrobiana de cido coroslico y cido alfitlico aislados desde EAE, usando el mtodo de bioautografa
Con este bioensayo se evalu la capacidad antimicrobiana y antifngica de dos molculas, aisladas desde EAE, estas son cido coroslico y cido alfitlico, dichas molculas fueron aisladas y confirmadas sus identidades por RMN.(Aguirre et al., 2006). Los microorganismos utilizados se encuentran indicados en farmacopea (USP XXII) para la valoracin de antibiticos, obtenidos de American Type Culture Collections. Tabla 1: microorganismos utilizados para todas las pruebas microbiolgicas. Nmero ATCC Bacterias Gram negativas Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Salmonella aviatum Klebsiella pneumoniae Bacterias Gram positivas Staphylococcus aureus Micrococcus flavus Bacillus subtilis ATCC 8739 ATCC 14207 ATCC 12228 Muestra clnica ATCC 6538P ATCC 10290 ATCC 14884 Muestra clnica aislada desde el Hongo Candida albicans laboratorio de microbiologa de la Fac. de Cs. Qcas. Y Farmacuticas, Universidad de Chile. Muestra aislada del ambiente desde el Levadura Saccharomyces cerevisiae laboratorio de microbiologa de la Fac. de Cs. Qcas. y Farmacuticas, Universidad de Chile.

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Los compuestos aislados fueron sembrados en placa de gel de slice 60 (Merck) y la fase mvil usada correspondi a la utilizada para Centella asiatica (n-butanol:acetato de etilo:NH3:H2O, 60:40:5:10). Se prepararon caldos de cultivo de las diferentes cepas, utilizando como medio lquido de cultivo TSB (triptona soy broth) para bacterias y PDB (potatoes dextrose broth) para hongos. Cada microorganismo en estudio fue resuspendido en duplicado mediante un asa de micrn estril en 3 mL de su correspondiente medio segn sea bacteria u hongo, los cuales fueron obtenidos de una siembra de agar inclinado. Las bacterias fueron incubadas a 37 C por 24 horas y los hongos a 28 C por 48 horas. Los cromatogramas fueron expuestos a la luz U.V. ( 254 nm), durante 30 minutos con el fin de esterilizarlos previo a realizar el ensayo. En un tubo estril se adicionaron 350 L de caldo de cultivo de cada microorganismo al cual se agreg 7 mL de agar fundido, TSA (triptone soy agar) para bacterias y PDA (potatoes dextrose agar) para hongos, se homogenizaron en agitador mecnico y esta solucin se dej escurrir sobre los cromatogramas los cuales se encontraban dentro de una cpsula de Petri. Una vez solidificado la solucin sobre la placa, se adicionanron 350 L de agua destilada estril a cada lado con el fin de evitar el resecamiento de las placas. Las placas se dejaron incubar por 24 horas a 37 C para bacterias y por 48 horas a 28 C en el caso de hongos. Transcurrido este tiempo, las placas fueron reveladas con el reactivo MTT, el cual reconoce una deshidrogenasa bacteriana dando una coloracin azul/violeta, se consider por lo tanto, como resultado positivo de actividad antimicrobiana si en la placa se observaba halo de inhibicin, caracterizado por la ausencia de coloracin (Erazo et al., 2002).

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5.5 Desarrollo de formulaciones

El diseo de las formulaciones para productos dermatolgicos se realiz utilizando un 5% de EAE, debido a que en los estudios anteriores se demostr la actividad analgsica a esta concentracin del extracto. Tambin se realizaron formulaciones conteniendo un 3,7% de EAE, que corresponde al ED50 para el estudio analgsico tail flick (Inostroza, 2006). El listado de materias primas utilizadas en el desarrollo de las formulaciones, est detallado en el Anexo I. 5.5.1 Estudio de solubilidad de EAE Este estudio se realiz a 25 C, y con la ayuda de un equipo ultrasnico, para lograr la disolucin del extracto. Se utilizaron los sistemas de disolventes ms comunes en el diseo de medicamentos dermatolgicos: glicerina, polietilenglicol 400, aceite mineral, propilenglicol, etanol y agua. 5.5.2 Diseo de la formulacin de emulsin Esta etapa se inici con el desarrollo de formulaciones clsicas para sistemas emulsionados con emulgentes no inicos y con emulgentes aninicos. Luego se trabaj con emulsiones que contienen siliconas y solubilizantes de alto contenido de xido de etileno. El mtodo de manufactura consisti en emulsionar en caliente, en donde se funden las materias primas de las fases a 70C, y luego se mezclan. El EAE se agreg suspendido en alguna de las materias primas lquidas a temperatura ambiente de la formulacin. Se realiz un estudio preliminar de estabilidad acelerada tipo screening, manteniendo muestras a 40C por 7 das, observando si haba separacin de fases. De esta forma se descartaron los productos que no eran adecuados por su mala estabilidad fsica. Para los productos seleccionados de este ensayo se realiz un estudio de estabilidad de estantera manteniendo las muestras por tres meses a 25C y un estudio de estabilidad manteniendo las muestras a 40C por tres meses. Tambin se midi la viscosidad con un viscosmetro Brookfield RV, aguja nmero 7, a 50 rpm. El pH se midi con un peachmetro.

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5.5.3 Diseo de formulacin de emulsin gel Estas formulaciones comenzaron con el uso de un sistema viscosante como carbomer en agua, las que luego se modifican con otros viscosantes, junto con mejorar su sistema solvente, y la sustancia adecuada para ajustar el pH. Luego se agreg un emulgente con caractersticas solubilizantes, el que tambin se va ajustando segn requerimiento de estabilidad y solubilizacin del EAE. Estas formulaciones se fabricaron a temperatura ambiente, si las materias primas eran lquidas a dicha temperatura, slo se disolva y humectaba el gelificante. Si las materias primas involucradas eran slidas a temperatura ambiente, entonces las formulaciones se fabricaban en caliente, en donde se fundan las materias primas slidas y luego se mezclaban y se emulsionaban. El EAE se agreg suspendido en etanol. Se realiz un estudio prelimininar de estabilidad acelerada tipo screening, manteniendo muestras a 5C por 7 das, observando si haba precipitado ; y muestras a 40C por 7 das observando si haba separacin de fases. De esta forma se descartaron los productos que no eran adecuados por su mala estabilidad fsica. Para los productos seleccionados de este ensayo se realiz un estudio de estabilidad de estantera manteniendo las muestras por tres meses a 25C. Tambin se midi la viscosidad con un viscosmetro Brookfield RV, aguja 7, a velocidad de 50 rpm. El pH se midi con un peachmetro.

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5.6 Estudios in vivo

5.6.1 Aspectos ticos a considerar para el trabajo con animales Los estudios realizados in vivo, se realizaron en dependencias de la Unidad de Pruebas Biolgicas del Instituto de Salud Pblica. En virtud al trato tico y mitigador del dolor de los animales utilizados en esta investigacin, se consideran las Normas Internacionales en Investigacin Biomdicas que involucra el uso de animales. Esta reglamentacin ha sido elaborada por el Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Mdicas en Ginebra (Boletn Oficina Sanitaria Panamericana, 1986), y son aplicadas por la Unidad de Pruebas Biolgicas del Instituto de Salud Pblica de Chile (ISP), lugar donde se desarrollaron las pruebas farmacolgicas. 5.6.2 Determinacin de la actividad antiinflamatoria tpica Para cada ensayo se utilizaron 10 ratones de la cepa CF1, no consanguneos, de sexo masculino, de entre 20 a 25 g de peso y de 30 a 35 das de edad, los cuales fueron mantenidos en ayuno y con agua ad libitum durante 12 horas previo al estudio. De stos diez, dos se dejaron como control, los que fueron agregados al grupo control que qued constituido por un total de 16 animales. Se evalu la capacidad antiinflamatoria del EAE y de las formulaciones seleccionadas G30 y F11 frente a 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), el cual al ser aplicado localmente produce una reaccin inflamatoria aguda caracterizada por aumento de la permeabilidad vascular, edema e influjo celular (Lloret y Moreno, 1995). Una vez determinado el peso de cada ratn, se le aplic la muestra a evaluar en ambas caras de la oreja derecha mientras que en ambas caras de la oreja izquierda se aplic el vehculo de la muestra a evaluar. En seguida se aplic el TPA en ambas caras de la oreja derecha. Se mantuvieron los ratones en sus jaulas por 4,5 horas, finalizado este tiempo los ratones se sacrificaron por dislocacin cervical y con la ayuda de un sacabocado de 6 mm de dimetro, se obtuvieron secciones de idntico tamao de cada oreja del animal, stas se pesaron en una balanza analtica y se registraron sus pesos. - 25 -

La actividad antiinflamatoria tpica de cada extracto se obtuvo comparando el edema alcanzado por el grupo control con el edema de los animales que recibieron la muestra. Por lo tanto, el porcentaje de efecto antiinflamatorio tpico (%EAIT), est dado por la siguiente frmula:

%EAIT = (Pcontrol - Pmuestra) 100 Pcontrol

P control = (OD - OI)controles SEM P control= edema de los animales control SEM = / n

P muestra = (OD - OI)muestra SEM P muestra= edema de los animales tratados

donde corresponde a la desviacin tpica y n es el nmero de animales.

El frmaco de referencia utilizado para evaluar la actividad antiinflamatoria tpica inducida por TPA fue indometacina, que a una dosis de 0,5 mg/20 L provoc un efecto antiinflamatorio mximo de 92,9 % (Aguirre et al, 2006). La cantidad del EAE a ensayar fue de 3 mg disuelto en 20 L de acetona, esta se dividi en dos porciones colocando 10 L por cada lado de la oreja derecha. Para mantener la relacin de cantidad del EAE aplicado, las formulaciones se estudiaron de manera tal de contener 3 mg de EAE al aplicar sobre la oreja del ratn en estudio. En la oreja izquierda se aplic slo el vehculo del EAE. A continuacin y de la misma forma se aplicaron en la oreja derecha, 20 L de una solucin conteniendo 5 g de TPA en acetona; dividida en dos, es decir 10 L para cada lado de la oreja, y en la izquierda se aplic slo acetona. Para evaluar las actividades antiinflamatoria tpica de F11 y G30, ambas fueron aplicadas a la dosis de 0,02 mL en la oreja derecha y en la izquierda se aplic slo el vehculo de las formulaciones, que se encuentra detallado en el Anexo III.

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La significancia de los efectos fue calculada por el mtodo Wilcoxon para datos independientes y fueron considerados estadsticamente significativos con un p 0,05 (Hollander y Wolfe, 1973).

5.7 Estudio de irritacin drmica en conejos

Se realiz de acuerdo a las especificaciones entregadas por la ASTM F 719-81 con algunas modificaciones que se sealan a continuacin. Se seleccionaron 6 conejos angora de sexo femenino que pesaban entre 2 y 2,5 Kg. Cada conejo fue puesto en jaula individual y no hubo restriccin de agua o comida para la realizacin del ensayo. El da de la realizacin del ensayo se rasur con un clipper elctrico el pelaje del lomo de cada conejo. Se traz una lnea con un marcador quirrgico que defini dos lados del lomo. Luego se limpi la zona con una solucin de alcohol al 70%. Un lado del lomo se erosion pasando una aguja suavemente en la piel con la finalidad de romper la continuidad del estrato crneo. El otro lado se mantuvo intacto. Se utilizaron para esta prueba cmaras de aluminio de 20 L de capacidad (Finn Chambers on Scanpor) las cuales constan de 10 cmaras por parche dispuestas en dos columnas de 5 cmaras. Si la sustancia a evaluar es de carcter lquida entonces debe ser adsorbida en pequeos discos de papel filtro para que quede fijo dentro de la cmara y no se vierta su contenido. Si la sustancia es de carcter semislido no es necesario fijarla en ningn soporte anexo y puede ser colocado directamente en el interior de la cmara. Los parches con las cmaras llenas fueron acomodados en el lomo del animal. Despus de 24 horas se hace una observacin en bsqueda de eritema y edema en los lugares de la piel que tuvieron contacto con las cmaras. Se colocan nuevas cmaras llenas de los mismos elementos y se colocan en el mismo lugar del lomo de tal manera que se mantenga la misma zona de la piel en contacto con el mismo elemento. Se hacen otras dos observaciones a las 48 horas del da inicial y a las 72 horas, manteniendo las cmaras en contacto con la piel (Mazzanti y Daniele, 2005). La evaluacin del grado de eritema y edema se realiza segn tabla de puntuacin que utiliza ASTM.

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Se ensaya de esta manera, el control de la formulacin F11, la formulacin F11 (5%EAE), el control de la formulacin G30, la formulacin G30 (5%EAE), y una solucin saturada de 2,7% de EAE en etanol; adems se ensaya un control con cmara vaca. La manera de interpretar y valorar las irritaciones o lesiones que se producen, y el tratamiento aritmtico de estos valores, se encuentra detallado en el anexo IV.

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Captulo VI

Resultados
6.1 Obtencin de los extractos
Tabla 2: secado de hojas frescas de murtilla. Rendimiento Peso de hojas frescas Agua Peso de hojas secas Cantidad 14,4 Kg 7,73 Kg 6,67 Kg Porcentaje de rendimiento 100% 53,7% 46,3 %

Tabla 3: rendimiento extractivo con solventes. Rendimiento EH EDCM EAE Cantidad 115,1 g 202,9 g 412,7 g Porcentaje de rendimiento 1,73% 3,04% 6,19%

Porcentaje de rendimiento en base a hoja seca. De las tablas se deduce que el extracto que se obtiene en mayor porcentaje es el EAE, lo que acompaado al hecho de que contiene una alta cantidad de cido asitico, justifica su estandarizacin qumica y el desarrollo de formulaciones dermatolgicas basadas en este extracto.

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6.2 Estandarizacin qumica del EAE

El anlisis cromatogrfico entrega como resultado que el EAE de la murtilla recolectada en julio del ao 2005, contiene un 5,03% de cido asitico resultado obtenido a los 10,3 minutos; y un 10,2 % de cido coroslico, resultado obtenido a los 35,2 minutos de elucin. Figura 2: cromatograma de la elucin de cido asitico.

Figura 3: cromatograma de la elucin de cido coroslico.

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6.3 Bioautografa de cido coroslico y alfitlico

Los siguientes son los resultados que se encontraron en el estudio microbiolgico acerca de la actividad del cido coroslico y cido alfitlico para inhibir el crecimiento microbiano de los siguientes microorganismos. Tabla 4: resultados de la actividad de cido coroslico contra el crecimiento microbiolgico. Cepa cido coroslico Escherichia. coli

Gram

+ -

Gram

Pseudomonas aeruginosa

Gram

Salmonella aviatum

Gram Gram + Gram + Gram + Hongo Levadura

Klebsiella pneumoniae Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Micrococcus flavus Candida albicans Saccharomyces cereviceae

+ : Indica actividad. Hay halo de inhibicin. - : Indica ausencia de actividad. No hay halo de inhibicin. El cido coroslico slo posee actividad antimicrobiana contra el microorganismo Gram negativo Klebsiella pneumoniae.

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Figura 4 : bioautografa de Klebsiella pneumoniae en placa de cido coroslico.

Tabla 5: resultados de la actividad de cido alfitlico contra el crecimiento microbiolgico. Cepa Gram cido alfitlico +

Escherichia coli

Gram

Pseudomonas aeruginosa

Gram

Salmonella aviatum

Gram Gram +

Klebsiella pneumoniae Bacillus subtilis

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Gram + Gram + Hongo Levadura

Staphylococcus aureus Micrococcus flavus Candida albicans Saccharomyces cereviceae

+ : Indica actividad. Hay halo de inhibicin. - : Indica ausencia de actividad. No hay halo de inhibicin. El cido alfitlico posee actividad antimicrobiana contra el microorganismo Gram negativo Escherichia coli y el microorganismo Gram positivo Bacillus subtilis. Figura 5: bioautografa de Bacillus subtilis en placa de cido alfitlico.

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Figura 6 : bioautografa de Escherichia coli en placa de cido alfitlico.

El ensayo de bioautografa entrega la cualidad de una sustancia de ser inhibitoria en el crecimiento de un microorganismo, pero no puede afirmarse a partir de que concentracin posee aquella actividad, ni si su actividad es por ser bactericida o bacteriosttica.

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6.4 Desarrollo de formulaciones dermatolgicas

6.4.1 Estudio de solubilidad de EAE Tabla 6: solubilidad por gramo de extracto acetato de etilo. Solvente mL requeridos para

solubilizar 1 g de EAE. Glicerina Polietilenglicol 400 Aceite mineral Propilenglicol Etanol Agua 2000 1592 804 104 37 Insoluble

Con estos resultados, se puede apreciar que por si solo, ninguno de los solventes estudiados fue adecuado para disolver un 5% de extracto en forma de polvo. Tambin se puede notar que el principal solvente utilizado en el desarrollo de productos dermatolgicos, el agua, no puede disolver el extracto. Otro tema notable, es que el mejor solvente corresponde a etanol, un buen solvente de uso comn en productos dermatolgicos, pero que en altas concentraciones puede ser irritante a la piel.

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6.4.2 Diseo de formulacin de emulsin Tabla 7: formulaciones F1 hasta F5. Formulacin Materia prima Aceite mineral Petrolato blanco Alcohol cetlico Alcohol estearlico Monoestearato de glicerilo neutro 3 Polisorbato 80 Monooleato de sorbitn Lauril sulfato de sodio Carbomer 940 1% neutro Metilparabeno Propilparabeno Agua Propilenglicol EAE 0,5 0,1 0,2 0,5 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 c.s. c.s. 3 c.s. c.s. 1 1 F1 % 10 5 2 F2 % 10 5 2 10 5 10 F3 % F5 %

c.s.p.100% c.s.p.100% c.s.p.100% c.s.p.100% 5 5 10 5 10 5 10 5

En las formulaciones F1 y F2 se ocuparon emulgentes no inicos, estos productos se separaron a las 24 horas en estufa. La nica diferencia entre F1 y F2, es que esta ltima tiene 5% ms de propilenglicol que F1, que se utiliz para ayudar a incorporar el extracto. - 36 -

En la formulacin F3 se ocup un emulgente aninico, el extracto se agreg en la fase grasa, quedando suspendido. Se realiz una formulacin denominada F4, con idntica frmula a F3, en la que el nico cambio fue que el EAE se agreg en la fase acuosa; en este caso tambin el EAE qued suspendido. Ambas tuvieron una viscosidad muy alta. Con la finalidad de disminuir la viscosidad de la formulacin F3, se realiz la formulacin F5 en la que el extracto se solubiliz en la fase grasa, y una denominada F6 en la que el extracto se solubiliz en la fase acuosa. La viscosidad efectivamente disminuy, pero los steres grasos empleados no fueron adecuados para disolver el extracto, quedando este suspendido. Tabla 8: formulacin F7. Formulacin Materia prima F7 %

Glyceryl stearate y ceteareth-20 y ceteareth-12 y 4,5 cetearyl alcohol y cetyl palmitate Ceteareth-20 Dicaprilil ter EAE Agua 1 5 5 c.s.p.100

Se realiz la formulacin F7, una emulsin de carcter fluido, los resultados indicaron que era mejor en cuanto a la capacidad de disolver el EAE, aunque no logr disolverlo en su totalidad. La escasa viscosidad provocaba que se separaran sus fases en la prueba de estabilidad en estufa. Para ser los primeros resultados con ingredientes polietoxilados, estos son bastante auspiciosos, en cuanto a la capacidad de solubilizar el extracto, y se retomar este tipo de materias primas en las formulaciones de emulsin gel.

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Tabla 9: formulaciones F8 hasta F12. Formulacin F8 F9 F10 F11 F12

Materia prima

Ciclometicona 15 Ciclometicona 10 y dimeticona copoliol Propilenglicol Etanol EAE Glycereth-26 Alcohol estearlico 57 13 5

15 10

10 10

10 12

11 12

50 13 5 7

57 15 5

57 13 5

57 13,3 3,7

En F8, se obtuvo como resultado una microemulsin de baja viscosidad, muy untuosa, con fuerte olor a etanol, de color verde oscuro y con algunas partculas del extracto que an permanecan en suspensin. No era estable en estufa a 40C. En F9 se agreg como solubilizante glycereth-26, pero no mejor la solubilidad del extracto y se mantuvo la baja viscosidad y la separacin de las fases. En la formulacin F10 se agreg un 3% de alcohol estearlico para mejorar la viscosidad y la estabilidad. El resultado es una formulacin en la que se disolvi casi la totalidad del extracto, de buena viscosidad, de buen aspecto y pH.

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En F11 se aument la concentracin del emulgente (ciclometicona/dimeticona copoliol) con lo que se obtuvo una microemulsin de silicona en alcohol que cumpla la estabilidad acelerada y de estantera, en la que el extracto se disolvi completamente en la microemulsin, El producto obtenido tiene buena apariencia, presenta un leve olor a etanol, y al aplicar en la piel, el extracto absorbe rpidamente, dejando una capa oclusiva sobre ella. F12 es similar a F11, variando slo la cantidad de extracto, disminuyndolo de un 5 a un 3,7%, que corresponde al ED50 para el extracto acetato de etilo. Como resultado de este estudio de solubilidad del extracto activo en la formulacin y la estabilidad de las emulsiones, resultaron exitosas las formulaciones F11 conteniendo un 5% de EAE y la formulacin F12 conteniendo un 3,7% de EAE. Debido a estos resultados y tomando en cuenta las consideraciones ticas en el trato a animales de experimentacin, se seleccion la formulacin F11 para el estudio antiinflamatorio y el ensayo de irritacin drmica.

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6.4.3 Diseo de formulacin de emulsin gel Tabla 10: formulaciones G1 hasta G12.

Formulacin Materia prima Carbomer Etanol EAE Agua Propilenglicol NaOH Trietanolamina Polisorbato 80 Glycereth-26

G1 % 1 40 5

G2 % 1 39 5

G3 % 1 35 5

G4 % 1 45 5

G5 % 1 49,5 5

G6 % 1 60 5

G7 % 1 80 5

G8 % 0,75 70 5

G9 % 1 55 5

G10 % 1 60 5

G11 % 1 60 5

G12 % 1 60 5

c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 c.s.p.100 1 c.s. c.s. 5 c.s. 5 c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. c.s. 5 c.s. 10 10 c.s. c.s. 0,5

Ciclometicona y dimeticona copoliol 40

10

En todas las formulaciones de la tabla se us carbomer del tipo Carbopol Ultrez 10. Desde las formulaciones G1, hasta la formulacin G4, se probaron distintas cantidades de etanol y de propilenglicol para disolver el extracto (EAE), pero ste no se disolvi en ninguno de ellos. Neutralizar este sistema con hidrxido de sodio, provoc prdida de la homogeneidad del producto. Desde G5, el neutralizante ocupado fue una solucin de trietanolamina al 20%, la que resolvi levemente el problema que causaba agregar hidrxido de sodio. Se aument la cantidad de etanol en la formulacin con un 60% en G6 y un 80% en G7, pero no se alcanz a disolver totalmente el extracto. Y era dificultoso lograr la dispersin del carbomer. Una disminucin del porcentaje de carbomer como en G8, no aliviaba la dificultad para hidratarlo, y tampoco era capaz de disolver el extracto. En G9 se utiliz la tcnica de dispersar previamente el EAE en un emulgente, como lo es el polisorbato 80, y de esta manera se agreg al sistema, pero la disolucin a pesar de mejorar, no era completa; y al momento de aplicar sobre la piel, dejaba un residuo verdoso, indicando la falta de penetracin del extracto en la piel. Adems la sensacin al aplicar era desagradable. Aumentar la concentracin de polisorbato 80 y de etanol, como se hizo en G10, no mejoraba esta formulacin con respecto a G9. Cambiar el emulgente por glycereth-26, como en G11, o por ciclometicona y dimeticona copoliol, como en G12; no mejoraba tampoco esta formulacin con respecto a G9.

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Tabla 11: formulaciones G13 hasta G17. Formulacin Materia prima Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer Etanol EAE Agua Trietanolamina Polisorbato 80 Polietilenglicol, Lanolina, Lanolina etoxilada 75 5 19,5 c.s 75 5 19 c.s. 70 3,7 25,3 c.s. 70 3,7 30,3 c.s. 5 5 70 3,7 20,3 c.s. G13 % 0,5 G14 % 1 G15 % 1 G16 % 1 G17 % 1

Desde G13 en adelante, se ha ocupado para las formulaciones Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer, del tipo Carbopol 20/20. En G13 se us un 0,5% de Carbopol 20/20, y en G14 un 1% de Carbopol 20/20. En ambas no se disolvi bien el extracto, pero se aument la viscosidad al aumentar la cantidad de Carbopol 20/20. Ante la dificultad de formular al 5%, se formul al 3,7%. G 15 result incapaz de solubilizar un 3,7% de extracto. En G16 se agreg polisorbato 80, pero no logr disolver el polvo. En G17 se cambi el solubilizante por un producto que es una mezcla de polietilenglicol, lanolina y lanolina etoxilada, pero tampoco logr disolver el extracto completamente.

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Tabla 12: formulaciones G18 hasta G30.

Formulacin Materia prima Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer

G18 %

G19 % 1 5

G20 % 1 5

G21 % 1 5

G22 % 1 5

G23 % 1 5

G24 % 1 4,9

G25 % 1 5

G26 % 1 5,5

G27 % 1 4,5

G28 % 1 4,5

G29 % 1

G30 % 1

Glyceryl stearate y ceteareth-20 y 5 ceteareth-12 y cetearyl alcohol y cetyl palmitate Ceteareth-20 Oleth-20 Dicaprilyl ether EAE Etanol Agua 2-amino-2-metil-1-propanol Propilenglicol Metilparabeno Mezcla de diazolidinil urea y metilparabeno y propilparabeno y propilenglicol 5,3 3,7 84,5 1,5

1,5 5,3 3,7 69 14,5 c.s.

4,3 2,5 3,7 69 14,5 c.s.

3 3,8 3,7 69 14,5 c.s.

3 3,8 3,7 64 14,5 c.s. 5

3 3,8 3,7 68 14,5 c.s. 1

2,9 3,7 5 68 14,5 c.s.

1,5 4,5 5,3 5 70 12,2 c.s. 4,3 3,7 70 15,4 c.s. 0,1 4,5 3,7 70,4 15,8 c.s. 0,1 0,5 0,5 0,5 4,5 3,7 70,4 15,4 c.s. 4,5 3,7 70,4 15,4 c.s. 4,5 3,2 5 70,4 15,4 c.s.

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En G18 se prob una mezcla de emulgentes, la solubilidad que se obtuvo del extracto es completa, pero tiene muy baja viscosidad. En G19 se agreg Carbopol 20/20 a la formulacin y se obtuvo una buena disolucin, de buena viscosidad, color verde claro brillante y de rpida absorcin al aplicar en la piel. Tena buena estabilidad a temperatura ambiente y en estufa, pero al mantenerse a 5C, se formaban partculas slidas. Desde G19 en adelante se ocup como neutralizante, 2-amino-2-metil-1-propanol, ms adecuado para neutralizar un sistema de alto contenido de etanol. Al enfriarse la mezcla se formaban partculas slidas de ceteareth-20 y dicaprilil ter. En la formulacin G20 y G21 se cambi la proporcin que hay entre ellos, mantenindose la cantidad total fija. Pero el precipitado se segua formando tanto en G20, como en G21. En G22 se agreg un 5% de propilenglicol a la formulacin obtenida en G21, este producto perdi su capacidad de absorcin en la piel dejando residuos sobre ella, adems el producto perdi cohesin. Se mantuvo el precipitado que se presentaba a bajas temperaturas. En G23 se agreg un 1% de propilenglicol, pero se mantuvieron los mismos resultados. En G24 se aument el porcentaje de extracto a un 5% a la misma formulacin obtenida en G23, pero se obtuvo un producto de mala solubilidad de extracto, y con mala absorcin. En G25, para disminuir el precipitado se disminuy la cantidad de ceteareth-20 a un 1,5%. El producto obtenido tena buena viscosidad, y buena absorcin. Pero no elimin la presencia de precipitado. Para G26 se retir el ceteareth-20 de la formulacin debido a su precipitacin. Incluso as apareci precipitado. En G27 se ha rebajado la cantidad de Emulgade SE PF (Glyceryl stearate y ceteareth20 y ceteareth-12 y cetearyl alcohol y cetyl palmitate), pero se mantuvo el precipitado. En G28 se cambi el sistema preservante por uno lquido como Germaben II, que es una mezcla de diazolidinil urea y metilparabeno y propilparabeno y propilenglicol

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En G29 se cambi el Emulgade SE PF, por oleth-20, puesto que a temperatura ambiente este ltimo es de carcter semislido, por lo tanto presenta menor posibilidad que forme un precipitado en la formulacin. Se obtuvo con esta formulacin un producto que era estable fsicamente en las pruebas de estantera y acelerada y no formaba precipitado a bajas temperaturas; en la que el EAE se disolva completamente en la formulacin. Se prepar G30, con idntica composicin a G29, pero conteniendo un 5% de EAE. Se seleccion esta formulacin para realizar el estudio antiinflamatorio y el ensayo de irritacin drmica.

6.5 Estudio de actividad antiinflamatoria tpica

Los resultados del estudio farmacolgico demostraron que el EAE obtenido desde las hojas recolectadas en julio present una actividad de 65%, G30 exhibi un efecto del 64,1%, y F11, present un efecto del 69,2% de actividad antiinflamatoria. En el ensayo con las formulaciones dermatolgicas se pudo apreciar una actividad similar entre el EAE y la formulacin G30. Para la formulacin F11, la actividad se vio aumentada por el excipiente que pudo promover o facilitar la entrada de los principios activos responsables de la actividad antiinflamatoria. La evaluacin de una posible actividad antiinflamatoria, o la interferencia del vehculo en la experimentacin al crear un film que impidiese la absorcin del agente inflamatorio usado, en este caso TPA, qued resuelto al ver los valores del porcentaje de inflamacin producida por el TPA en los animales controles de G30 y F11. Aunque los valores de los efectos antiinflamatorios obtenidos con el EAE y las formulaciones son menores al frmaco de referencia indometacina, (92,9 %), sus actividades fueron importantes. Se demostr que el EAE a la dosis de 3 mg/oreja obtenido desde las hojas recolectadas en abril present una actividad antiinflamatoria de un 96,7 % (Aguirre et al., 2006). Esta diferencia se pudo deber al cambio estacional de poca de recoleccin de las hojas, y a la diferencia gentica que pueda existir entre dos plantas de la misma especie que se han desarrollado en distintas condiciones ambientales. - 45 -

Tabla 13: contenido de cido asitico y cido coroslico del EAE obtenido desde hojas recolectadas en diferentes zonas geogrficas y en distintas pocas. Chanco 3545S, 7233W, abril 2002 cido asitico cido coroslico Carillanca 3841S, 7038W, julio 2005 cido asitico cido coroslico 50,3 mg/g EAE 102 mg/g EAE 209,8 mg/g EAE 264,2 mg/g EAE

Aguirre et al. (2006) utiliz para su estudio farmacolgico hojas que fueron recolectadas en Chanco, VII Regin en abril, al comienzo del periodo de lluvias y despus de la formacin de los frutos. Como ya se haba sealado en este estudio se utilizaron las hojas de individuos que crecen en Carillanca, IX Regin, en julio, a mitad del perodo de lluvias. Como se puede observar en los resultados presentados en la Tabla 14, la actividad antiinflamatoria del EAE depende del contenido en triterpenos siendo este efecto dosis dependiente. Tabla 14: actividad antiinflamatoria tpica del EAE obtenido desde hojas recolectadas en julio y sus formulaciones, comparadas con el EAE obtenido desde hojas recolectadas en abril Muestra Indometacina EAE Chanco, abril EAE Carillanca, julio Formulacin G30 Formulacin F11 Actividad antiinflamatoria tpica 92,9 % 96,7 % 65,0 % 64,1 % 69,2%

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6.6 Estudio de irritacin drmica en conejos

Tabla 15: resultados de la prueba de irritacin drmica en conejos. Valor abrasin Control vaca) Vehculo crema Crema EAE Vehculo gel 0,6 5% 0 de 0 (cmara 0 Irritacin imperceptible Irritacin imperceptible Irritacin imperceptible Irritacin leve Irritacin imperceptible EAE al 2,7 % en 0,08 etanol Irritacin imperceptible 0,03 0,6 0 0 0 PII, con Interpretacin Valor abrasin 0 Irritacin imperceptible Irritacin imperceptible Irritacin imperceptible Irritacin leve Irritacin imperceptible Irritacin imperceptible PII, sin Interpretacin

Gel al 5% de EAE 0,08

El control constituido por la cmara vaca, no irrit la piel, por lo que cualquier grado de irritacin que pudiese ocurrir no se debi al parche ni a la cmara. El vehculo de F11 no irrit de ninguna manera la piel, siendo este el mejor excipiente debido a la ausencia de irritacin que manifiesta su aplicacin. La formulacin en crema conteniendo un 5% de EAE tampoco fue irritante de la piel. Los resultados del estudio de irritacin producida por el vehculo de G30 mostr que ste es levemente irritante debido probablemente a la alta cantidad de etanol de la formulacin y a que permaneci ocluido dentro de la cmara y adsorbido en la red producida por el gelificante. La misma formulacin pero conteniendo un 5% de EAE disminuy sustantivamente la irritacin confirmando entonces su actividad protectora y antiinflamatoria de la piel.

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Captulo VII
7.1 Discusin
El EAE es un extracto que se obtiene con un buen rendimiento siendo el cido coroslico y el cido asitico sus principales principios activos. La cantidad de EAE as como su enriquecimiento relativo de estas molculas, est condicionada por la poca de recoleccin, y a la variacin fenotpica propia de las especies que crecen en un amplia distribucin geogrfica, como resultado de la adaptacin a un cambio continuo del medio ambiente (Seguel, 2000; Delporte et al., 2006). El aprovechamiento de las hojas de murtilla es una operacin de buena proyeccin econmica, en la que se calcula que a partir de 6 kilos de hojas frescas de alto contenido de triterpenos, se puedan elaborar 8 kilos de una formulacin al 5 % de EAE. Ya se ha demostrado que los preparados dermatolgicos que contienen cido asitico obtenido desde Centella asiatica, la especie donde originalmente se describi la presencia de este triterpeno, tienen propiedades cicatrizantes (Widgerow, 2000). El cido asitico es conocido por su capacidad de estimular la sntesis de colgeno (Brinkhaus et al., 2000). Este efecto es mediado por cambios en la expresin de genes involucrados en la angiognesis y remodelamiento de la matriz extracelular y de genes relacionados con factores de crecimiento (Coldren et al., 2003). El EAE obtenido desde las hojas recolectadas en julio, mostr buenos resultados en cuanto a estimular la velocidad de proliferacin, mejorar la capacidad migratoria y el depsito de colgeno tipo I en la matriz extracelular de fibroblastos de piel humana, en ensayos realizados in vitro (Lobos, 2006). El TPA, induce una respuesta inflamatoria tarda asociada con una marcada infiltracin celular y una elevada sntesis de eicosanoides. La liberacin de los mediadores ocurrira principalmente va lipoxigenasas, adems de inducir la activacin de la xido ntrico sintetasa inducible y del factor nuclear kappa-B. (Lloret y Moreno, 1995; De Young et al., 1989). Por ende los extractos y componentes de las hojas de murtilla podran ejercer su efecto antiinflamatorio tpico inhibiendo las enzimas involucradas en la sntesis de prostaglandinas y leucotrienos. Adems, el efecto antiinflamatorio tambin podra

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deberse a una reduccin en la actividad de los macrfagos y del complemento, o bien a una inhibicin del proceso oxidativo. En el estudio realizado por Aguirre (2006) se demostr que el cido coroslico adems de tener capacidad antinflamatoria por TPA, tiene capacidad antiinflamatoria tpica en el ensayo realizado con cido araquidnico, de la misma magnitud que el frmaco de referencia nimesulida. No as el cido asitico que slo tiene capacidad antiinflamatoria frente a TPA, de similar magnitud que el frmaco de referencia indometacina. La inflamacin producida por cido araquidnico es de corta duracin, caracterizada por una rpida formacin de edema y aumento de la permeabilidad vascular, una marcada sntesis de prostaglandinas (fundamentalmente PGE2), con un mnimo influjo celular, proceso que ocurrira fundamentalmente va ciclooxigenasas (COXs). El cido araquidnico aplicado tpicamente se convierte en PGs y LTs por la COX y LO respectivamente. (Kim et al., 2004). El efecto antiinflamatorio observado en EAE, no se debe estrictamente a la presencia de triterpenos, sino que tambin a los flavonoides y taninos presentes en ellos. Se ha descrito que los flavonoides inhiben la PLA2, COXs, y LOs y de esa manera reducen los eicosanoides. Adems las sustancias antioxidantes reducen la lipoperoxidacin. Si bien no se han identificado las identidades de estos flavonoides, se cree por estudios anteriores que correspondera a hetersidos de flavonoles, en particular de miricetina y quercetina (Rubilar et al., 2006). En este estudio se comprob una actividad antimicrobiana contra el crecimiento de Klebsiella pneumoniae por parte del cido coroslico, y la inhibicin del crecimiento de Escherichia coli y Bacillus subtilis por parte del cido alfitlico. En un estudio anterior (Inostroza, 2005), se demostr que el EAE tiene actividad inhibitoria en el crecimiento de Micrococcus flavus a la concentracin de 200 ug/mL y una inhibicin parcial del crecimiento de Bacillus subtilis a la misma concentracin; en un estudio de siembra radial en placas de Petri. Dentro del mismo trabajo se demostr inhibicin del crecimiento de Bacillus subtilis por EAE, e inhibicin del crecimiento de Escherichia coli por EDCM, en un ensayo de bioautografa.

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Esta memoria confirm que la actividad antimicrobiana contra estas dos ltimas cepas se debe en gran medida al cido alfitlico presente en EAE y en EDCM. Asimismo la actividad inhibitoria del crecimiento de Micrococcus flavus se puede deber a la presencia de cido asitico, como lo confirm el estudio realizado por Inostroza. Luego viene la etapa del diseo del producto dermatolgico, que debe ser capaz de entregar eficientemente el extracto, liberndolo de su base, y este debe penetrar las capas que forman el tejido drmico, para que alcance el tejido blanco y expresen su accin antiinflamatoria y analgsica. Adems, que tambin acte en el rgano de la piel, inhibiendo el crecimiento de microorganismos y regenerndola debido a sus propiedades cicatrizantes y regeneradoras (Lobos, 2006). El vehculo en el cual el extracto activo est contenido, debe tener entonces caractersticas especiales, debido a la naturaleza del mismo. Un extracto seco obtenido por maceracin con acetato de etilo, que tiene caractersticas medianamente polares, y constituido principalmente por molculas de alto peso molecular (cido asitico, cido madecsico, cido coroslico, cido alfitlico, y sus correspondientes glicosilaciones como el asiaticsido). El producto finalmente, debe sus propiedades a la conjugacin de la calidad del vehculo y la actividad del extracto. Siendo su estabilidad qumica, fsica y microbiolgica, su compatibilidad con la piel, la completa solubilidad del extracto en el vehculo, la liberacin del extracto a partir de este, caractersticas bsicas de la exigencia del producto. A los que se aade la rapidez en la absorcin, la agradable sensacin al aplicar, la limpieza de su aplicacin, la ausencia de partculas residuales despus de su aplicacin, la facilidad para extender el producto y finalmente la buena apariencia global del producto, caractersticas deseables. La formulaciones F11 y G30, tienen mtodos de fabricacin sencillas. En F11 no se incluy un agente preservante, puesto que la frmula es anhidra. En la formulacin G30, a pesar de contener suficiente alcohol etlico como para prevenir el crecimiento microbiolgico, se agreg un sistema preservante. La calidad del producto final, depende de las materias primas con las que se trabaje, incluyendo una materia activa de pequeo tamao de partcula, con una cantidad de principios activa conocida, y cuidando la ausencia de los solventes extractivos. Respecto a este ltimo, la normativa

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nacional no establece lmites para disolventes en productos dermatolgicos. La comunidad europea establece en su legislacin (Cosmetic legislations; 1999) una concentracin mxima de un 0,2% de diclorometano como impureza en formulaciones cosmticas. El EAE de este estudio contiene un 0,38% de acetato de etilo. La formulacin F11 de carcter untuoso, tiene la capacidad de mejorar levemente el traspaso de los principios activos antiinflamatorios a travs de la piel, y dejndola al mismo tiempo, con una pelcula suave y protectora sobre ella. Lo que puede ser considerado una buena caracterstica cosmtica; pero tambin un medio de curacin de una herida, que al ocluir la zona injuriada, permite que el agua que libera la herida permanezca en la zona, promoviendo una cicatrizacin ms pronta en la zona daada; lo que sumado a la capacidad antibacteriana del cido coroslico, alfitlico y asitico, da origen a un preparado dermatolgico que acta como buen antiinflamatorio y que podra funcionar como una terapia efectiva en el proceso de cicatrizacin de la piel (Widgerow; 2000. Lobos, 2006).

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7.2 Conclusiones
Conclusiones parciales El EAE obtenido de las hojas de murtilla recolectada en julio del ao 2005 en Carillanca, contiene un 5,03% de cido asitico y un 10,2% de cido coroslico. El contenido de los cidos asitico y coroslico disminuye en las hojas recolectadas en julio, comparadas con las hojas recolectadas en abril. El cido coroslico inhibe el crecimiento del microorganismo Gram negativo Klebsiella pneumoniae, mientras el cido alfitlico inhibe el crecimiento del microorganismo Gram negativo Escherichia coli y del microorganismo Gram positivo Bacillus subtilis, visualizado a travs del bioensayo bioautografa. Los compuestos cido coroslico y cido alfitlico son inactivos contra el crecimiento del hongo Candida albicans y la levadura Sacharomyces cereviceae. Las formulaciones G30 y la F11 son estables en su calidad fisicoqumica en el tiempo. El EAE recolectado en julio del ao 2005 es activo como agente antiinflamatorio tpico. La formulacin G30 mantiene la capacidad antiinflamatoria tpica del EAE. La formulacin F11 aumenta levemente la capacidad antiinflamatoria tpica de EAE. El EAE y las formulaciones G30 y F11 presentan valores de PII que las clasifica como no irritante para la piel. El EAE puede disminuir una leve irritacin en la piel. Conclusin general El producto dermatolgico desarrollado a partir del extracto acetato de etilo (EAE) obtenido desde las hojas de Ugni molinae es eficaz como agente antiinflamatorio. El contenido de principios activos de las hojas de murtilla, vara de acuerdo con la poca de recoleccin.

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Bibliografa
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Anexos
Anexo I

Materias primas utilizadas en la formulacin de productos dermatolgicos

cidos grasos: la siguiente corresponde a una lista en la que se detalla el largo en la cadena de carbonos y sus nombres. C4 C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 C20 C22 C24 C26 butrico caproico caprlico cprico lurico mirstico palmtico, cetlico, hexadeclico, hexadecanoico. esterico, cetilactico, octadecaoleico araqudico behnico. lignocrico certico

Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer: Acrilatos/c10-30 Alquil Alqulico de ligadura cruzada. El trmino Acrylates (acrilatos) se aplica a los copolmeros lineales no entrecruzados que contienen combinaciones de cido acrlico y cido metacrlico, junto con sus steres de metilo, etilo, propilo o butilo. El trmino Crosspolymer (polmero entrecruzado) se aplica a los polmeros distintos del carbomer que tienen enlaces cruzados. Polmero de cido acrlico, fcil de dispersar. Usado para - 56 -

espesar y suspender. Se recomienda para sistemas que contienen electrolitos y surfactantes tanto aninicos como anfotricos. Alcohol cetlico: Hexadecanol, Masa blanca cerosa, con dbil olor propio. Es un factor de consistencia que tiene propiedades estabilizantes, muy adecuado para cremas, ungentos y emulsiones lquidas farmacuticas, as como para preparados en forma de barra. Temperatura de fusin: entre 46 a 49 C. Alcohol estearlico: alcohol n-octadeclico. Masa cerosa, con dbil olor propio. El alcohol estearlico encuentra empleo en la industria cosmtica y farmacutica como agente de consistencia no autoemulsificante, muy adecuado para cremas, ungentos y emulsiones lquidas farmacuticas, as como para preparados en forma de barra empleados en cosmtica decorativa. La cantidad de empleo oscila entre el 1 y el 10%, segn la consistencia deseada. Temperatura de fusin: entre 55 y 57 C. Alcoholes grasos: los alcoholes grasos son insolubles en agua, para conferirle el carcter hidroflico deseado se hace reaccionar con polioxietileno. Normalmente se usan mezclas de ellos (ejemplo: ceteareth-20 ms ceteareth-12) porque as aumenta la capacidad de estabilizar una emulsin. Son buenos detergentes, pero dan una baja formacin de espuma. Ameroxol OE 20: Oleth-20. Corresponde a Oleil alcohol condensado con 20 moles de oxido de etileno. Agente emulsificante O/W no inico y solubilizante. De apariencia pastosa y blanca, y escaso olor. AMP-95: 2-amino-2-metil-1-propanol 95%, y 5% de agua. Amina orgnica con alto poder neutralizante, se ocupa principalmente para la neutralizacin de polmeros acrlicos de tipo Carbomer y Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer. Carbomer: Polmero de cido acrlico entrecruzado con alil teres de pentaeritritol y alil teres de sucrosa. El trmino Carbomer se aplica a los homopolmeros cruzados de cido acrlico de elevado peso molecular. El agente o agentes responsables de los enlaces cruzados se indican en la definicin monogrfica del ingrediente. El carbomer es un importante agente espesante y gelificante, adems de actuar como estabilizador de emulsiones y suspensiones. Se trata de una sustancia muy hidroflica, soluble en agua, alcohol y solventes polares. - 57 -

Sus propiedades como espesante son eficaces en un rango de pH que va desde cinco a diez; pero se ven reducidas por la presencia de electrolitos. Este producto es incompatible con algunos tensioactivos catinicos y algunos polmeros catinicos. Este polmero es resistente al ataque bacteriano, pero no soporta el crecimiento de mohos; por lo que para su conservacin se requieren otros componentes en la formulacin final. Carbopol Ultrez 10 : ver Carbomer. Carbopol ETD 20/20 : ver Acrylates C10/C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer. Ceteareth-12: cetil estearil alcohol + 12 molculas de xido de etileno. Es de carcter slido. Valor de BHL: 13,3. Temperatura de fusin: entre 34 y 37 C. Ceteareth-20: cetil estearil alcohol + 20 molculas de xido de etileno. Sustancia de aspecto slido de color blanco. Se ocupa como emulsificante no inico O/W. Valor de BHL: 15,9. Temperatura de fusin: entre 39 y 42 C. Cetearyl alcohol: mezcla de alcoholes cetlico y estearlico. De aspecto ceroso. Se ocupa como factor de consistencia y estabilizante. Temperatura de fusin: entre 48 y 52 C. Cetiol OE: producto de marca producido por laboratorios Cognis. Ver dicaprilyl ether. Cetyl palmitate: ster de alcoholes grasos saturados de cadena larga y cidos grasos, principalmente ster cetlico del cido palmtico. De aspecto ceroso y blanco. Se usa como factor de consistencia, para corregir la consistencia de una emulsin.Temperatura de fusin: entre 46 a 51 C. Ciclometicona: Bajo este nombre existen distintos compuestos. Todos se caracterizan por ser un anillo con unidad bsica de siloxano. El nmero de unidades puede variar entre tres y seis. Estos compuestos, dan al pelo suavidad y brillo sedoso, son solubles en etanol, alcohol cetlico y disolventes alifticos. Sus funciones en la frmula pueden ser: acondicionador capilar, reductor de la sensacin de pegajosidad, lubricante, proporciona brillo, emoliente, etc.

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Esta silicona tiene un amplio rango de solubilidad, no mancha y es muy voltil (bajo calor de vaporizacin). Dicaprilyl ether: dioctil eter. Aceite casi incoloro y de olor dbil. Provee una sensacin de sequedad, emoliente, repele el agua. Temperatura de fusin: -6,7C. Temperatura de ebullicin: 286 C. Densidad: 0,806 g/mL. Dow Corning 345: ciclometicona. 95% tetrmero cclico. Dow Corning 3225 C: ciclometicona y dimeticona copoliol. Ciclometicona autoemulsionable, se ocupa como emulsificante o coemulsificante. Tambin se ocupa para preparar productos transparentes. En productos para piel reduce la sensacin de pegajosidad. Emulgade SE PF: producto de marca elaborado por laboratorios Cognis. Su nombre INCI es glyceryl stearate y ceteareth-20 y ceteareth-12 y cetearyl alcohol y cetyl palmitate. Sustancia de color blanco amarillento, olor dbil, en forma de pellets. Es una base autoemulsionante. Especial para la preparacin de emulsiones O/W. Eumulgin B2: producto de marca elaborado por laboratorios Cognis.Ver ceteareth-20. Germaben II: preparacin a base de propilenglicol, diazolidinil urea, metilparabeno y propilparabeno, se usa como preservante antimicrobiano. El Germaben II-E es un sistema conservador liquido, transparente con la siguiente composicin: Germall II ( Diazolidinyl urea) 20 % Metilparabeno 10 % Propilparabeno 10 % Propilenglicol 60 % El Germaben II-E constituye un sistema conservador antimicrobiano de amplio espectro que es efectivo contra las bacterias gram-positivas y gram-negativas, levaduras y hongos.

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Es compatible esencialmente con todos los ingredientes cosmticos incluyendo los surfactantes noionicos y las proteinas. El Germaben II-E es un sistema conservador completo, en forma de lquido transparente que ha sido desarrollado especialmente para cremas y lociones cosmticas que contienen ingredientes que tienden a inactivar los parabenos, (ejemplo: emulsificadores no inicos, proteinas, compuestos etoxilados). El mtodo preferido de incorporacin es aadirlo lentamente a la formulacin despus de la emulsificacin y justo antes de la incorporacin del perfume. Glycereth-26: Polyoxyethylene 26 glyceryl ether, Polietilen glicol eter de glicerina con un promedio de 26 moles de xido de etileno aadidos. Se ocupa como emoliente y solubilizante. Glicerina: propanotriol, glicerol. Preparado por hidrlisis de grasas y aceites, de donde se obtienen cidos grasos y glicerol. Glyceryl stearate: monoestarato de glicerina. Sustancia de aspecto ceroso y de olor dbil, se puede encontrar con distinta pureza debido a que el estearato puede venir acompaado de palmitato al formar el ester. Se emplea como factor de consistencia, en emulsiones y tambin en preparados anhidros(barras, supositorios). Es neutro y compatible con la piel.Temperatura de fusin: segn su pureza, entre 53 y 58 C. Tween 20, 60, 80: (Polisorbato 20, 60, 80) serie de emulsionantes y agentes tensoactivos. Son derivados de polioxietileno de steres parciales de cido graso con anhdrido de sorbitn. Esteres de sorbitan polioxiteilenicos Span: esteres de sorbitan. Lauril sulfato de sodio: El lauril sulfato sdico es el tensioactivo aninico por excelencia en cosmtica; sus buenas propiedades detergentes, espumantes, humectantes, dispersantes, as como su resistencia a las durezas del agua incluso a bajas temperaturas y su afinidad con la piel, le permiten estar presente en la mayora de preparaciones para el cuidado e higiene capilar y drmico. Es innumerable la cantidad de variantes de esta sustancia que se pueden encontrar en el mercado, estas pueden variar el contenido en sales, la pureza del alcohol graso del que proviene, la concentracin de materia detergente, aditivos adicionales, etc.

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Una caracterstica que le proporciona una gran versatilidad es su solubilidad en agua y la conservacin del poder espumante a bajas temperaturas; as los champs a base de este compuesto se eliminan de forma fcil enjuagando el cabello. Su dbil olor permite un perfumado fcil y duradero. El lauril sulfato sdico es compatible con casi todas las sustancias detergentes empleadas en cosmtica y con otros tipos de aditivos como azufre, cido saliclico, vitaminas, etc. Su sabor indiferente le permite ser empleado en pastas dentfricas y preparaciones para la higiene oral como espumante. Parabeno: As denominados por ser derivados del cido p-aminobenzoico. Son conservantes de tipo fenlico. Su solubilidad en agua decrece a medida que aumenta el largo de la cadena alilo. Su potencial antimicrobiano aumenta con el largo de la cadena alilo, en donde el butilparabeno es el ms eficiente contra Aspergillus fumigatus. Es comn mezclar un par de ellos en la formulacin, puesto que as se aumenta la capacidad antimicrobiana. Su poder antimicrobiano se ve disminuido en presencia de molculas de tensoactivo, debido a que se compleja con ellas, y su actividad se debe al estado libre de ella. Propilenglicol: Solvente. Lquido incoloro, inodoro, viscoso, higroscpico; de leve olor caracterstico. Densidad entre 1,0350 1,0370. Solulan 75: PEG-75 Lanolina. Lanolina etoxilada. Sustancia cerosa de color amarillo plido. Se ocupa como emoliente, humectante y sobreengrasante.

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Anexo II Mtodo de manufactura de los productos dermatolgicos.

Se detallan los mtodos de produccin para fabricar las formulaciones F11, F12, G29 y G30, que corresponden a aquellas aprobadas por su condicin de estabilidad fsica. F11 Materia prima Ciclometicona Ciclometicona y dimeticona copoliol Alcohol estearlico Propilenglicol EAE Etanol % en peso 10 12 3 57 5 13

F12 Materia prima Ciclometicona Ciclometicona y dimeticona copoliol Alcohol estearlico Propilenglicol EAE Etanol % en peso 11 12 3 57 3,7 13,3

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Para fabricar tanto la formulacin F11, como F12, se procede de la siguiente manera: En un recipiente previamente tarado se coloca la cantidad de ciclometicona, ciclometicona y dimeticona copoliol y el alcohol estearlico. La que se denomina fase A. En otro recipiente, se coloca el propilenglicol, el extracto acetato de etilo y la cantidad de etanol requeridas. La que se denomina fase B. La fase A y la fase B, se calientan lentamente hasta 70 grados Celsius, agitando constantemente la fase A, y disolviendo el extracto en polvo en la fase B. Cuando se ha comprobado la temperatura de las fases, se ha comprobado visualmente que el alcohol estearlico se ha fundido, y que el extracto se ha disuelto mayormente. Se vierte la fase B, sobre la fase A. Se agita con fuerza mediana, a temperatura ambiente. Permitiendo que se enfre lentamente y sin dejar de agitar. Finalmente se comprueba el peso, y se ajusta agregando etanol y agitando hasta homogeneizar.

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G29 Materia prima Oleth-20 Dicaprilil ter Etanol EAE Agua Carbopol 2020 AMP-95 Germaben II % en peso 4,5 4,5 70,4 3,7 15,4 1 1 gota 0,5

G30 Materia prima Oleth-20 Dicaprilil ter Etanol EAE Agua Carbopol 2020 AMP-95 Germaben II % en peso 4,5 3,2 70,4 5 15,4 1 1 gota 0,5

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Para fabricar tanto G29 como G30, se procede de la siguiente manera: Se necesitan 3 recipientes. En un recipiente tarado se agrega la cantidad requerida de oleth-20 y de dicaprilil ter. La que se denomina fase A. En otro recipiente se prepara la que se denomina fase B. Consta de la cantidad requerida de etanol junto con el extracto. En otro recipiente, se prepara la fase C: el gelificante, este se prepara agregando la cantidad que se necesita de Carbopol 20/20, junto con el agua y el Germaben II. Se espera que se humecte y se agita hasta lograr homogeneidad. Cuando estn listas las tres fases, se procede de la siguiente manera. La fase A y la fase B se calientan lentamente hasta 70 grados Celcius, luego la fase B se agrega sobre la fase A. Se agita por un instante hasta lograr homogeneidad. Sobre esta mezcla se agrega la fase C. Se agita vigorosamente, hasta comprobar la completa distribucin del gelificante en la emulsin. Puede ayudarse por medio de un equipo como el Ultraturrex para este objetivo. Cuando se ha comprobado visualmente la homogeneidad y no se observa ningn grumo de gelificante, se agrega el neutralizante AMP-95. En la cantidad necesaria para dar la viscosidad, aproximadamente hasta pH 5,5. El peso se ajusta agregando etanol. Puede ser til que la fase C, se prepare en exceso, manteniendo las proporciones de sus componentes, y que al momento de mezclar con las otras dos fases, se use la cantidad necesaria. Si no se logra distribuir el gelificante en forma fcil en la mezcla, puede calentarse hasta unos 50 grados Celcius y agitar.

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Anexo III Formulacin de controles de productos dermatolgicos.

Los controles que se ocuparon para las pruebas in vivo fueron fabricados con materias primas del mismo nmero de lote de las que se usaron para fabricar las formulaciones conteniendo el extracto; y se trabaj bajo las mismas condiciones de proceso. Control de G30 Materia prima Ameroxol OE20 Cetiol OE Etanol Agua Carbopol 2020 Germaben II AMP-95 Control de F11 Materia prima Ciclometicona Ciclometicona y dimeticona copoliol Alcohol estearlico Propilenglicol Etanol % en peso 10 12 3 59 16 % en peso 4,5 3,2 72,8 17,9 1,1 O,5 c.s.p.

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Anexo IV Ensayo de irritacin drmica: Interpretacin y clculo de resultados.

Visualmente se da un puntaje a la zona que ha estado en contacto con la sustancia a la que se le evala su poder irritativo, segn la siguiente tabla.

Sistema de clasificacin para reacciones en la piel Grado de eritema 0 1 Descripcin No hay eritema Grado de edema 0 Descripcin No hay edema Edema levemente

Eritema levemente 1 perceptible

perceptible bien 2 Edema bien definido por un borde marcado y un leve solevantamiento de piel

Eritema definido

Eritema moderado 3 a severo

Edema piel mm.

moderado, de de

levantamiento

aproximadamente 1

Eritema severo y 4 con formacin de llagas

Edema

severo,

levantamiento de la piel de ms de 1 mm y en toda el rea expuesta.

Se suman los puntajes por cada lado y cada parche en en forma independiente (lado de piel intacto y lado abrasionado), para eritema y edema. De esta manera el mximo de - 67 -

puntaje para cada cmara por da puede ser ocho. Se trata de este modo cada cmara por los tres das consecutivos. Finalmente se suman estos valores y se divide por el nmero de observaciones. Estos resultados se suman y se promedia por el nmero de conejos, obtenindose entonces el valor de ndice de irritacin primaria por sustancia evaluada en piel normal y abrasionada.

Categoras de irritacin en piel de conejo Valor de P I I 0-0,4 O,5-1,9 2-4,9 5-8 Categora Irritacin imperceptible Irritacin leve Irritacin moderada Irritacin severa

Donde PII es primary irritation index.

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Anexo V Tablas estadsticas de la evaluacin de la actividad antiinflamtoria frente a TPA

Evaluacin actividad antiinflamatoria tpica frente a TPA : Extracto estandarizado murtilla Dosis: 3 mg/ 20 uL/ oreja en acetona Fecha: 28/07/2006

MUESTRA Ratn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 n promedio mediana Desv. Std SEM W % E con promedio % E CON MEDIANA mediana de controles mediana de muestra % E FINAL CON 63,9 65,0 0,0102 0,0036 65,0 z= p= -3,40 0,0003 8 0,0130 0,0137 0,0021 0,0007 8 0,0102 0,0101 0,0014 0,0005 8 0,0037 0,0036 0,0021 0,0008 8 38,9 37,0 25,9 9,2 8 63,3 65,0 21,2 7,5 44,5 M O.derecha 0,0110 0,0127 0,0111 0,0155 0,0131 0,0143 0,0155 0,0165 O izquierda 0,0099 0,011 0,0083 0,0124 0,0091 0,0102 0,0105 0,0085 (Od-Oi) 0,0011 0,0017 0,0028 0,0031 0,0040 0,0041 0,0050 0,0080 % INF 11,1 15,5 33,7 25,0 44,0 40,2 47,6 94,1 % EAI 89,2 83,3 72,4 69,5 60,6 59,6 50,7 21,2 Ranking 1,0 2,0 3,0 4,0 6,0 7,0 8,5 13,0 O derecha 0,0119 0,0129 0,0131 0,0147 0,0145 0,0168 0,0168 0,0179 0,0181 0,0189 0,0210 0,0217 0,0239 0,0221 0,0264 0,0272 16 0,0186 0,0180 0,0047 0,0012

CONTROLES O izquierda 0,0085 0,0079 0,0069 0,0078 0,0075 0,0086 0,0074 0,0078 0,0079 0,0086 0,0106 0,0075 0,0097 0,0073 0,0093 0,0096 16 0,0083 0,0079 0,0010 0,0003 (Od-Oi) 0,0034 0,0050 0,0062 0,0069 0,0070 0,0082 0,0094 0,0101 0,0102 0,0103 0,0104 0,0142 0,0142 0,0148 0,0171 0,0176 16 0,0103 0,0102 0,0042 0,0011 % Inflam. 40,0 63,3 89,9 88,5 93,3 95,3 127,0 129,5 129,1 119,8 98,1 189,3 146,4 202,7 183,9 183,3 16 123,7 123,4 47,4 11,9 Ranking 5 8,5 10 11 12 14 15 16 17 18 19 20,5 20,5 22 23 24

Z = w-[n(m+n+1)/2]/RAIZ[m*n(m+n+1)/12]

MEDIANA

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Evaluacin actividad antiinflamatoria tpica frente a TPA: gel de extracto estandarizado murtilla 5% Dosis: 80 uL/oreja del gel MUESTRA Ratn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 n promedio mediana Desv. Std SEM W % E con promedio % E CON MEDIANA mediana de controles mediana de muestra % E FINAL CON MEDIANA z= p= -3,18 0,0007 60,5 64,1 0,0098 0,0035 64,1 8 0,0102 0,0108 0,0029 0,0010 8 0,0076 0,0075 0,0005 0,0002 8 0,0041 0,0035 0,0031 0,0011 8 55,6 47,0 42,0 14,9 8 57,7 64,1 31,7 11,2 48,0 M O.derecha 0,0089 0,0095 0,0100 0,011 0,0109 0,0107 0,0153 0,0172 O izquierda 0,0082 0,0082 0,0071 0,0075 0,0074 0,0069 0,0080 0,0072 (Od-Oi) 0,0007 0,0013 0,0029 0,0035 0,0035 0,0038 0,0073 0,0100 % INF 8,5 15,9 40,8 46,7 47,3 55,1 91,3 138,9 % EAI 92,8 86,7 70,3 64,1 64,1 61,0 25,1 -2,6 Ranking 1,0 2,0 3,0 4,5 4,5 6,0 11,0 16,0 O derecha 0,0129 0,0131 0,0147 0,0145 0,0168 0,0189 0,0189 0,0168 0,0179 0,0181 0,0210 0,0217 0,0239 0,0221 0,0264 0,0264 16 0,0190 0,0185 0,0043 0,0011 Fecha: 28/07/2006 CONTROLES O izquierda 0,0079 0,0069 0,0078 0,0075 0,0086 0,0105 0,0105 0,0074 0,0078 0,0079 0,0106 0,0075 0,0097 0,0073 0,0096 0,0093 16 0,0086 0,0079 0,0013 0,0003 (Od-Oi) 0,0050 0,0062 0,0069 0,0070 0,0082 0,0084 0,0084 0,0094 0,0101 0,0102 0,0104 0,0142 0,0142 0,0148 0,0168 0,0171 16 0,0105 0,0098 0,0038 0,0010 % Inflam. 63,3 89,9 88,5 93,3 95,3 80,0 80,0 127,0 129,5 129,1 98,1 189,3 146,4 202,7 175,0 183,9 16 123,2 112,6 44,4 11,1 Ranking 7 8 9 10 12 13,5 13,5 15 17 18 19 20,5 20,5 22 23 24

Z = w-[n(m+n+1)/2]/RAIZ[m*n(m+n+1)/12]

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Evaluacin actividad antiinflamatoria tpica frente a TPA: crema anhidra de extracto estandarizado murtilla 5% Dosis: 80 uL/oreja de la crema MUESTRA Ratn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 n promedio mediana Desv. Std SEM W % E con promedio % E CON MEDIANA mediana de controles mediana de muestra % E FINAL CON MEDIANA z= p= -3,28 0,0005 71,8 69,2 0,0098 0,0030 69,2 6 0,0116 0,0112 0,0018 0,0007 6 0,0086 0,0087 0,0008 0,0003 6 0,0030 0,0030 0,0023 0,0009 6 36,0 33,1 30,9 12,6 6 69,7 69,2 23,8 9,7 24,5 M O.derecha 0,0096 0,0101 0,0114 0,011 0,0127 0,0146 O izquierda 0,0094 0,0088 0,0086 0,0078 0,0095 0,0076 (Od-Oi) 0,0002 0,0013 0,0028 0,0032 0,0032 0,0070 % INF 2,1 14,8 32,6 41,0 33,7 92,1 % EAI Ranking 97,9 86,7 71,3 67,2 67,2 28,2 1,0 2,0 3,0 4,5 4,5 9,5 O derecha 0,0129 0,0131 0,0147 0,0145 0,0168 0,0189 0,0189 0,0168 0,0179 0,0181 0,0210 0,0217 0,0239 0,0221 0,0264 0,0264 16 0,0190 0,0185 0,0043 0,0011 Fecha: 28/07/2006 CONTROLES O izquierda 0,0079 0,0069 0,0078 0,0075 0,0086 0,0105 0,0105 0,0074 0,0078 0,0079 0,0106 0,0075 0,0097 0,0073 0,0096 0,0093 16 0,0086 0,0079 0,0013 0,0003 (Od-Oi) 0,0050 0,0062 0,0069 0,0070 0,0082 0,0084 0,0084 0,0094 0,0101 0,0102 0,0104 0,0142 0,0142 0,0148 0,0168 0,0171 16 0,0105 0,0098 0,0038 0,0010 % Inflam. 63,3 89,9 88,5 93,3 95,3 80,0 80,0 127,0 129,5 129,1 98,1 189,3 146,4 202,7 175,0 183,9 16 123,2 112,6 44,4 11,1 Ranking 6 7 8 9,5 11 12,5 12,5 14 15 16 17 18,5 18,5 20 21 22

Z = w-[n(m+n+1)/2]/RAIZ[m*n(m+n+1)/12]

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Anexo VI: Presentacin en primer simposio de farmacologa de productos naturales y BLACPMA.

Resumen:En el extracto de acetato de etilo de murtilla, los compuestos activos son cidos triterpenos pentaciclcos 2--hidroxi como los cidos asitico, coroslico y alfitlico. Estos triterpenos estn en mayor proporcin en las hojas recolectadas en otoo, en cambio, la cuantificacin de estos triterpenos en las hojas recolectadas en invierno, mostr un menor porcentaje de estos triterpenos. Conclusiones: De los resultados de este estudio, se concluye que es muy importante estandarizar qumica y farmacolgicamente un extracto activo, para el desarrollo de un producto farmacutico con efectos analgsicos y antiinflamatorios de mxima eficacia.

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