UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

Facultad de Ciencias Químicas

Microbiología Industrial

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y
PRESERVACION DE CEPAS PARA LA
OBTENCION DE BIOETANOL A
PARTIR DE RESIDUOS DE BANANO

Integrantes:

• Bastidas Tania
• Ibarra Danilo
• Serrano Sebastián
• David Salgado
• Vicente Benítez

QUITO – ECUADOR

2010
INDICE
I. PROBLEMA:

El tratamiento de los desechos agroindustriales es una problemática mundial

debido a la emisión de contaminantes de sólidos, líquidos y gaseosos. Una
alternativa de disposición final de los desechos que permite tener un producto
sanitizado, con aplicaciones agrícolas es la implementación de procesos
fermentativos para dichos sustratos que permiten recuperar sustancias como
metano y alcohol etílico, convirtiéndose en una buena fuente de energía
alternativa.
El banano de rechazo rico en almidón, puede ser utilizado como sustrato para
procesos fermentativos que permitan el máximo aprovechamiento energético a
través de la generación de etanol.

II. ANTECEDENTES:

El banano puede ser cultivado en las vastas llanuras del Litoral, en los valles
subtropicales de la Región Interandina, en las selvas del Oriente y en pequeños
sectores aptos de las Islas Galápagos.

Miles de hectáreas se han dedicado al cultivo de este producto que prospera

desde el nivel del mar hasta 1500 m de altura.

Las zonas de mayor producción se hallan en las provincias de El Oro, Guayas,

Los Ríos, Manabí, Esmeraldas y la región subtropical de la provincia de Sto.
Domingo de los Tsachilas.

El Ecuador está entre los primeros productores de banano en el mundo, con un

8% de banano desechado, el cual puede ser utilizado para la utilización en
biocombustibles.

La actividad bananera genera impactos negativos en los diferentes elementos

ambientales (suelo, aire, agua, flora, fauna y paisaje).

Por ejemplo Colombia produce 250 mil toneladas de fruta no exportada y unos
75 millones de vastagos apilados en el campo sin ningún tipo de tratamiento
(esta fruta no tiene consumidor final y el 90% es dejado en el campo)
 AÑO SUPERFICIE PRODUCCIÓN NACIONAL

(En Has) (En TM)

1999 138,230 4.686.328

2000 143,961 4.992.967

2001 145.554 5.299.606

2002 148.786 5.606.246

2003 152.019 5.912.885

2004 176.029 6.219.525

III.

III. JUSTIFICACION
Ecuador goza de condiciones climáticas excepcionales, para la producción del banano ya que la
riqueza de su suelo, ha permitido que el país se convierta en un productor agrícola de excelente
calidad, ya que esta fruta se encuentra disponible todo el año.

Ecuador no sólo es el primer exportador de esta fruta desde 1952, sino también es el segundo
mayor productor de banano a nivel mundial ocupando el 28% de las exportaciones mundiales de
banano, la producción de banano para la exportación llega a cifras tan exorbitantes de hasta 8 000
000 de toneladas métricas de las cuales hasta el 8 % de esta producción son rechazadas por fallas
en la materia prima.

La producción de etanol a partir del banano rechazado es una tendencia muy bien aprovechada ya
que es una tendencia ecológica a frenar la contaminación producida por los combustibles fósiles
por utilización de este alcohol. Esta producción se hará sin desabastecer el ámbito alimenticio y de
comercialización interna del banano.

IV. HIPÓTESIS

4.1. HIPÓTESIS NULA

Las bacterias con capacidad para la obtención de bioetanol obtenidas a partir de residuos del
banano se podrán aislar de manera efectiva en el medio nutritivo diseñado a base de medio
minimal, fuente de carbono y de nitrógeno específicos.

4.2. HIPÓTESIS ALTERNA

Las bacterias con capacidad para la obtención de bioetanol obtenidas a partir de residuos del
banano no se podrán aislar de manera efectiva en el medio nutritivo diseñado a base de medio
minimal, fuente de carbono y de nitrógeno específicos.

V. OBJETIVOS

5.1. OBJETIVO GENERAL

♣ Aislamiento, selección y preservación de cepas para la obtención de bioetanol a partir de

rechazo de banano

5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 ♣ Recolectar sustratos (rechazo de banano) provenientes del rechazo en la industria
♣ Diseñar el medio de cultivo más adecuado para el crecimiento óptimo de los
microorganismos para la producción de bioetanol a partir del rechazo de banano y
formación del producto
♣ Aislar los grupos de poblaciones microbiológicas de cepas que cuenten con la capacidad
de obtención de bioetanol
♣ Seleccionar las cepas con la mejor capacidad de formación de bioetanol
♣ Preservar las cepas seleccionadas con características biotecnológicas a las condiciones
adecuadas obtenidas al final del bioproceso, mantenga las características biotecnológicas
mediante la técnica de crioconservación.
♣ Preservar a condiciones adecuadas, las cepas seleccionadas e identificadas para la
producción de bioetanol

VI. ASPECTOS TEÓRICOS

6.1. EL BANANO

Composición Química del Banano

COMPOSICION
Cantidad por 100 Ingestas
gramos por Recomendadas
porción
comestible
Agua (g)1 75.1 -
Energía (kcal)1 83 3000 - 2300
Proteínas (g)1 1.2 54 - 41
Hidratos de carbono (g)1 20 450 - 350 (a)
Lípidos (g)1 0.3 90 - 80 (a)
Fibra
Fibra total (g)3 1.82 > 30 (a)
Soluble (g) 0.62 12 (a)
Insoluble (g) 1.20 18 (a)
Vitaminas
Vitamina A (Eq. Retinol) (µg)3 8.5 1000 - 800
Carotenos totales (µg)3 71 -
Alfa-caroteno (µg)3 40 -
Beta-caroteno (µg)3 31 -
Criptoxantina (µg)3 0 -
Vitamina E (mg)1 0.2 10 - 8
Vitamina B1 (mg)1 0.06 1.2 - 1.1
Vitamina B2 (mg)1 0.07 1.3 - 1.2
 Niacina (mg)1 0.8 16 - 15
Vitamina B6 (mg)1 0.51 1.5 - 1.3
Folatos (µg)1 22 400
Vitamina C (mg)1 10 60
Minerales
Calcio (mg)1 9 1000 - 1200
Hierro (mg)1 0.8 10 - 15
Fósforo (mg)3 23 700
Magnesio (mg)1 38 400 - 350
Zinc (mg)1 0.23 15 - 12
Selenio (µg)3 1.4 70 - 55
Sodio (mg)1 1 -
Potasio (mg)1 350 -
Carotenos sin actividad provitamínica A
Luteína (µg)2 7 -
Zeaxantina (µg)2 0 -
Licopeno (µg)2 0 -
Ingesta Recomendada: Recomendaciones de energía y nutrientes para hombre-mujer de 20 a 39 años.

La cáscara de banano transforma al rededor del 90% de su almidón a azucares aproximadamente

después de 12 días de su cosecha, un contenido de hasta 14.6% de azucares en base seca asido
encontrada. El contenido de fibra de la cáscara es el 13% de base seca.
Los principales componentes de la cáscara son celulosa 25%, hemicelulosa el 15%, y lignina 60%

6.2. EL BIOETANOL

El bioetanol se produce por la fermentación de los azúcares contenidos en la materia orgánica de

las plantas. En este proceso se obtiene el alcohol hidratado, con un contenido aproximado del 5%
de agua, que tras ser deshidratado se puede utilizar como combustible.

El bioetanol mezclado con la gasolina produce un biocombustible de alto poder energético con
características muy similares a la gasolina pero con una importante reducción de las emisiones
contaminantes en los motores tradicionales de combustión. El etanol se usa en mezclas con la
gasolina en concentraciones del 5 o el 10%, E5 y E10 respectivamente, que no requieren
modificaciones en los motores actuales.

• Dilución: Es la adición del agua para ajustar la cantidad de azúcar en la mezcla o (en última
instancia) la cantidad de alcohol en el producto. Es necesaria porque la levadura, usada más
adelante en el proceso de fermentación, puede morir debido a una concentración demasiado
grande del alcohol.

• Conversión: La conversión es el proceso de convertir el almidón/celulosa en azúcares

fermentables. Puede ser lograda por el uso de la malta, extractos de enzimas contenidas en la
malta, o por el tratamiento del almidón (o de la celulosa) con el ácido en un proceso de hidrólisis
ácida.

• Fermentación: La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras,

básicamente. De la fermentación alcohólica se obtienen un gran número de productos, entre ellos
el alcohol.

• Destilación o Deshidratación: La destilación es la operación de separar, mediante calor, los

diferentes componentes líquidos de una mezcla (etanol/agua). Una forma de destilación, conocida
desde la antigüedad, es la obtención de alcohol aplicando calor a una mezcla fermentada.
6.3. ZIMOMONA MOBILIS
Características:

Características Bacilo o diplobacilo corto y con extremos redondeados,

Gram -, móvil por flagelos lofótricos, sin cápsula, ni
esporas

Tipo de Metabolismo Heterótrofo

Requerimiento de O2 Anaeróbico facultativo, fermenta de glucosa, la

fructosa, la sacarosa a etanol con producción de gas.
(vía de Entner-Doudorof)

T óptima 30oC

pH óptimo 5,0

Fuentes Naturales En los frutos vegetales, asociada a levaduras.

En el vino de palma es la principal bacteria tolerante
del alto contenido en glucosa, fructosa, sacarosa y en
consecuencia concentración alcohólica.
En el jugo de caña de azúcar y en la miel de abeja

Ventajas del uso de Zimomona:

1) Tolera elevada concentración de glucosa y fermenta a etanol a nivel mayor que

una levadura, especialmente en cultivo continuo en la que produce una elevada
concentración de etanol

2) Genera una elevado nivel de etanol, pero bajo en biomasa en comparación con
una levadura.

6.4. MEDIO DE ENSAYO

Primeramente a la cáscara de plátano triturada, le agregamos KH2PO4, (NH4)2SO4, extracto de

levadura y MgSO4.7H2O

Tabla 1. Medio Mínimal para desarrollo de cepas con capacidad de obtener bioetanol a
partir de residuos de banano

NOMBRE NOMENCLATURA CANTIDAD

Sulfato de Magnesio
MgSO4.7H2O 0,5g
Heptahidratado
Fosfato ácido de Potasio KH2PO4 1.0 g
Sulfato Ferroso FeSO4 0.05 g
 Cloruro de Calcio CaCl2 0.02 g
Cloruro Mangánico Mg2Cl 0.002 g
Molibdato de Sodio NaMoO 0.001 g
Agar – Agar 5g
Extracto de Levadura 5g
Glucosa C6H12O6 20g
Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 1g

VII. ASPECTOS METODOLÓGICOS

7.1. TÉCNICAS DE MUESTREO

Tipo de muestra: Simple

Métodos de Recolección:

Manual: Este método de recolección es el más simple e involucra equipamiento mínimo. Puede ser
muy costoso y demorado para muestreos a gran escala

7.2. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO

El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las técnicas empleadas normalmente en
microbiología, siguiendo el esquema a partir de una muestra de banano de rechazo:

Tabla 2. Resumen de la técnica de aislamiento de cepas de cepas con capacidad de obtener

bioetanol a partir de residuos de banano

TRATAMIENTO DE LA MUESTRA SUSTANCIA O MATERIAL A UTILIZAR

Fermentación del banano de rechazo (cascara y

Banano de rechazo
pulpa)

Obtener glucosa para el medio minimal a partir

Banano de rechazo
de banano de rechazo

Contaje inicial de concentración de bacterias en

la muestra de banano de rechazo Agar TSA

Medio minimal enriquecido

Enriquecimiento de los distintos tipos de banano
de rechazo
Aislamiento de las cepas Medio minimal

Selección de las cepas(concentraciones de Medio minimal con distintas concentraciones

etanol) de etanol

Conservacion de las cepas Congelador

El medio minimal tiene cicloheximida el mismo que es un inhibidor de mohos, para obtención de zymomonas

7.3. TÉCNICAS DE SELECCIÓN

Las cepas purificadas se dispondrán para pruebas que consisten en someterlas al medio diseñado
a partir medio minimal, al cual se someterán a diferentes concentraciones de etanol (6, 8, 10,
12)%para permitirles inicialmente adaptarse a las condiciones y posteriormente se seleccionarán
las mejores cepas, es decir las que han sobrevivido a las concentraciones más adecuadas.

7.4. FUNDAMENTO DE AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS

Para aislar y seleccionar las mejores cepas se debe obtener el banano de rechazo

Primera etapa; se toma 5 ml de banano de rechazo fermentado, se incluye la base mineral 45 ml

junto con un inhibir de mohos (cicloheximida), se incuba en anaerobiosis, a la temperatura
adecuada y el sustrato que contiene la fuente de carbono y energía.
Segunda etapa: comprende el aislamiento de microorganismos, para lo cual se siembra por
vertido en medio minimal con agar al 2% y una cantidad de sustrato (glucosa obtenida del banano
de rechazo). Se debe realizar por duplicado cada muestra. Incubar a temperatura y tiempo
adecuado en anaerobiosis. En este paso se desarrollan todas las cepas que pueden soportar estas
condiciones.
Tercera etapa: se utilizan las cepas que sobrevivieron al paso anterior, para ser sembradas y
purificadas en caldo TSA, se promueve el desarrollo a una temperatura y tiempo adecuados y
luego, se conservan según la técnica indicada. (Primer repique).
Una etapa paralela incluye un segundo repique de las cajas petri anteriores, para darle amplitud de
desarrollo de las cepas en medio BHI, se incluye una cantidad de medio nutritivo con
cicloheximida. El medio es altamente selectivo ya que algunos de sus componentes tienen
composición desconocida y promoverá el desarrollo de las mejores cepas. Incubar por un día.
Cuarta etapa: (tercer repique) la selección de las cepas consiste en someter a las cepas a
distintas concentraciones de de 6,8,10,12% de etanol junto con el medio minimal.

7.5. TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN

Tabla 3. Pruebas bioquímicas de identificación de microorganismos anaerobios

Pruebas bioquímicas
Oxidasa Negativo

Indol Negativo

Reducción de Negativo
nitratos

Hidrólisis de úrea Negativo

Degradación de Negativo
gelatina

Catalasa Positivo

Producción ácido Positivo

sulfídrico

7.5. TÉCNICAS DE CONSERVACIÓN

Tabla 4. Principales técnicas de conservación de cepas

TÉCNICA DEFINICIÓN

Consiste en el repique periódico del cultivo en un medio nutritivo fresco. El

intervalo de transferencia varía con el microorganismo, debiendo
Subcultivos considerarse el medio adecuado para cada especie. Una vez desarrollados
los cultivos se mantienen a 4 °C durante lapsos que oscilan entre 15 días y
2 meses, aunque presentan algunos inconvenientes

Consiste en cubrir completamente el cultivo después de su desarrollo en

Mantenimiento medio sólido, con una capa de aceite mineral o vaselina estéril. Los cultivos
bajo capa de aceite en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente o aún mejor en
heladera por períodos de varios años.

Congelación
 Es una técnica de elección, ya sea para cortos o largos períodos de
tiempo.
La técnica involucra el crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria, ya
que en general en esta etapa las células son más resistentes a los daños
por congelación y descongelación.
Las células a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un
agente crioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de
cultivo. El más empleado es glicerol al 10%.

VIII. ESTUDIO DE FACTIBILIDAD

Una empresa facilita la extracción de la

Muestreo
muestra.

Shaker Orbital
Balanza Analítica
Equipos Estufa
Congelador -80 °C
Autoclave 121°C

Erlenmeyer 500 ml
Material Cajas petri
Pipetas de 10 ml

Sulfato de Magnesio
Fosfato ácido de Potasio
Sulfato Ferroso
Cloruro de Calcio
Cloruro Mangánico
Reactivos y medios
Molifdato de Sodio
Extracto de Levadura
Agua

8.1. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

 TAREAS FECHA
Revisión y búsqueda de información 1 semana
Aprobación y corrección 1 semana
Preparación de material y medios de cultivo 1 a 2 días
Muestreo y transporte de las muestras 1 día
Aislamiento de Cepas 1 semana
Selección de mejores cepas can capacidad para producción de bioetanol 2 semanas
Identificación de las cepas 1 semana
Elaboración de un biorreactor a nivel de laboratorio y conservación de las cepas 1 semana

Los medios de cultivo, los reactivos para pruebas de identificación, las condiciones de
conservación y todo lo necesario para el desarrollo del proyecto están disponibles en el laboratorio
de microbiología.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS