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Por: ngel Josu Arteaga Garcs

La microscopia: es el conjunto de tcnicas y mtodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su pequeez estn fuera del rango de resolucin del ojo normal. Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopa, el uso del mismo requiere para producir las imgenes adecuadas, de todo un conjunto de mtodos y tcnicas afines pero extrnsecas al aparato.

La mayor parte de las muestras observadas con microscopa ptica son traslcidas o, en el caso de ser opacas, su superficie de reflexin no se encuentra perfectamente pulida. En ambos casos la luz interacciona con la muestra a varias profundidades por lo que la imagen que llega al observador presenta reas borrosas debidas a la luz procedente de zonas fuera del plano de enfoque, lo que produce una degradacin en el contraste y resolucin de la imagen.

La microscopa confocal Lser (CSLM) es una herramienta poderosa que permite generar imgenes de alta resolucin y permite realizar reconstrucciones 3D de un espcimen. El principio de la microscopa confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco Para ello se ilumina una pequea zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminndose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores .

Parte de la luz procedente de la fuente de iluminacin atraviesa un primer diafragma, es reflejada mediante un espejo dicroico y se enfoca en un punto del espcimen mediante la lente de un objetivo. La seal emitida por el punto iluminado (fluorescencia o luz reflejada) vuelve por el mismo camino ptico, pasa a travs del espejo dicroico y es enfocada en un detector, un segundo diafragma o pinhole es colocado delante del detector para eliminar las seales procedentes de la zona fuera de foco .

El principio del funcionamiento del Microscopio Confocal se basa en la existencia de dos diafragmas (pinhole), uno entre la fuente de luz y el objetivo y el otro entre el objetivo y el detector. Ambos pinhole deben de estar perfectamente alineados de forma que el segundo de ellos nicamente deje llegar al detector la luz procedente del plano focal.La utilizacin de un lser como fuente de luz permite focalizar la iluminacin en una regin muy pequea de la muestra y con una gran intensidad.

Normalmente un microscopio conofocal viene con varios lser que tienen una o varias lneas de emisin: Argn (458, 476, 488, 496 y 514nm), Helio-Nen (543nm), Helio-Nen (633nm), Diodo azul (405 nm).

Fotomultiplicador que abarca un espectro de 185 a 930nm, fuera de este intervalo se han reportado defectos en la visualizacin del contraste en las imgenes proporcionadas. La calidad de la seal captada por el detector depende directamente el diafragma o pinhole que se sita antes del detector. Este ultimo es el responsable de evitar que la luz dispersada pase hacia el detector, dejando as solo la seal emitida por la muestra en foco.

La seal es enviada del fotomultiplicador al ordenador, quien procesa los datos enviados y los transforma en una imagen que es proyectada en el monitor. Existen diferentes maneras en las que se puede generar una imagen, ya sea con alta o baja fluorescencia , utilizando sustancias marcadoras como fluorocromos las cuales pueden ser selectivas para detectar con mayor nitidez cierta caracteristica o sustancia de una muestra en estudio.

Para poder tener una buena visin de la muestras a analizar es necesario tener las muestras preparadas de una forma correcta dependiendo de lo que se desee analizar. En el caso de clulas de origen microbiano, lo ideal es tenerlas en un soporte solido, como agar, este a su vez se puede acondicionar a distintos adaptadores que permitirn al aparato realizar una deteccin oportuna de la imagen.

Mayor contraste: Debido a que se elimina la luz procedente de las zonas fuera de foco. Posibilidad de realizar secciones opticas: Variando el plano de enfoque el sistema es capaz de tomar imgenes a diferente profundidad. Lo que permite obtener informacin tridimensional de la muestra. Anlisis de imgenes: Al obtenerse la imagen de modo electrnico es posible digitalizarla y aplicar sobre ella toda una serie de tcnicas de anlisis de imgenes como: realce de imgenes, para mejorar su calidad, combinacin de imgenes para comparar cambios en el tiempo, medida de intensidades, medidas morfomtricas, etc.

Reconstruccin 3D: A partir de las secciones pticas es posible aplicar tcnicas de reconstruccin 3D que nos permitan visualizar las estructuras. Imgenes multidimensionales: El microscopio confocal nos permite estudiar imgenes en 2 y 3 dimensiones a lo largo del tiempo. Es posible programar el equipo para obtener imgenes durante un periodo de tiempo determinado.

La microscopa confocal es muy til para el estudio de muchos problemas en biologa, permitiendo un nuevo conocimiento de la estructura celular y sus procesos. Entre otras aplicaciones la microscopa confocal se utiliza en: estudios de estructura celular y citoesqueleto, medida de actividad intracelular (pH e iones), produccin de reconstrucciones tridimensionales, etc.