Tincin de Gram

J. Granado

La tincin de Gram
Su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884.

Sigui el mtodo de Paul Ehrlich, utilizando una solucin de anilina y violeta de genciana. Despus un tratamiento con lugol (iodo en yoduro potsico acuoso) y etanol observ que algunas bacterias retenan el colorante (por ejemplo los neumococos) mientras que otras no lo hacan. Esto permiti dividir las bacterias en Gram-positivas y en Gram-negativas, clasificacin que es de gran utilidad hoy da para elegir un tratamiento antibitico.

La tincin de Gram
Es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas.

Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria GRAM POSITIVA a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria GRAM NEGATIVA a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

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Materiales usados para la Tincin de Gram

Microscopio ptico Colorantes para Tincin de Gram Mechero Bunsen Asa de digralsky Pizeta (Recipiente de plstico para las tinciones) Muestra de Cultivos bacterianos Aceite de inmersin (Es til ya que
disminuye la refraccin, y se consigue mayor resolucin a dems de una mejor imagen.)

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Pasos para la fijacin de Frotis

1. Con la ayuda de un mechero, flamear un asa de digralsky y esperar que enfre un poco. 2. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. 3. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa.

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Pasos para la fijacin de Frotis

4. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. 5. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en
el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

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Pasos para la Tincin de Gram

Tincin Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C.

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Pasos para la Tincin de Gram

Enjuague Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra.
1. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. 2. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo 3. La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% .

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Pasos para la Tincin de Gram

Mordiente

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 3 minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias..

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Pasos para la Tincin de Gram

Decoloracin

Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, (hasta que ya no escurra
ms lquido azul.)

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Pasos para la Tincin de Gram

Lavado y secado
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

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Pasos para la Tincin de Gram Tincin de contraste Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Esto es para teir las bacterias que fueron decoloradas con el alcohol-acetona; en cierto modo esta tincin son para las bacterias Gram negativo

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Pasos para la Tincin de Gram

Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.

De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

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Tincin de las Bacterias

Las bacterias se tien Gram positivas (+), Gram negativas () o no se tien debido a sus diferencias en la composicin de su pared y arquitectura celular.

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Tincin de las Bacterias

Las bacterias Gram Positivo tienen una gruesa capa de pptidoglucano y gran cantidad de cidos teicicos que no son afectados por la decoloracin con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizndose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular est intacta o daada.

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Tincin de las Bacterias Las bacterias Gram negativo tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por molculas de lipopolisacridos. Esta membrana externa es daada por el alcohol y/o acetona de la decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el colorante de contraste.

La tincin de Gram (Resultados)

Resultado Gram
Positivo: de violeta fuerte a azul claro. Negativo: rosa o rojo (en el caso de carbol-fucsina el rojo ser intenso). Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser debido a una mala extensin, fijacin o tincin, presencia de clulas viejas, dao en la pared celular o por particularidades especiales de la pared celular de ciertos microorganismos. Neutro: no toman ningn color, siendo generalmente el fondo alrededor de ellos de un ligero Gram (-). Otras caractersticas: a examinar en el Gram son si la tincin de los microorganismos es homognea, bipolar, en cuentas o gotas, punteada, en barras o irregular.

La tincin de Gram (Resultados)

Su forma Totales: cocos, cocoides, cocobacilares, bacilos, filamentosos (ramificados o no) y levaduriformes. Extremos: redondeados, afilados, romos, en forma de palo de tambor o inflado (por vacuolas, esporas, acmulos de cualquier naturaleza) y cncavos. Lados: paralelos, ovoides, cncavos e irregulares.

Eje mayor: recto, curvado o en espiral.

Pleomorfismos: variacin en la forma de un mismo conjunto de microorganismos. Ocurre en algunas espcies de difteromorfos, Bacteroides spp., filamentosos ramificados (Actinomyces spp, ), por tratamientos antibiticos

La tincin de Gram (Resultados)

Tamaos: Teniendo en cuenta que el tamao medio de un hemate es de 7 mm y el de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos polimorfonucleares son de 0,2-0,3 mm:

Totales: minsculo (< 0,3 mm), pequeo (0,3-0,5 mm), medio y grande. Longitud: corto (0,5-1 mm), medio, largo y filamentoso (10-30 mm). Anchura: delgado, medio y grueso. Pleomrficos: variacin en el tamao de un mismo conjunto de bacterias.

La tincin de Gram (Resultados)

Caractersticas agrupacionales: Microorganismos aislados, en pares, en cadenas, ttradas, en grupo o arracimados, en empalizada, en letras chinas, empaquetados, en formas angulares tipo V o L

Gracias
"Muchas veces, cuando creemos estar realizando una experiencia sobre los dems, la estamos verificando sobre nosotros mismos.
Oscar Wilde