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RESTRICCIONES FERMENTATIVAS: Paralizacin de fermentaciones

Origen de las restricciones


Las restricciones fermentativas se producen por estados de estrs que sufren las levaduras en las etapas de su produccin como inculos y durante su manejo en las etapas de aplicacin industrial.

Las causas de estrs son muy variadas y estn relacionadas con un amplio numero de factores que afectan las estructuras y el metabolismo celular. De la mayora de estos factores de estrs no se conoce bien su causa precisa pero todos afectan el crecimiento de la levadura y la funcionalidad de membranas

Produccin de inoculos (LSA)


La forma general de comercializar levaduras es como levaduras secas activas (LSA). La forma en que se obtienen, condiciona su comportamiento fermentativo Existen cepas de levaduras que no pueden producirse industrialmente, ya que no toleran alguna de las etapas del proceso de produccin Hace falta un mayor desarrollo en este aspecto

Antecedentes generales
La utilizacin de levaduras seleccionadas hace necesario contar con mtodos de conservacin de cepas y produccin de biomasa con un comportamiento fermentativo garantizado Las condiciones de conservacin y de aumento de la biomasa, afectan las caractersticas de los inculos. Las etapas antes sealadas pueden provocar en las levaduras fenmenos de estrs que afectan su energa fermentativa y la tolerancia al grado alcohlico.

Etapas de produccin de LSA


Activacin de las cepas del cepario Inoculacin en el medio nutritivo Regulacin de las condiciones de crecimiento Recuperacin de la biomasa por centrifugacin Eliminacin de agua por extrusin Secado en flujo laminar

Factores crticos en la produccin de LSA


Conservacin de Inculos Medios de crecimiento y condiciones de conservacin Programas nutricionales Induccin de protenas de stress Sntesis de glicerol y trealosa
Presencia de protenas de stress.

Tolerancia a stress osmticos

Tolerancia al secado

Programas nutricionales condiciones de crecimiento

Efectos de la forma de conservacin de cepas de levaduras

ESTRES PRESENTES DURANTE LA FERMENTACION

causales de represin durante la actividad fermentativa


Macronutrientes Limitacin nutricional Micronutrientes Inhibicin por sustrato Toxicidad por etanol Exceso de azcar Deficiencias de factores de sobrevida Deficiencias de oxigeno Inoculo de crecimiento inapropiado Acidos grasos Residuos de fungicidas Toxinas microbianas Exceso de SO2 Clarificaciones intensas de mostos Esteroles Acidos grasos insaturados Nitrogeno Fosfato Vitaminas Minerales

Sustancias txicas

Deficiencia de coloides

Acetato, Propionato Butirato Cadena media (C6 C10) Levaduras killer Micotoxinas muy Alteraciones de la pared celular

Causas de estrs
Elevada variabilidad del medio fermentativo La variabilidad se ve afectada por la composicin inicial y los cambios permanentes durante la evolucin de la fermentacin La levadura durante la fermentacin debe modular los regmenes de transporte de compuestos nitrogenados y azcares

Mecanismos de control del estrs


La clula debe activar variados mecanismos de control de estrs durante las etapas iniciales de la fermentacin Sntesis de protenas de estrs Sntesis de compuestos osmo-activos Sntesis de trehalosa para regular choque osmticos y responder a los efectos del etanol. Debe acumular glicgeno en condiciones de deficiencia de azcares

Aspectos nutricionales y fisiolgicos

Estrs producidos por condiciones nutricionales


Los factores de estrs relacionados con el aspecto nutricional pueden clasificarse en: Los que afectan la proliferacin y el crecimiento celular Los que afectan la actividad metablica en fase estacionaria no proliferante

Estas dos categoras no son necesariamente excluyentes


Los factores menos estudiados se relacionan con la fase estacionaria. En ella destacan Fallas en la disponibilidad de una fuente de energa Fallas en la disponibilidad de aminocidos para la sustitucin de protenas degradadas Deficiencias de compuestos necesarios para minimizar los efectos del etanol en la membrana (factores de sobrevida)

Un evento critico: El crecimiento de la levadura


La produccin del vino durante la fermentacin del mosto es un subproducto del crecimiento de las levaduras El crecimiento de la levadura es definido como una asimilacin coordinada de nutrientes del medio y su subsecuente metabolismo para producir

La nueva biomasa formada es el resultado del aumento en tamao celular y la proliferacin que resulta de la reproduccin celular.
El manejo de la fermentacin requiere del control del crecimiento celular y de la velocidad de reproduccin celular
Produccin de biomasa con la menor cantidad de nutrientes Fermentacin con el menor tiempo de residencia

Eficiencia fermentativa

Rgimen de crecimiento
La optimizacin biotecnolgica es manipular las condiciones ambientales para controlar el crecimiento y el metabolismo de las levaduras para producir un producto de calidad

La extensin de cada fase es dependiente de las condiciones culturales, de la composicin del medio fermentativo y del estado fisiolgico de las clulas.

La naturaleza de la cepa la composicin del medio y las condiciones fsicas, tales como: temperatura, presin y grado de agitacin determinan la velocidad de crecimiento.

La sntesis de esteroles
La formacin de esteroles, acoplada a la movilizacin de glicgeno, es un prerrequisito para una transicin de la clulas desde la fase lag a la fase de crecimiento exponencial.

Existe una relacin lineal entre las cantidades de glicgeno desasimilado y el nivel de sntesis de esteroles durante la fermentacin

OXIGENO
La concentracin de oxigeno suplementado al mosto al inicio, es uno de los principales reguladores del crecimiento de la levadura

Existe una directa correlacin entre la concentracin inicial de O disuelto y el nivel de crecimiento celular El aumento en la disponibilidad de O2 promueve un elevado crecimiento celular a expensas del azcar, con un menor rendimiento en etanol. La magnitud depende de composicin del mosto

Variadas combinaciones cepa/mosto, aunque no todas, presentan una inversa correlacin entre concentracin de O2 y conc. de esteres en la bebida.

Alteraciones de los mecanismos de transporte

Aspectos relacionados con la accin de los transportadores


La perdida de actividad de los transportadores se ha establecido como el principal factor de las restricciones fermentativas Los transportadores para su normal funcionamiento deben cambiar de conformacin. Por ese mecanismo vuelcan los sustratos al interior de la clula La modificacin se hace difcil cuando la membrana es muy rgida Los cambios de la conformacin se favorecen con la mayor presencia de cido grasos insaturados en la membrana La suplementacin de algunos aminocidos en la fase estacionaria ha demostrado que tiene un efecto en la prolongacin de la actividad fermentativa, no as las adiciones de nitrgeno amoniacal.

Aspectos relacionados con la accin de los transportadores


La perdida de actividad de los transportadores se ha establecido como el principal factor de las restricciones fermentativas
Problemas de sustitucin de transportadores desgradados

Perdida de actividad de los transportadores


Deficiencias estructurales de las membranas

Alteraciones en el flujo de transporte de azcares


La estructura del mecanismo de transporte es muy compleja Participan 18 genes de estructura similar que codifican igual numero de protenas El transporte de los azcares se responde a una accin acumulativa de ms de un transportador Los transportadores depende de la concentracin de azcares del medio Transportadores de alta afinidad son inhibidos por elevadas concentraciones de azucares; funcionan a bajas concentraciones de sustrato Transportadores de baja afinidad funcionan cuando la concentracion de glucosa esta por debajo de unos 8 g/L. La sucesin de los transportadores es un evento critico Los transportadores de azucares presentan una elevada tasa de recambio en clulas en fase estacionaria, por ello para su sntesis se necesita un constante aporte de nitrgeno.

Variaciones en la velocidad de transporte intracelular de glucosa en funcin de su concentracin en el mosto

Efectos represores del etanol


Represin de los mecanismos de transporte activo a travs de la membrana Inhibe el bombeo activo de protones asistido energticamente por la ATPasa de la membrana. El etanol tambin desactiva la GAP por modificacin de su parte proteica. Altera la selectividad de las membranas celulares.

Efecto del etanol en la membrana


El

Alto Etanol

etanol produce una perdida de la selectividad frente a los protones externos y provoca un ingreso pasivo de protones a la clula.
La

MOSTO

CITOPLASMA

difusin facilitada de aminocidos es fuertemente inhibida por el etanol (compite con la difusin pasiva de protones).

Plasmalema

Efectos citoplasmticos causados por el etanol: posibles factores de resistencia


Las alteraciones no solo provocan estrs a nivel de la membrana La acumulacin intracelular de etanol provoca alteraciones citoplasmticas que modifican el estado inico de las protenas y como resultado su conformacin. Se observan cambios en la viscosidad del citoplasma La sntesis de trehalosa es un mecanismo de proteccin frente a estos efectos Las disponibilidades de glicina en el mosto al parecer acta en el mismo sentido. Este aminocido es deficiente en mostos de elevada madurez y en mostos con ataques de Botrytis.

Mas efectos de grado alcohlico


Disminucin de la velocidad de captacin de azucares Disminucin de la velocidad de utilizacin de oxigeno Mayores niveles de secundarios indeseados. Acetato de etilo, acido sulfhdrico Algunas respuestas adaptativas Disminucin de la relacin saturados/insaturados en la membrana Aumento de la concentracin de trehalosa Sntesis de protenas de strees (HSP)

Efectos del grado alcohlico: Modificacion en la expresin gnica


Induccin de un elevado numero de genes relacionados con: Protenas de stress Metabolismo de trehalosa Metabolismo glicoltico y TCA Componentes de membranas Protenas transportadoras Degradacin de protenas vacuolares

a) b) c) d) e) f)

Efectos represores de la temperatura


Las temperaturas afectan el comportamiento de los transportes a travs de la membrana La temperatura afecta la fluidez de la membrana al modificar la viscosidad de los cidos grasos. Las bajas temperatura disminuyen la fluidez y restringen los cambios de la conformacin de los transportadores. Las temperaturas elevadas alteran la asociacin entre el transportador y la membrana, afectan tambin el cambio de su conformacin. Los efectos son muy semejantes a los del etanol por ello las acciones estn correlacionadas. Sobre todo en el rango alto

Efectos represores de la temperatura (II)


Los cambios abruptos de temperatura tambin afectan a las enzimas citoplasmticas y con ello el funcionamiento de los organelos subcelulares. Los cambios drsticos de temperaturas generan la expresin de genes que sintetizan protenas de estrs. La posibilidad de las clulas de sintetizar estas protenas en la fase estacionaria es clave para enfrentar los cambios drsticos en el medio. Si los cambios de temperatura ocurren en condiciones de limitaciones nutricionales, las clula son incapaces de compensar los efectos del estrs.

Efecto de las competencias microbiolgicas


Las fermentaciones lentas o las inoculaciones tardas permiten el desarrollo de poblaciones de levaduras no Saccharomyces y bacterias lcticas Existen cepas que son muy sensibles al desarrollo de bacterias lcticas en el mosto. Los mostos en los que ha ocurrido un desarrollo de bacterias requieren el aporte de cantidades superiores de vitaminas. En California una bacteria identificada como Lactobacillus kunkeei, ha causado graves paralizaciones de fermentacin en funcin de las cepas de levadura que se trate. Las inhibiciones cruzadas son bastante especficas por ello se cree que no deberan tener gran importancia industrial. Eso si es necesario conocerlas para evitarlas

Efecto de las concentracin de slidos en suspensin


Los estudios han determinado que la cantidad de slidos y coloides en suspensin afectan la porosidad de pared celular. Al comparar un mosto con 380 NTU frente a otro de 34 NTU, se observ que la menor turbidez provoca:
Cambios estructurales: mayor concentracin de protenas, y diferente tipo; menor grado de glicosidacin (manosa) Aumento de porosidad de la pared celular en la fase estacionaria del crecimiento poblacional.

Razones para el efecto


La mayor porosidad de la pared permite la perdida de macromolculas desde la clula lo que debe afectar el comportamiento metablico de las mismas. El grado de produccin de coloides celulares, depende de la turbidez del medio. Por otra parte, los mostos con mayor cantidad de slidos permiten una mejor eliminacin del CO2 del tanque de fermentacin, moderando los efectos restrictivos que produce su acumulacin.

Slidos suspendidos y activacin


Son variados los materiales que se han testeados para evaluar su comportamiento activador de la fermentacin en mostos muy limpios.
Celulosa microcristalina Paredes de levaduras Bentonita Tierras de diatomeas

En otras industrias tambin se han obtenido datos semejantes: ejemplos son la industria de la cerveza, whisky y del ron.

Presencia de cido actico


Las elevadas presiones osmticas del medio fermentativo provoca modificaciones metablicas que generan concentraciones mas elevadas de c. actico. El cido actico es un cido dbil que por estar poco disociado en el vino puede traspasar las membranas de las clulas provocando una fuerte restriccin metablica por acidificacin del citoplasma) La presencia de cido actico reduce severamente la capacidad de Saccharomyces para utilizar y retener tiamina.

Fermentacin y levaduras saludables


Aspectos nutricionales
Fuentes Nutricin integral Reconocimiento de diferencias entre cepas

Momento de aplicacin de los complementos nutricionales Control de las bacterias lcticas (uso de lizosima) Aporte de oxigeno

Principales requerimientos nutricionales


Concentraciones moderadas de azucares (20 a 23 Brix) Nitrgeno asimilable por la levadura (YAN)
Orgnico simple Orgnico complejo

Micronutrientes
Vitaminas Minerales O2 durante las etapas de induccin fermentativa y de crecimiento exponencial.

Micronutrientes de importancia
Tiamina
Mejor crecimiento celular Menor sntesis de acetaldehdo Menor sntesis de acidez voltil

Biotina Pantotenato Inositol

Efecto sinrgico con el nitrgeno Mejora la cintica de la FA Aumenta la produccin de esteres Mejora la viabilidad el final de FA Mejora la cintica fermentativa Disminuye la produccin de acetaldehdo Disminuye la formacin de compuestos azufrados y de acidez voltil Esencial para la formacin de fosfolpidos de membrana

Estrs producidos por deficiencia de tiamina


Recientemente se ha demostrado que Kloeckera es muy eficiente en la absorcin de tiamina del mosto esto deja el mosto deficiente para las necesidades de Saccharomyces. De manera complementaria el SO2 reacciona con la tiamina reduciendo su disponibilidad. Estos factores pueden actuar de manera sinrgica en mostos con decantacin esttica que permitan el desarrollo de levaduras del genero Kloeckera.

Micronutrientes Minerales
Magnesio
Mejora resistencia al etanol temperatura y choque osmotico, aumenta el rendimeiento en etanol , relacion necesaria Ca:Mg < 1 Cofactor enzimatico de la glicolisissis, incrementa la tolerancia al alcohol regulacin en la produccin de productos secundarios de la FA (esteres, alcoholes, acidos grasos)

Zinc

Manganeso

Efecto sinrgico con el Zn, Disminuye los tiempos de generacin (tiempo entre dos reproducciones )

Cobre Potasio

Elemento esencial, pero toxico sobre 1-2 mg/L

Debe estar sobre los 300 mg/lL cuando los pH del mosto estan bajo los 3,3