INTRODUCCIN

CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)

Separacin de biomolculas

protenas pptidos aminocidos lpidos ADN/ARN

Mikhail Tswett 1906

en funcin de su diferente distribucin en dos FASES (siempre!)

anlisis y purificacin

F. MVIL: (solvente) F. ESTACIONARIA:

lquido gas slida lquida

B
FASE MVIL FASE ESTACIONARIA

 Separacin de los componentes de una muestra. Los componentes de una mezcla son distribuidos entre dos fases: una es estacionaria, mientras que la otra es mvil. La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido soportado en un slido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una pelcula, etc...

 Separacin entre dos sustancias comienza cuando una es retenida ms fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse ms rpidamente en la fase mvil. Las retenciones pueden tener su origen en dos fenmenos de interaccin que se dan entre las dos fases: Adsorcin: que es la retencin de una especie qumica por parte de los puntos activos de la superficie de un slido quedando delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. Absorcin: que es la retencin de una especie qumica por parte de una masa y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla o a reaccionar qumicamente con la misma.

 Sistema de separacin dinmica, porque contnuamente se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a separar y las fases mvil y estacionaria. La fase estacionaria consiste en partculas, generalmente slidas, pequeas y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa La fase mvil puede ser un lquido o un gas, y su funcin es transportar a los componentes de la mezcla a travs del sistema cromatogrfico.

 Separacin : competicin entre la fase mvil y la fase estacionaria por el componente, particin del componente distribuido entre las dos fases. Se establece un equilibrio entre la concentracin del componente presente en la fase mvil y la concentracin presente en la fase estacionaria. La diferencia depender de las propiedades fsicas y qumicas de los componentes. El mayor o menor avance en el sistema cromatogrfico depender de la afinidad del componente y la fase estacionaria. Componente con menor afinidad por la fase estacionaria en presencia de una fase mvil llamada eluyente ser eluido en primer lugar, y por tanto se desplazar con mayor velocidad por el sistema cromatogrfico.

CLASIFICACIN
3 CRITERIOS

1- Segn el estado fsico de la fase mvil:

FASE MVIL lquido Cromatografa de LQUIDOS gas Cromatografa de GASES

2- Segn la causa por la que se separan los componentes de la muestra (relacionado con las propiedades fsicas de las biomolculas): Solubilidad Tamao Carga Hidrofobicidad Interacciones por afinidad biolgica Interacciones inespecficas

3- Segn la metodologa utilizada para el desarrollo de la cromatografa (relacionado con la fase estacionaria):

FASE ESTACIONARIA

Sobre superficie plana: planar En columna

TIPOS DE CROMATOGRAFA
Fase mvil Fase estac. Clase Tipo (propiedad) Solubilidad Nombre Fase normal Fase inversa Ejemplo EN PAPEL

Lquida Lquida Reparto

Tamao

Exclusin

GEL FILTRACIN

Slida

Adsorcin (NO absorcin!)

Interacciones electrostticas
Hidrofobicidad

Intercambio inico Interaccin Hidrofbica Afinidad

INTERCAMBIO INICO EN CAPA FINA o TLC HIDROFBICA AFINIDAD (GST)

Interacciones por afinidad Interacciones inespecficas

Adsorcin

HIDROXIAPATITO

CROMATOGRAFA EN SUPERFICIE PLANA

F. ESTACIONARIA (polar) CMARA CROMATOGRFICA

MUESTRA

FLUJO propiciado por CAPILARIDAD

FRENTE de avance del solvente

FASE MVIL (apolar)

hidrofbica

Rf=

distancia avanzada por la molcula

distancia avanzada por el frente

hidroflica

Rf es caracterstico para cada soluto para una composicin dada de fase mvil y un determinado tipo de superficie

CROMATOGRAFA EN PAPEL
PROPIEDAD: Solubilidad SOPORTE celulosa del papel F. ESTACIONARIA (LQUIDA) H2O absorbida en la celulosa. F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

H 2O H 2O

H 2O HHH 2O

H 2O
H 2O

H 2O
H 2O

HH 2O

H 2O

H 2O

Molec. Hidroflica LENTA Retenida por f.estacionaria

Molec. Hidrofbica RPIDA Disuelta en f. mvil

 Aplicacin de la muestra

Los compuestos a separar se disolvern en un solvente orgnico con punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore despus de la aplicacin
mezcla cloroformo: metanol (1:1) disoluciones al 1% de las muestras, aplicar 2 l,carga 20 g de producto slido Siembra: micropipetas y tubos capilares Se realiza tocando con la punta del capilar sobre el papel cromatogrfico dejando una distancia al borde inferior y entre muestras de un centmetro aproximadamente

Se deja secar para evaporar el disolvente, solo quedar la muestra a analizar

 La eleccin del eluyente o fase mvil depender lgicamente del componente que se va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad: Eter de petrleo Eter dietlico Ciclohexano Acetato de etilo Tetracloruro de carbono Piridina Benceno Etanol Cloroformo Metanol Diclorometano Agua cido actico

 Desarrollo de la cromatografa Ascendente: el eluyente asciende en forma vertical, por la accin de la capilaridad La cromatografa se realiza en una cuba. El eluyente se introduce en la cmara una hora antes del desarrollo, para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo suele ser corto en analtica, en cromatografa preparativa puede llevar horas. una

La cromatografa puede desarrollarse durante un tiempo prefijado o hasta que se alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen para estandarizar los valores de RF. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde

Se deja secar el papel por accin del aire

 Localizacin de sustancias o revelado

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dichos compuestos: Mtodos qumicos Mtodos fsicos

Mtodos qumicos
Reaccin qumica entre un reactivo revelador y los componentes separados. Se pulveriza con los reactivos reveladores en posicin horizontal y bajo campana. Por baado del papel sumergindolo en un recipiente adecuado con el revelador.

 Reveladores generales
Reactivo yodo: forma complejos coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn). Las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas: reversible y no destructivo Acido sulfrico: reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras: Irreversible y destructivo

Reveladores especficos
2,4 dinitrofenilhidracina: para aldehidos y cetonas Verde de bromocresol: para cidos carboxlicos Paradimetil aminobenzaldehido: para aminas Ninhidrina: para aminocidos

 Mtodos fsicos
Al colocar el cromatograma bajo una lmpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes.

 Constantes Rf y Rx
RF (Ratio of Front) es una manera de expresar la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha.

RF reproducibles: deben fijarse tipo de papel, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra.
mximo valor de RF: es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

(TLC)

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)

PROPIEDAD: Hidrofobicidad

SOPORTE plancha de metal o vidrio

F. ESTACIONARIA (SLIDA) slido pulverizado sobre plancha de metal o vidrio. El ms usado es el gel de slica.

F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

-Si-OH -Si-OH -Si-OH -Si-OH -Si-OH HHH-Si-OH -Si-OH -Si-OH -Si-OH -Si-OH

Molec. Hidroflica LENTA Retenida por f. estacionaria

Molec. Hidrofbica RPIDA Disuelta en f. mvil

 Adsorbente: cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte.

Se le puede aadir un adherente (yeso). Adsorbentes ms utilizados son: Celulosa Almidn Azucares Gel de slice (silicagel) xido de aluminio (almina) Carbn activo (carbn en polvo)

 Gel de slice o silicagel es uno de los ms utilizados. pH entre 4-5 tamao del grano de 10 a 40 tamao de poro de 20 a 150 Agente aglomerante: firmeza al adsorbente Adsorbente polar Puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH de forma que se haga apto para separar componentes lipoflicos (esteroides, cidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles). Proceso llamado cromatografa de fase reversa yeso (sulfato de clcico) proporciona

 La almina u xido de aluminio Adsorbente ligeramente bsico debido a la presencia molculas de hidrxido de aluminio adheridas a la almina. de

Puede ser tratada qumicamente para conseguir alminas cidas, bsicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas.

adsorbente de carcter polar, retendr con mayor avidez a los componentes polares.

 El adsorbente se prepara en agua destilada. Proporcin : dos partes de agua y una de adsorbente. Ver fabricante Soporte del adsorbente lminas de vidrio El espesor de la placa en general suele ser de:

0.1-0.2 mm. para separaciones analticas 0.5- 2 mm. para separaciones preparativas
La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades Se dejan reposar Activar el adsorbente: dejar las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente o calentar 30 minutos a 105-110 C

 Aplicacin de la muestra

Los compuestos a separar se disolvern en un solvente orgnico no polar que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore despus de la aplicacin
mezcla cloroformo: metanol (1:1) disoluciones al 1% de las muestras, aplicar 2 l,carga 20 g de producto slido Siembra: micropipetas y tubos capilares Se realiza tocando con la punta del capilar sobre la placa preparada dejando una distancia al borde inferior y entre muestras de un centmetro aproximadamente

Se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedar la muestra a analizar

 La eleccin del eluyente o fase mvil depender lgicamente del componente que se va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad: Eter de petrleo Eter dietlico Ciclohexano Acetato de etilo Tetracloruro de carbono Piridina Benceno Etanol Cloroformo Metanol Diclorometano Agua cido actico

 Desarrollo de la cromatografa Ascendente: el eluyente asciende por una placa vertical, por la accin de la capilaridad La cromatografa se realiza en una cuba. El eluyente se introduce en la cmara una hora antes del desarrollo, para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo suele ser corto en analtica, en cromatografa preparativa puede llevar horas. una

Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado o hasta que se alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen para estandarizar los valores de RF. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa. Se deja secar la placa por accin del aire

 Localizacin de sustancias o revelado

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dichos compuestos: Mtodos qumicos Mtodos fsicos

Mtodos qumicos
Reaccin qumica entre un reactivo revelador y los componentes separados. Se pulveriza la placa con los reactivos reveladores en posicin horizontal y bajo campana. En cromatografa en capa fina no puede realizarse el baado del cromatograma, en cromatografa en papel s.

 Reveladores generales
Reactivo yodo: forma complejos coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn). Las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas: reversible y no destructivo Acido sulfrico: reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras: Irreversible y destructivo

Reveladores especficos
2,4 dinitrofenilhidracina: para aldehidos y cetonas Verde de bromocresol: para cidos carboxlicos Paradimetil aminobenzaldehido: para aminas Ninhidrina: para aminocidos

 Mtodos fsicos
El ms comn: aadir al adsorbente un indicador fluorescente. Al colocar la placa bajo una lmpara dependiendo del indicador y de la longitud de manchas fluorescentes en las zonas en componentes, o en otros casos aparece fluorescente excepto donde hay componentes. ultravioleta, y onda, aparecen las que hay toda la placa

 Constantes Rf y Rx
RF (Ratio of Front) es una manera de expresar la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha.

RF reproducibles: deben fijarse Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra.
mximo valor de RF: es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
EMPAQUETADO COLUMNA APLICACIN MUESTRA ELUCIN Y RECOGIDA DE FRACCIONES RESERVORIO f. mvil

LECHO CROMATOGRFICO f. estacionaria COLUMNA MUESTRA

FLUJO gravedad

DIFUSIN
llave

SEPARACIN

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
PERFIL DE ELUCIN

FRACCIONES

Molc. distribuida en f.mvil

Molc. distribuida en f.estacionaria

ANLISIS DEL CONTENIDO DE LAS FRACCIONES

Espectrofotomtrico Abs 280nm Protenas Otras Abs - Colorantes

respuesta del detector 1

fraccin

CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN

PROPIEDAD: Tamao (y forma)

SOPORTE Resina de micropartculas esfricas formadas por polmeros hidroflicos: dextrano, agarosa, poliacrilamida o mezcla de ellos Tamaos de poro intervalo o rango de fraccionamiento.

FASE MVIL

Sephadex G25: 1000 5000 Da Sephadex G200: 5000 250000 Da

MICROPARTCULAS

F. ESTACIONARIA LQUIDA solvente acuoso (el mismo que el de la fase mvil) que se encuentra dentro de micropartculas. F. MVIL LQUIDA solvente acuoso que atraviesa la columna por los espacios intersticiales (entre las micropartculas).

F. ESTACIONARIA

CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN

Molec. GRANDES RPIDAS Avanzan con mayor velocidad a travs de los espacios intersticiales: afinidad con fase mvil Molec. PEQUEAS LENTAS Son retenidas por las fibras de las micropartculas y avanzan con menos velocidad: afinidad con fase estacionaria
PERFIL DE ELUCIN
APLICACIN MUESTRA
respuesta del detector

grande

pequea

ELUCIN

8 9 fraccin

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

PROPIEDAD: Interacciones electrostticas (carga)

SOPORTE Resina de micropartculas formadas por polmeros sintticos o naturales (dextranos, celulosas, agarosa).
F. ESTACIONARIA SLIDA Grupos con cargas inicas unidos al soporte Carga positiva (+) intercambiadores de aniones (-): cromatografa intercambio aninica Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+): cromatografa intercambio catinica F. MOVIL LQUIDA Solvente que anula la interaccin electrosttica.
FASE MVIL

F. ESTACIONARIA MICROPARTCULAS

2 posibilidades: Gradientes de pH cambio de carga de las molculas de la muestra Gradientes inicos (salinos) competencia por grupos electrfilos

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

Gradiente de pH Gradiente salino Molec. CARGA (-) NO SE RETIENEN Molec. MENOR CARGA (+) RPIDAS Son desplazadas ms fcilmente por la fase mvil

Molec. MAYOR CARGA (+) LENTAS

Son retenidas por los grupos cargados inicamente de la fase estacionaria PERFIL DE ELUCIN
APLICACIN MUESTRA
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO CATINICO

q+

respuesta del detector

Q+
+ Na+ -

ELUCIN

8 9 fraccin

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
PROPIEDAD: Interacciones especficas entre dos molculas hormona-receptor protena-metal o cofactores como ATP antgeno-anticuerpo

SOPORTE Matriz de micropartculas hidroflicas sin carga, con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrlica).
F. ESTACIONARIA SLIDA Ligandos (grupos qumicos) especficos unidos a la matriz -- Comerciales: Concavalina A une glicoprotenas Protena A une IgG (anticuerpos) -- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz F. MVIL LQUIDA Solucin que anula o disminuye la afinidad con el ligando de la fase estacionaria.

FASE MVIL

F. ESTACIONARIA MICROPARTCULAS

-- Solucin con el propio ligando Molcula + ligando libre -- Solucin con algo que interacciona con el ligando Molcula

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Molec. NO INTERACCIN RPIDAS No se unen al ligando de la fase estacionaria Molec. INTERACCIN LENTAS Se unen al ligando de la fase estacionaria Elucin especfica. PERFIL DE ELUCIN
LAVADO respuesta del detector ELUCIN ESPECFICA

molcula

APLICACIN MUESTRA LAVADO ELUCIN ESPECFICA

8 9 fraccin

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Sistema GST (Glutatin-S-Transferasa)
GST
Protena X
Glut Purificacin de PROTENAS RECOMBINANTES Cualquier protena marcada con etiqueta GST

ELUCIN

Glut

Glut GST

Glut

APLICACIN MUESTRA

Glut GST