Immobilized enzymes: Theory, methods of study and applications

RESUMEN
En esta revisin se analizan los diferentes mtodos de inmovilizacin de enzimas, y el efecto sobre las propiedades catalticas y la estabilidad de los biocatalizadores obtenidos.

INTRODUCCIN
En los ltimos aos, la biotecnologa ha experimentado grandes avances y, paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtencin de productos qumicos, en la industria alimentaria y farmacutica.

Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biolgicos

Presentan una gran actividad cataltica; Muestran una gran especificidad estereoselectividad y regioespecificidad); de sustrato (incluso

Son muy activos a temperatura ambiente y presin atmosfrica. El empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos qumicos industriales debido a que la mayora de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Al ser solubles en agua, su separacin de los sustratos y productos es difcil, y por tanto, no se pueden reutilizar. Con la inmovilizacin de las enzimas se han podido superar estos ltimos inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea econmicamente rentable.

ASPECTOS GENERALES SOBRE LA INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

La inmovilizacin de enzimas es un proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas por su unin a un soporte.

VENTAJAS
1. El aumento de la estabilidad de la enzima; 2. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso. 3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada.

INCONVENIENTES
1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo. 2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente nmero de

uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la movilizacin. 4. El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.

Los mtodos de inmovilizacin se suelen clasificar en dos grandes categoras: 1) Retencin fsica y 2) unin qumica

MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA

ATRAPAMIENTO
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano.
El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico.

El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles.

El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos.

La enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura.

El atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena.

INCLUSIN EN MEMBRANAS:

Microencapsulacin : Las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas permanentes. semipermeables pueden ser permanentes o no

Las microcpsulas obtenidas son de forma comprendidos entre 1 y 100 m de dimetro.

esfrica,

con

tamaos

Mediante este mtodo se pueden encapsular simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en mltiples pasos

Reactores de membrana : Estos reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de sustrato que atraviesa el reactor. Se procede inicialmente a la adsorcin de la enzima sobre la membrana que formar el reactor. Esta adsorcin se puede realizar de dos formas:

1. mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a travs de la membrana; 2. por contacto continuo de una solucin de enzima con la membrana.

MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR UNIN QUMICA

Unin a soportes
La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador.

Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ampli el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles

contaminaciones microbianas.

El soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado.

Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:

1. Soportes inrganicos: pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pmez, slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no poroso, almina, cermicas, gel de slice, etc.) 2. Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en: Polmeros naturales: a su vez divididos en: polisacridos (celulosa, almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc). protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc). Polmeros sintticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno) Polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol polivinlico, poliamidas, etc). Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorcin o por unin covalente

Adsorcin
En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrgeno. Los principales factores que influyen en la adsorcin, son: 1. el pH del medio : controla el nmero y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la protena y del slido;

2. la fuerza inica : al aumentar la fuerza inica se produce la desorcin de la enzima, ya que los iones inorgnicos se unen con ms fuerza al soporte que la protena;
3. el dimetro de poro : debe ser aproximadamente dos veces el tamao del eje mayor de la enzima; 4. la presencia de iones que acten como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementar la carga enzimtica del derivado.

Unin covalente
La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas.
De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. El resto de aminocidos, debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unin covalente.

Reticulado

Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas.

El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas de enzima.

Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehdos, diiminosteres,

diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si estn activadas con

carbodiimida.

El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.

El co-reticulado , permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una protena sin actividad enzimtica y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albmina bovina).

Un procedimiento mixto de inmovilizacin muy comn consiste en inmovilizar la enzima por adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un soporte polimrico (con lo que se consigue una elevada carga enzimtica) y posteriormente aadir el reactivo bifuncional.

El mtodo ms novedoso de cross-linking consiste en la cristalizacin de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehdo. El aumento de estabilidad se basa en la obtencin de un entramado cristalino, donde las molculas de enzima estn rodeadas exclusivamente por otras molculas de protena. De esta manera la propia enzima acta como soporte, y su estructura terciaria est estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscpicos (20-50) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la reaccin. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH extremos, as como la accin de las proteasas. Esta tecnologa se ha aplicado a enzimas muy diferentes, las cuales se han utilizado en la obtencin de compuestos enatiomricamente puros y en la sntesis de pptidos.

EFECTOS DE LA INMOVILIZACIN
La inmovilizacin altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad.

En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual

todos los componentes que intervienen en el proceso cataltico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reaccin y en la fase constituida por el soporte con la enzima.

Como consecuencia, la actividad enzimtica se ve afectada por efectos de tipo

difusional, estrico y del microentorno.

Efectos en la estabilidad
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas despus de su inmovilizacin, que se debe principalmente a las siguientes razones:

1. Una estabilizacin conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones multipuntuales enzima-sopor-te. La estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se hace ms resistente a la desactivacin trmica o qumica.
Este tipo de estabilizacin se obtiene nicamente en aquellos mtodos en los que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unin a soportes activados. La inmovilizacin covalente multipuntual se puede combinar con la adicin de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de la enzima.

2. Una proteccin frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unin de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteoltica, y evita su autolisis.

3. Se evita la agregacin intermolecular al mantener las molculas de enzima retenidas en una determinada regin del espacio.

4. Existe una alteracin del microentorno del enzima debida a la interaccin de la enzima con el soporte.

Efectos en la actividad enzimtica

Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversasrazones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica puede ser debido a que: 1. la unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo est impedido,

2. los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad cataltica de la enzima,
3. la inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva 4. las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalizacin o desactivacin de la enzima.

Si la prdida de actividad no es total despus de la inmovilizacin, los cambios (disminucin o aumento de la actividad enzimtica) se debern principalmente a efectos difusionales, electrostticos, estricos y/o del microentorno.

1) Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilizacin, la difusin de los sustratos haciael centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e interno. a) resistencias difusionales externas : si el soporte es insoluble en el medio de reaccin, el sustrato deber atravesar la pelcula lquida estacionaria (capa de Nernst o de disfusin) que rodea el soporte. En las proximidades de un soporte no cargado, la concentracin de sustrato es menor que en el resto de la disolucin, puesto que existe un gradiente de concentracin a travs de la zona de difusin. Por tanto, los valores de km para las enzimas inmovilizadas son siempre aparentes (km) b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada.

2) Efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si tienen la misma carga existe una repulsin mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atraccin. Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en disolucin. Hornby y cols. desarrollaron una expresin matemtica que permite calcular la actividad de las enzimas inmovilizadas, teniendo en cuenta tanto los factores de difusin como los electrostticos. La expresin de Michaelis-Menten en este caso es:

donde x=espesor de la capa de Nernst; D=coeficiente de difusin; T=temperatura (K); z=valencia del sustrato; F=constante de Faraday; R=constante universal de los gases y V=gradiente de potencial en el soporte.

3) Impedimentos estricos o de tamao de sustrato. En un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una prdida apreciable de su actividad. Este hecho suele ser vlido en el caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye drsticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas unidas covalentemente a soportes slidos, a pesar de que son muy activas frente a sustratos pequeos, muestran una actividad muy baja hacia protenas, polisacridos y cidos nucleicos. Este efecto estrico se puede evitar mediante una inmovilizacin covalente a travs de un brazo espaciador enzima-soporte ms largo.

4) Efectos en el microentorno: La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados elctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH ptimo de la catlisis enzimtica y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar.

Por ejemplo, una enzima unida a un soporte cargado negativamente tendr en su microentorno una concentracin mayor de hidrogeniones que en el medio de reaccin.
Como resultado, la enzima inmovilizada ser ms activa a un pH ms alcalino. La enzima sera ms activa a pH ms cidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente

ELECCIN DEL MTODO DE INMOVILIZACIN

Se pueden hacer generalizaciones sobre cada mtodo de inmovilizacin y as, seleccionar el ms adecuado para cada aplicacin especfica. La eleccin ha de tener en cuenta las condiciones de la reaccin biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros factores.

Los mtodos de preparacin difcil y de mayor coste proporcionan biocatalizadores ms estables y duraderos; en cambio aquellos mtodos ms sencillos como el atrapamiento o la adsorcin, donde la unin de la enzima con el soporte es dbil, originan derivados inmovilizados que presentan prdidas de actividad y que deben ser repuestos

continuamente.

Una vez elegido el mtodo ms conveniente, los derivados que preparemos deben estar caracterizados segn las indicaciones establecidas

APLICACIONES DE LA ENZIMAS INMOVILIZADAS

Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en: 1. Aplicaciones analticas: biosensores 2. Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas 3. Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica, alimentaria

y de tratamiento de residuos.

Biosensores
Los biosensores se estn convirtiendo en una herramienta imprescindible en medicina, en el control de calidad de los alimentos y en el control medioambiental

El biosensor contiene una molcula biolgica inmovilizada (enzimas, clulas, anticuerpos) prxima a un traductor que, en contacto con el analito, transformar la seal qumica producida en una seal elctrica o de otro tipo (ptica, calorimtrica, acstica, etc.)

Aplicaciones de los biosensores:

Los biosensores son de gran utilidad en el campo del diagnstico clnico. Los niveles sricos de glucosa, lactato y cido rico se pueden detectar mediante electrodos enzimticos disponibles comercialmente. Actualmente, el desarrollo de nuevos biosensores va dirigido a la deteccin de frmacos, clulas y virus patgenos.

En el caso del control de calidad en las industrias alimentarias, los biosensores pueden determinar el grado de contaminacin microbiana, o por ejemplo, cuantificar el azcar presente en bebidas.

Los biosensores pueden ser muy tiles en el control de la polucin del medioambiente. Los analizadores de contaminantes en el agua se basan en el empleo de biosensores capaces de detectar la presencia de residuos txicos, pesticidas, herbicidas o microorganismos.

Aplicaciones mdicas
Existen muchas enfermedades causadas por una alteracin o carencia de una determinada enzima. Tambin hay enzimas con actividad antitumoral, cicatrizante y con otras acciones teraputicas. El tratamiento con estas enzimas inmovilizadas permitira una accin ms prolongada, ya que seran ms resistente a la accin de las proteasas. Por ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de leucemias y cnceres diseminados que requieren asparagina para desarrollarse. En la actualidad se ha diseado un hemodializador de fibra hueca que contiene asparaginasa inmovilizada. La tripsina o la colagenasa se utilizan para eliminar los tejidos muertos de heridas, quemaduras, lceras, etc.; para acelerar el crecimiento de nuevos tejidos e injertos de piel, y tambin para inhibir el crecimiento de algunos microorganismos contaminantes. Este tipo de enzimas se pueden inmovilizar en celulosas o fibras que formarn parte del tejido de apsitos y vendas

Aplicaciones en la Industria Farmacutica

La Industria Farmacutica trabaja con molculas lbiles, y en muchos casos con molculas quirales.

El empleo de enzimas inmovilizadas es una alternativa seria a la sntesis qumica en pasos clave, donde no conviene trabajar a temperaturas altas o se requiere una elevada especificidad de sustrato.
Los enzimas son unos reactivos quirales estrictos, es decir, biocatalizadores con una estructura tridimensional asimtrica definida que permiten la obtencin de productos de gran pureza ptica. Se trata de una ventaja fundamental cuando las reglamentaciones exigen la sntesis de compuestos pticamente puros, ya sean frmacos, hormonas o antibiticos.

Aplicaciones en la Industria Alimentaria

1) En la hidrlisis de protenas:
Las enzimas proteolticas se emplean en la modificacin del contenido proteico de los alimentos. De esta forma se han conseguido hidrolizados de protenas de trigo mediante el uso de pepsina y proteasa coinmovilizadas en chitosan. Otras proteasas inmovilizadas han sido empleadas en la disminucin del contenido de lactoglobulina en la leche, en la industria quesera y en la solubilizacin de concentrados protenicos de pescado. 2) En la hidrlisis de hidratos de carbono: La presencia de lactosa en la leche (4,3-4,5%) y en algunos derivados lcteos es perjudicial para aquellas personas que carecen de lactasa intestinal, y su ingesta provoca diarreas y diversos trastornos intestinales. La eliminacin de este azcar se puede conseguir tratando la leche con galactosidasa de levaduras inmovilizada en fibras de acetato de celulosa y es de gran importancia en la preparacin de productos lcteos dietticos.

3) En la mejora de las caractersticas organolpticas de ciertos alimentos El empleo de clulas de Arthobacter Globilis atrapadas en poliacrilamida permite eliminar el sabor amargo del zumo de los ctricos. Las clulas de Leuconostoc oenos inmovilizadas en alginato se han utilizado en la desacidificacin del vino. Endo--glucosidasas inmovilizadas en esferas acrlicas permiten incrementar el aroma de vinos y zumos.

Tratamientos de aguas residuales

Se ha desarrollado un mtodo para la reduccin de nitratos a nitritos en aguas residuales que emplea enzimas inmovilizadas. El benceno es otro compuesto muy txico que puede ser degradado mediante clulas de Pseudomonas putida atrapadas en geles de poliacrilamida

CONCLUSIN
La inmovilizacin de enzimas permite una mejora significativa de su estabilidad, lo que hace posible su empleo en la produccin industrial de Productos qumicos, farmaceticos, Alimentos En el tratamiento de residuos Tratamiento de enfermedades.