GENERALIDADES

HISTOLOGIA
TCNICAS HISTOLGICAS

INTRODUCCIN
Las tcnicas histolgicas son una serie de pasos a travs de los cuales una muestra de tejido llega a transformarse en delgados cortes coloreados capaces de ser observados y estudiados en el microscopio. Obtencin - Proveer el material para su estudio al microscopio Fijacin - Preservar el material Deshidratacin e Inclusin por parafina - Humedecer el material en un medio fcil de cortar en fetas muy delgadas Corte - Lograr lminas muy delgadas que sean atravesadas por la luz Coloracin - Visualizar los tejidos Montaje - Preservar el corte, mantenindolo aislado del aire y deshidratado.

Obtencin
El material a utilizar puede ser extrado de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano. La obtencin consiste en la provisin del material que se desea estudiar a travs del microscopio. El mtodo seleccionado debe ser el adecuado para cada tipo de material. El material humano puede obtenerse a partir de: o Necropsias: Son las piezas que se obtienen de un cadver; deben ser inmediatamente congeladas o fijadas para evitar fenmenos de autodestruccin. o Biopsias: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida, los cuales derivan en un diagnostico patolgico. Existen varios tipos de biopsias: o Biopsia incisional: se realiza seccionando con instrumentos cortantes como el bistur. o Biopsia por punch: el punch es un instrumento filoso que se utiliza para tomar biopsias de piel. o Biopsia por puncin: se realiza con agujas es del tipo intramuscular (microbiopsia). o Biopsia endoscpica: se hace a travs de endoscopio. o Reseccin quirrgica: Son tejidos que han sido extrados de las intervenciones quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados). o Citologia exfoliativa: Se recoge material desprendido espontneamente o en forma inducida de las superficies de los rganos. Es un mtodo menos invasivo que la biopsia.

Fijacin
La fijacin tiene por objeto matar las clulas y tratar de conservarlas en el estado en el que se encontraban durante la vida. Con la fijacin se trata de conservar la estructura morfolgica y qumica de las clulas y tejidos que tenan en el estado vivo, estabilizando las protenas y creando enlaces cruzados (se utiliza fijador de glutaraldehido o formaldehdo) y evitar un mnimo de modificaciones. Es por eso que se debe realizar inmediatamente luego de extraer las clulas del organismo: la fijacin debe penetrar con extremada rapidez. De esta manera, facilita la realizacin posterior de procedimientos de coloracin o de identificacin para el conocimiento de la constitucin ntima del material y evita la multiplicacin microbiana y los procesos de autolisis donde la clula cambia su PH activando enzimas que degradan a la clula. El fijador va a estar determinada por el tipo de investigacin histolgica que se pretenda realizar: o Fijadores qumicos: o Fijadores simples: Estn constituidos por una sola sustancia qumica. El ms usado es el Formol al 37% - 40%. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos. o Fijadores compuestos (o mezclas fijadoras): En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. o Fijadores fsicos: o Desecacin (evapora el agua de los tejidos). o Calor (desnaturaliza la estructura proteica, por lo cual casi no se lo emplea). o Congelacin (preservan la composicin qumica) o Fro.

Es importante recordar: - En caso de no saber cual es el fijador ideal para una determinada muestra de tejido, debe utilizarse formol. - Nunca debe emplearse el formol puro, sino diluido al 10%. - El tiempo de fijacin debe oscilar entre 12 y 36 horas. - Para la correcta fijacin de una muestra, sta no debe superar el tamao de 1cm de lado.

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Deshidratacin e Inclusin por Parafina

Para la obtencin de cortes finos es indispensable que el tejido haya sido previamente endurecido hasta un cierto punto. Cuanto mayor sea la firmeza del Tejido, ms delgada resultara el corte histolgico. Con el fin de endurecer los tejidos existen dos mtodos principales: la congelacin o la inclusin. Para las tcnicas ms frecuentes se emplea el mtodo de inclusin: El tejido se impregna en un material que le confiere una consistencia: la parafina. Las piezas al ser retiradas del fijador, o despus de haberlas lavado, estn embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, los tejidos fijados se deshidratan en alcoholes de concentracin creciente de manera escalonada y pausada para evitar alteraciones bruscas. Luego al preparado hay que pasarlo por solventes intermediarios como xileno que producen un proceso de aclaracin. Por ltimo se coloca al preparado en una estufa con parafina fundida. Luego de impregnar al tejido, se deja solidificar a la parafina con el tejido incluido, constituyendo los bloques o tacos histolgicos.

Cortes
La inclusin permite la reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrtomos son instrumentos de gran precisin que constan de una navaja muy afilada que secciona el taco histolgico y proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes ms corrientes son los de 2- 4 micrones. Los tejidos deben ser cortados en lminas delgadas para posibilitar su observacin con el microscopio. Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrtomo, en agua tibia contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos, previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histolgica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuacin se lo levanta.

Coloracin
La falta de colores y contrastes en las estructuras celulares no permite visualizar prcticamente ningn componente del corte histolgico. La tincin o coloracin se efecta con dos propsitos: posibilitar el estudio morfolgico o estructural de las estructuras observadas o para identificar a un determinado tipo de molcula o sustancia presente. Las coloraciones pueden ser: Ortocromticas, en donde los tejidos adquieren un color igual al de la solucin colorante empleada o metacromticas, donde una sustancia o un componente celular se tie con un color diferente al del colorante empleado. La mayora de los colorantes citolgicos o histolgicos son de naturaleza orgnica. Se reconocen dos tipos de colorantes: bsicos y cidos. La coloracin rutinaria ms empleada es la combinacin de un colorante bsico catinico (hematoxilina) con una carga positiva (+) que reacciona con los componentes aninicos de la clula, o sea quienes poseen carga negativa. Entre los componentes aninicos se ubican los grupos fosfatos de los c. Nucleicos y los grupos carboxilo de las protenas. Es por esto que la hematoxina tie de color azul violceo al ncleo por la presencia de ADN (con grupos fosfatos) y al RER por producir protenas que proseen grupo carboxilo. La capacidad de los componentes a reaccionar con el colorante catonico se llama BASOFILIA. El colorante complementario cido (eosina) con una carga negativa (-) que reacciona con los componentes catinicos de la muestra. Dentro de los componentes catinicos de la clula se reconocen los elementos fibrilares del espacio intercelular, gran parte del citoplasma y los tie de color rosado. La capacidad de los componentes catinicos de reaccionar con el colorante cido se llama ACIDOFILIA. Ante este mtodo de tincin se pierden componentes solubles, iones molculas pequeas y los lpidos neutros en el proceso de inclusin por el accionar de los alcoholes, solventes orgnicos y parafina. Tambin existen colorantes neutros, que son sales en las que tanto el cido como la base son coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Durante el proceso de coloracin y fijacin con H-E suele perderse parte de la composicin qumica y morfolgica de la clula. Es por eso que el mtodo de coloracin que se utilice ser determinado por el tipo de estructura a estudiar bajo el microscopio. Para conservar lpidos neutros, que en el proceso de tincin con H-E se diluyen, se debe usar cortes por congelacin, fijado en formalina y colorantes que disuelvan grasas. Para conservar las estructuras de membrana se utilizan colorantes con metales pesados como el permanganato. Para el material elstico se utiliza coloracin con orcena y fucsina - resorcina.

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Montaje
Luego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a la aclaracin y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro. La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Blsamo de Canad, que al mismo tiempo le confiere un ndice de refraccin semejante al del vidrio. Para el montaje, se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto.

MUESTRAS VIVAS
Mtodos de observacin a clulas vivas
Hay muchas ventajas en el estudio de clulas y tejidos vivos, sin embargo, la utilizacin de los mismos posterior a la extraccin requiere de grandes cuidados: o El cultivo del tejido: Se utiliza para el estudio de poblaciones celulares fuera del organismo. El cultivo puede ser: o Clulas aisladas que no estn ms organizadas en un tejido. o Cultivo de tejido que implica la transferencia de una porcin de tejido embrionario o explantado a un medio de cultivo. o Cultivo de rganos que pueden ser explantados de rganos embrionarios u rganos totalmente desarrollados (en este tipo de cultivo se intenta mantener la estructura y funcin normal del rgano). El cultivo requiere una serie de cuidados como la mantencin del frasco de reactivo estril. Luego de la obtencin de la muestra, hay que mantener al tejido en una solucin que tenga una composicin similar a los lquidos titulares agregando un medio nutritivo y antibiticos para disminuir el problema de infecciones bacterianas. Tambin requiere de la administracin de una temperatura ideal para la multiplicacin celular (37,5C).

Manipulacin experimental de clulas vivas

Algunos colorantes son captados por algunas clulas vivas. En la tincin vital se inyecta el colorante en el animal vivo, mientras que para la tincin supravital se agrega el colorante a las clulas o el tejido vivo posterior a su extraccin. El azul tripn y el carmn de litio son partculas utilizadas para el estudio de fagocitosis. El rojo neutro (tie mitocondrias) y el verde Jano (tie distintos subtipos de leucocitos: se utilizan para el estudio de glbulos blancos. La utilizacin de tejidos vivos es limitada ya que el espesor de las muestras impide el pasaje de luz a travs del microscopio generando poca refraccin.

Mtodos histoqumicos
Los mtodos histoqumicos hacen referencia a la utilizacin de tcnicas fsicas o qumicas sobre los preparados histolgicos para la identificacin, localizacin y cuantificacin de una sustancia en un tejido o clula. Se llamarn histoqumicas (tejidos) o citoqumicas (clula) aunque ambos trminos se usan como sinnimos. Estas tcnicas se usan tanto en MO como en ME. o El reactivo de Shiff: es un colorante bsico que reacciona con los grupos aldehdo presentando una coloracin roja y es la base de las reacciones de PAS y Feulgen. o La reaccin de PAS (Peryodic Acid Shiff): tie carbohidratos y macromolculas con abundancia de carbohidratos: se usa para detectar la membrana basal ubicada en los tejidos de los epitelios y fibras reticulares del tejido conjuntivo. El principal mtodo se basa en que el c. Peridico (HIO4) oxida los grupos hidroxilos y se forman grupos aldehdo. o La reaccin de Feulgen: es utilizada para la determinacin de ADN: en la reaccin las purinas de las desoxirribosas del DNA se separan y por medio de una hidrlisis se forman grupos aldehdos. o Radio Autografa: Provee informacin de la morfologa y aspectos dinmicos de la clula, basndose en una marca radiactiva. Es posible a partir de esta tcnica obtener informacin directa de un sitio dentro de la clula donde se sintetiza un producto y los componentes qumicos que lo forman. Adems se puede seguir los desplazamientos de toda la clula y su posterior destino en el organismo. o Inmuno histoqumica: El cuerpo puede reaccionar ante antgenos y formar anticuerpos (protenas que circulan por la linfa y la sangre y son los encargados de proteger al organismo) especficos que se unen al antigeno. En los mtodos inmunohistoqumicos se marca al anticuerpo de modo que este se vuelva visible con un colorante fluorescente que absorbe la luz ultravioleta (UV) y emite luz verde. El complejo antgeno anticuerpo as formado puede localizarse e identificarse en las muestras tisulares o citolgicas a estudiar, con lo que se identifican los marcadores antignicos caractersticos de distintas lneas de diferenciacin y funcionalismo celular y se determina el tipo de clula involucrado en la muestra.

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MICROSCOPA
Microscopa ptica
Los mtodos histolgicos se clasifican en dos grupos: los que se basan en la observacin de clulas vivas y los que analizan en base a material muerto. En todos los casos se comienza con el microscopio ptico. El poder de resolucin es la distancia que debe haber entre dos objetos para que se vean separados y no parezcan un solo objeto. La funcin del microscopio es ampliar la imagen de modo que la retina capte esa separacin. Aun as la resolucin que pueda llegar a captar estar determinada por la longitud de onda de la luz y de factores como el espesor de la muestra y la calidad de su fijacin. o La apertura numrica (NA) = N* Sen : Es el ngulo mximo de luz emitido por el condensador y puede llegar a ser captado por el objetivo. o Lmite de resolucin (aa): es la distancia que separa a dos objetos para que se vean separados. El poder de resolucin es inversamente proporciona al lmite de resolucin o Aumento: Es la relacin entre el tamao de la imagen y del objeto. o ndice de refraccin: es la medida de la velocidad de dispersin de una onda luminosa que atraviesa un medio. o Aberracin cromtica: Se origina debido a que la luz no es monocromtica. Los distintos colores de la luz tienen distintas velocidades dentro del material de las lentes y por lo tanto distinto ndice de refraccin. Cada color tiene un foco distinto y experimenta una desviacin distinta. Esto hace que la imagen no se forme en un nico punto y aparece una distorsin. Este defecto se corrige combinando adecuadamente una lente convergente con otra divergente de distinto ndice de refraccin (flint - grown). o Aberracin esfrica: Cuando la lente no es perfectamente esfrica la convergencia de los rayos hace que la imagen no se forme en el mismo punto.

Partes de un Microscopio ptico

o Sistema ptico o Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. o Objetivo: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. o Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. o Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. o Sistema mecnico o Soporte: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. o Platina: Lugar donde se deposita la preparacin. o Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, etc. o Revlver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. o Tornillos de enfoque: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto.

Microscopio de contraste de fase

Los tejidos que no son coloreados producen muy poco contraste pero producen un desfasamiento en las longitudes de onda, las cuales a travs del microscopio de contraste de fase se pueden transformar en diferencias de fases generando un distinto color que pueden ser captadas por el ojo humano. El microscopio de contraste de fase permite as observar la sustancia sin colorear y se aplica para el estudio de clulas vivas.

Microscopio de fluorescencia
Algunas sustancias tienen la propiedad de fluorecer, o sea de emitir luz de otra longitud de onda cuando se las ilumina. En el microscopio de fluorescencia se ilumina el preparado con intensa luz de longitud de onda capaz de activar el colorante fluorescente. Las estructuras fluorescentes se destacan sobre un fondo oscuro. Marca anticuerpos.

Microscopio de luz ultravioleta

Este microscopio presenta una longitud de onda ms corta por lo que se puede alcanzar un mayor poder de resolucin. La imagen esta determinada por la absorcin de la luz UV por las molculas de la muestra .se utiliza para detectar ADN, ARN y protenas.

Microscopio de luz polarizada

Cuenta de un filtro polarizador y otro analizador que pueden rotarse y la diferencia entre sus ngulos se usa para ver como afecta la luz polarizada (fuente lumnica) a la estructura.

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Microscopio confocal
Permite la visualizacin de una muestra biolgica en 3 dimensiones, buen poder de resolucin y claridad en los cortes finos. Se basa en una fuente lumnica lser.

Microscopio electrnico
Se remplaza la luz visible por un haz de electrones que permite un mayor poder de resolucin. La imagen que se forma se registra por proyeccin en una pantalla fluorescente o en una pelcula fotogrfica. La formacin de la imagen se forma por la ausencia de estos electrones y la ausencia de estos depende del espesor del objeto. Es por eso que se requiere de cortes ultra finos.

Microscopio de campo oscuro

Produce contraste en materiales no teidos. Se basa en la iluminacin del preparado por un condensador especial que emite una luz intensa de forma oblicua. . Se utiliza para la identificacin de bacterias en un fondo oscuro donde se aprecian como imgenes brillantes. 1 mm = 0,001 m= 10^-3m 1um = 0,000001 m =10^-6 m 1nm = 0.000000001 m = 10^-6 m 1 = 0,0000000001 m = 10^-10m 1pm = 0,000000000001m = 10^-12m