Albert Einstein desarroll en 1905 la

teora de que la luz estaba compuesta de unas partculas denominadas fotones, cuya energa era inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz.

La luz tiene una naturaleza dual: Como onda Como una corriente de partculas o paquetes de energa (fotones)

La Luz Como una Onda

La luz se puede imaginar como una onda electromagntica propagndose. La onda viaja a la velocidad mxima permitida en el vaco (c = 3x108 m/s).

Los campos elctricos y magnticos oscilan y son perpendiculares el uno con el otro.

La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama longitud de onda ( = lambda).

Longitud de onda = velocidad de propagacin / frecuencia

l= c / u .

Se denomina espectro electromagntico al conjunto de ondas electromagnticas o, ms concretamente, a la radiacin electromagntica que emite (espectro de emisin) o absorbe (espectro de absorcin) una sustancia

La luz blanca: esta compuesta por siete colores que podemos percibir con nuestro propio sentido de la vista. Estos colores son: rojo , anaranjado, amarillo, verde, azul, ndigo y violeta.

Cuando una molcula absorbe ciertas longitudes de onda de luz visible y transmite o refleja otras, la molcula tiene un color

El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre

ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos

aquellas longitudes de onda no absorbida

La luz blanca est compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la longitud de onda

RADIACIONES ELECTROMAGNETICAS

Son una forma de propagacin de energa a travs del espacio sin necesidad de un medio material. Abarcan un espectro muy amplio de tipo de onda, desde las microondas hasta los rayos X y gamma, pasando por la luz visible.

Los rayos X son radiaciones electromagnticas de alta frecuencia y alta energa (mayor a 1 Kev).

Rayos Gamma Rayos X Luz Ultravioleta Luz Visible Luz Infrarroja (fotogrfica) Infrarrojo Cercano Infrarrojo Lejano Microondas (ondas de radar) Frecuencias Elevadas (televisin) Onda corta de radio. Banda de control aeronutico Onda larga de radio

La Luz: Radiacin Electromagntica

Todas las longitudes de onda (o energas) de la luz son del mismo ingrediente bsico. Todas constituyen el espectro electromagntico. La luz visible es solamente una porcin muy pequea de ste. Aunque nuestros ojos no pueden detectar el resto del espectro, actualmente se tienen detectores que si lo pueden hacer. Nosotros le hemos asignado nombres a los diferentes colores y usado diferentes unidades para las diferentes longitudes de onda. Cuanlquiera de los dos es conveniente.

20

La luz blanca produce al descomponerla lo que se llama un espectro continuo, que contiene el conjunto de colores que corresponde a la gama de longitudes de onda que la integran

. Dicha

radiacin sirve para identificar la sustancia de manera anloga a una huella dactilar. Los espectros se pueden observar mediante espectrofotometros que, adems de permitir observar el espectro, permiten realizar medidas sobre ste, como la longitud de onda o la frecuencia de la radiacin

Cuanto ms larga la longitud de onda de la luz visible tanto ms rojo el color. Asimismo las longitudes e onda corta estn en la zona violeta del espectro.

Color del filtro

Rango espectral
400-465

Soluciones coloreadas

Azul

Roja, Naranja, Amarilla, Verde Turbias

Verde

500-570

Roja, Amarilla, Violeta, Naranja Azul

Rojo

640-700

Azul, Verde, Amar

La espectroscopia es el estudio del espectro de la luz que emiten los cuerpos, sustancias y elementos.

Interaccin radiacin-materia Espectroscopia

estudio de la absorcin y emisin de radiacin electromagntica (luz) por la materia.

radiacin electromagntica

materia

absorcin de luz dispersin de luz

emisin de luz

La espectrofotometra es el mtodo de anlisis

ptico ms usado en las investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin

La espectrofotometra es una tcnica de anlisis qumico , que puede ser de tipo cualitativo (para identificar substancias) o cuantitativo (para determinar la concentracin de las mismas en un fludo). Se basa en la propiedad que tienen muchas substancias orgnicas en absorber o emitir luz de determinadas longitudes de onda

Se utilizan espectrofotmetros de IR (infrarrojo), UV-vis (Ultravioleta visible) e IR-Raman (Infrarrojos-Raman), etc... Y cuando una substancia recibe luz de ese tipo absorber una parte y emite otra con

un patrn caracterstico que es lo que se

llamara "espectro"

Entre las diferentes tcnicas espectroscpicas con las que contamos actualmente se encuentran las siguientes:

EspectroscopaUltravioletaVisible (UVVIS)
EspectroscopaInfrarroja (IR) Espectroscopade Resonancia MagnticaNuclear de 1H, 13C, 31P y 19F (RMN) Espectrometra de Masas (MS

U.V.

L u z v i s i b l e

X GAMMA

350 nm

750 nm

Infrarrojo Radio

La luz visible es slo una pequea parte del espectro electromagnti co con longitudes de onda que van aproximadamen te de 350 nanmetros hasta unos 750 nanmetros

Microondas

Radiacin ultravioleta: (Ultra= mas all de) o rayos UV es producida por cuerpos muy calientes como el sol y por lmparas especiales como las que usan para detectar billetes falsos . La radiacin ultravioleta puede ser daina para los seres vivos, sobre todo cuando su longitud de onda es baja. La radiacin ultravioleta con longitudes de onda inferiores a 300 nm se emplea para esterilizar superficies porque mata a las bacterias y los virus

. En los seres humanos, la exposicin a radiacin ultravioleta de longitudes de onda inferiores a los 310 nm puede producir quemaduras; una exposicin prolongada durante varios aos puede provocar cncer de piel.

En espectroscopa UV-Vis se irradia con luz de energa suficiente como para provocar transiciones electrnicas, es decir promover un electrn desde un orbital de baja energa a uno vacante de alta energa

Modos de excitacin electrnica

Cuando un fotn UV-Visible de energa adecuada incide en una especie absorbente, un electrn es promovido desde su estado fundamental a un estado electrnico excitado. En absorcin UVVisible

Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentracin del medio absorbente aumenta

I = I0e-ac

I0

I0

I0

Cuando un rayo de luz monocromtica con una intensidad I0 pasa a travs de una solucin, parte de la luz es absorbida resultando que la luz emergente I es menor que I0

Luz incidente (I0)

Luz absorbida

Luz emergente (I)

a = absortividad

I0
Longitud del medio absorbente o ancho de la celda

I
c = concentracin. b
(nmero de partculas por cm3)

La informacin que puede dar ese "espectro" es de tipo cualitativo, pues te puede informar de qu tipo e incluso qu compuesto es, pero tambin cuantitativo, pues te puede ayudar a determinar en qu concentracin se encuentra ese compuesto,

Transiciones __ *

<150 nm . Este tipo de transiciones se dan sobre todo en hidrocarburos que nicamente poseen enlaces C-H o C-C. La energa requerida para que tenga lugar esta transicin es relativamente grande, perteneciente a la regin espectral denominada ultravioleta de vaco.

Transiciones n ------ * y ----- * *

entre 200-700 nm. La mayora de las aplicaciones de espectroscopia UV-Visible estn basadas en transiciones que ocurren en esta zona.

Transiciones electrnicas posibles entre orbitales n: orbital que contiene par de electrones no compartidos (ejemplo en : O, N, Cl)

Transiciones n------- *

entre 150-200 nm . Correspondientes a hidrocarburos que poseen tomos con pares de electrones no compartidos (electrones de no enlace). La energa necesaria para que se produzca esta transicin sigue siendo alta (aunque menor que en las * ) perteneciendo stas a la regin espectral UV Lejano.

8.3.- RELACIN ENTRE ABSORBANCIA Y CONCENTRACIN: LEY DE BEER

Ley de Lambert-Beer: muestra cmo la absorbancia es

directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a travs de la solucin y a la concentracin c del analito o especie absorbente.

A abc

A bc

a: cte de proporcionalidad llamada absortividad. (unidades Lcm-1g-1, si c=g/L) b: longitud del camino que recorre la radiacin a travs del medio absorbente.

c: concentracin expresada en g/L (mg/L, ...) Cuando en la ecuacin la

concentracin viene expresada en mol/L, la cte de proporcionalidad se denomina absortividad molar y se representa por (unidades Lcm-1mol-1. )

-Disoluciones que contienen ms de una clase de especies

absorbentes:
Como A = b c

A = A1 + A2 + .... + An A = 1 b c1 + 2 b c2 + . +n b cn
Siendo 1, 2, , n los componentes absorbentes.

ESPECTRO La forma ms sencilla es la representacin de Absorbancia (ordenadas) frente a l (abcisas). Se observan bandas anchas (no lnea)

CURVA PATRN
0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0 0 2 4 6 8 10 12

Concentracin mg/lt

Por lo tanto la absorbancia es reciproca de la transmitancia

Absorbancia contra concentracin (comportamiento lineal) Absorbancia

Concentracin
% Transmitancia contra concentracin (pendiente con signo negativo y comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentracin

La Transmitancia (T) es la relacin entre la intensidad de luz transmitida por una muestra problema (I) con la intensidad de luz incidente sobre la muestra (Io):

T = I / I0
Se expresa como % T

Ley de Lambert-Beer

Io : Intensidad luz incidente I: Intensidad luz transmitid

Absortividad (a)
a es una constante de proporcionalidad que comprende las caractersticas qumicas de cada compuesto, o molcula y su magnitud depende de las unidades utilizadas para b y c.

Cuando se expresa la concentracin en moles por litro y la trayectoria a travs de la celda en centmetros, la absortividad se denomina absortividad molar y se representa con el smbolo E .
En consecuencia cuando b se expresa en centmetros y c en moles por litro. A = E bc Donde A representa la absorbancia del compuesto

La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del recorrido b a travs de la solucin y la concentracin c del color absorbente. Estas relaciones se dan como:

A = abc

A menudo b es dada en trminos de cm. y c en gramos por litro, entonces la absortividad tiene unidades de lg1cm1.

A = bc

A = abc

A = A1 + A2 + A3 + ........... + An = 1 b c1 + 2 b c2 + 3 b c3 + ......... + n b cn

Con base en que la Absorbancia guarda una relacin lineal con la concentracin, se comprende la existencia de una relacin de proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentracin:

A1 / A2 = C1 / C2

Donde: A1 = Absorbancia del problema. A2 = Absorbancia de un estndar de concentracin conocida. C1 = Concentracin del problema. C2 = Concentracin del estndar. Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estndar Conc. (problema) = A2 (estndar)

La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del recorrido b a travs de la solucin y la concentracin c del color absorbente. Estas relaciones se dan como:

A = abc
A menudo b en trminos de cm. y c en gramos por litro, entonces la absortividad tiene unidades de lg1cm1.

8.4.- LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER

A) Limitaciones reales de la ley

-Disoluciones de concentracin elevada (c > 0.01 M) dan malos resultados. -La absortividad a y la absortividad molar dependen del ndice de refraccin de la muestra.

B) Limitaciones Qumicas
Se produce cuando el analito se disocia, asocia o reacciona con el disolvente para dar productos que presentan propiedades de absorcin diferentes de las del analito.
HIn H+ + In-

Color 1

Color 2

Ejemplo de curva patrn para la determinacin de safranina; donde se solubiliza este colorante nicamente en agua siendo por tanto el agua misma el tubo blanco o de referencia para la calibracin del equipo (colormetro o espectrofotmetro)

TUBO 1 2

Stock de Safranina (3 x10 -4 g/ml) ml

Agua Destilada ml

0 0.05

10 9.95

3
4 5 6

0.10
0.20 0.40 0.80

9.9
9.8 9.6 9.2

En este ejemplo de determinacin de Glucosa, en la preparacin de los tubos para la lectura de la curva patrn, se incluyen ms elementos y por lo cual el tubo blanco (0) contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin de de poder calibrar la absorbancia del equipo a cero

Compuesto Glucosa 0,1 mg/ml (mL) Agua destilada (mL) Fenol al 5% (mL) Acido sulfrico (mL)

(blanco)

2 0.1 0.4 1.0 5.0

3 0.2 0.9 1.0 5.0

4 0.4 0.8 1.0 5.0

5 0.6 0.2 1.0 5.0

6 0.8 0.6 1.0 5.0

7 1.0 0.0 1.0 5.0

0.0 1.0 1.0 5.0

un colorante es una combinacin de estructuras no saturadas conteniendo ciertos grupos conocidos como Cromforos y Auxocromos

Un cromforo es la parte o conjunto de tomos de una molcula responsable de su color. Tambin se puede definir como una sustancia que tiene muchos electrones capaces de absorber energa o luz visible, y excitarse para as emitir diversos colores,

Los cromforos se presentan casi siempre en una de dos formas: sistemas conjugados pi o complejos metlicos . En la primera forma, los niveles de energa que alcanzan los electrones son orbitales pi generados a partir de series de enlaces simples y dobles alternados, como sucede en los sistemas aromticos . Entre los ejemplos ms comunes podemos encontrar a los colorantes retinianos, (usados en el ojo para detectar la luz), varios colorantes de alimentos, colorantes azoicos para tela, licopeno, caroteno, y antocianinas.

Auxocromo

un auxocromo es un grupo funcional que no absorbe por si solo en la regin del ultravioleta pero que tiene los efectos de desplazar picos de los cromforos hacia longitudes de onda larga adems de aumentar sus intensidades. Muchos de estos grupos o radicales, son cidos y bases que originan colorantes cidos y bsicos, y que fijan eficazmente el colorante.

COMPONENTES BASICOS DE UN ESPECTROMETRO Vis-UV

a)

b)

1
1
2

FUENTE DE RADIACIN o LMPARA SISTEMA PTICO a) Sistema para dirigir la radiacin

b) Sistema de aislamiento de la longitud de onda

3 4 RECIPIENTE PARA LA MUESTRA (GENERALMENTE LQUIDA) SISTEMA DE DETECCIN (TRANSDUCTOR DE LA RADIACIN)

8.5.- INSTRUMENTACIN PARA ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIN UV-VIS

ESPECTROFOTMETROS
* Instrumento empleado para medir la absorbancia que utiliza un selector monocromtico para seleccionar la longitud de onda.

* Puede usarse en la regin UV, Vis e IR. * Pueden ser de un solo haz o de doble haz.

Diseos instrumentales para fotmetros y espectrofotmetros

Fuentes :

Dependiendo de la zona del espectro

Electromagntico Zona Ultravioleta: lmpara de deuterio. Intervalo de utilidad 160-390 nm Basada en la descarga de un gas a baja presin.

Fuentes de Energa

lmpara de deuterio (UV) 160- 380 nm fuente de tungsteno (W) Se usa en VIS e IR prximo produce luz en intervalos de 3502200 nm

FUENTES DE RADIACIN (Lmparas)

Requisitos: Intensidad de radiacin elevada. Emitir en un amplio rango de l (emisin continua). Intensidad constante con el tiempo.

FUENTES DE RADIACIN (Lmparas) Zona Visible: Lmpara de Wolframio

(lmpara de inscandescencia).
Filamento de W o W+I2

Se basa en la incasdencencia, emite luz en el visible e IR cercano desde 350-2500 nm regida por las leyes de emisin del cuerpo negro. La radiacin emitida depende de la temperatura.

Zona Visible y ultravioleta: Lmpara de Arco de Xenn

(lmpara de descarga). Se basa en la descarga entre dos electrodos en un bulbo de cuarzo con Xe a alta presin, la excitacin de Xe produce la emisin de luz contnua entre 250 y 600 nm.La emisin es muy intensa por lo que se utiliza en Fluorimetra molecular.

Filtros de absorbancia: luz que pasa

Selectores de
Utilizan placas de colores que absorben la luz que no interesa que llegue al detector

Filtros de interferencia: La luz atraviesa la superficie Una vez dentro su reflexin es funcin del espesor. Se generan interferencias destructivas y constructivas, que slo dejan atravesar el material determinados tipos de

SISTEMA OPTICO (II.Sistema de aislamiento de ls.)

Filtros de interferencia: Se basan en las interferencias pticas para obtener una banda de ls relativamente estrecha. Anchura de banda efectiva: 5-10 nm. Se construyen con un dielctrico transparente, CaF2 MgF2, que ocupa el espacio entre dos pelculas metlicas semitransparentes muy delgadas, generalmente de Ag. Todo ello colocado entre dos

capas de vidrio transparente.

SISTEMA OPTICO (II.Sistema de aislamiento de ls.)

II-a ) Sistemas NO DISPERSIVOS: FILTROS

Filtros de interferencia

Los filtros de interferencia son mejores que los de absorcin:

Anchos de banda efectivos menores (5-10 nm frente 40-50 en Filtros de Absorcin). El porcentaje de transmitancia en el mximo es ms alto 70-85% del inicial, mientras que en los filtros de absorcin es 50 %.

Ventajas: *permiten seleccionar un rango de s *son relativamente baratos Desventajas: *dispersiones de valores altos de la luz debe atravesar el prisma, lo que limita los valores de a usar. ( luz no absorbida)

Los monocromadores , que pueden ser de diversos tipo: prismas, redes de Difraccin..etc, constituyen una buena alternativa. PRISMA Se fundamenta en las leyes de difraccin: diferentes longitudes de onda refractan en ngulos diferentes

Prismas como selectores de

El ancho de banda de la seleccionada es funcin del ancho de la rendija de Salida que

Cambiando la posicin del prisma cambiara la atravesar la rendija de salida.

Selectores de Un buen selector debe: * ser capaz de seleccionar una determinada en un momento dado * explorar un determinado rango de longitudes de onda * hacer que lleguen al detector las longitudes deseadas El sistema de filtros, que es sencillo y barato no permite mas all de seleccionar un determinado ancho de banda.

Redes de difraccin

*Son la alternativa al uso de prismas en la instrumentacin actual *Consisten en una superficie pulida que posee una serie de hendiduras o grabados en paralelo en su interior: Se caracterizan por el nmero de lneas o grabados/mm: 300-2000 lneas/mm (UV-VIS) 10-200 (IR)
Cuanto mas juntas estn las lneas, mejor dispersin de luz se obtiene y mejor ser la separacin de longitudes de onda

Redes de difraccin

FOTOTUBO

Procesador de seal y lectura Es el ltimo componente bsico de instrumentacin Todo espectrofotmetro ha de disponer de: 1-Sistema de amplificacin propia que produzca una seal medible 2. Un sistema procesador de la seal, que permita eliminar, promediar datos, proporcionar salida de lectura, dirigir la salida de la seal..etc 3. Una salida de la seal: digital,registrador..etc 4. Tener cierta capacidad de procesar nmeros Veamos el diseo completo de algunos espectrofotmetros: De simple haz (monohaz) De doble haz Multicanal

MCI
Para medir Luz Visible

MCI Para medir Luz Visible y U.V.

MCI Para medir Luz Visible y U.V.

Diferentes tipos de espectrofotmetros

Spectronic 20 D

Spectrnic 20