Taller Clonacin de Un Gen

Universidad Autnoma de Tlaxcala Facultad de de Ciencias de la Salud Licenciatura en Mdico Cirujano Tercer Ao Grupo C
Domnguez Tenahua Enrique Guarneros Snchez Jorge Macas Meza Estefana Sara Ramrez Fernndez Marco Antonio Ramrez Torres lvaro Alberto von Putlitz Santos Rolando

 Una de las aplicaciones moleculares al estudio del virus de rabia es la expresin de la protena P recombinante, la cual permitir posteriormente la realizacin de diferentes ensayos experimentales que conlleven a aclarar aspectos de su funcin en el ciclo viral.

Introduccin

 Los mecanismos de transcripcin y replicacin usados por el Virus de la Rabia siguen siendo objeto central de investigacin, ya que la participacin de las protenas virales en dichos eventos no ha sido dilucidada en forma completa. Actualmente, se sabe que la fosfoprotena del virus de la rabia (protena P) es un componente del complejo ribonucleoprotena protena (RNP), donde interacta con la nucleoprotena (protena N) y con la ARN polimerasa virales. La protena P es susceptible de ser fosforilada y los estudios recientes han identificado dos tipos de cinasas que fosforilan la protena de manera diferencial, lo cual sugiere un mecanismo regulador del ciclo viral. vira La protena P tambin interacta con una protena celular implicada en el transporte retrgrado, lo cual sugiere que la interferencia de retrgrado las funciones de la P podra tener efectos deletreos sobre el ciclo viral. viral. Considerando la potencial versatilidad funcional de la protena P, esta fosfoprotena se vislumbra como un excelente blanco para el diseo de inhibidores de la transcripcin y replicacin viral y, adems, teniendo en cuenta su multifuncionalidad, se hace valiosa la propuesta de indagar sobre su funcin en la replicacin viral.

OBTN UN GEN

Extraccin de RNA y transcripcin reversa: El RNA total de cerebro de ratn infectado con virus de rabia, fue aislado usando el mtodo de tiocianato de guanidinio/cloroformo guanidinio/cloroformo (Trizol, INVITROGEN). ` Este Mtodo es utilizado para la extraccin de ARN, para procesar volmenes mayores de muestra (gramos) y tiene mejor rendimiento. A partir de 2 g de RNA total se realiz una transcripcin reversa usando un primer oligo-d(T) `para la purificacin oligopor afinidad (para mRNA) y la enzima transcriptasa reversa MMLV Virus de la Leucemia Murina (Molones, Promega).

SECUNCIALO

 Para ser til como vector, un plsmido debe reunir varias caractersticas, entre las cuales se incluyen:
a) un tamao adecuado que permita la incorporacin del inserto y su entrada en la clula. b) un origen de replicacin reconocido por la bacteria hospedadora, que permita al plsmido replicarse en dicha bacteria y transmitirse a su descendencia;

 c) genes de resistencia a antibiticos que permitan seleccionar las bacterias que captaron el plsmido; d) una o varias secuencias diana para endonu-cleasas de restriccin (poly-linker), que al cortar y linearizar el plsmido generen extremos que permitan ligar el inserto
un vector, es un vehculo que permite transportar tal segmento de inters a una clula husped adecuada, como la bacteria

 Diseo de primers: Se hizo un anlisis bioinformtico y se encontr una secuencia de 991pb (NCBI,X55727) reportada para el gen de la fosfoprotena del virus de rabia (gen P) de la cepa CVS-11. Esta secuencia fue usada para disear los primers especcos PF-KpnI: 5CGGTACCAT GAGCAAGATCTTTGTTAATC3(primer sentido)

 y PR-SmaI: 5-ATCCCGGGTCGGGTTAGCAGGA TGTATA-GC-3(primer antisentido).

Los primers contienen secuencias de reconocimiento para las enzimas de restriccin KpnI y SmaI.

 Ensayo de PCR: Condiciones de PCR: desnaturalizacin inicial por 2 min a 94C, 30 ciclos de desnaturalizacin por 45 seg a 94C, anillamiento por 90 seg a 65C y sntesis por 1 min a 72C y una extensin nal por 3 min a 72C

 El producto de PCR fue puricado y clonado en el vector pGEMT-Easy (PROMEGA). El producto de PCR fue cuanticado por espectrofotometra y fue colocado en una reaccin de ligacin con el vector en una proporcin 3:1 inserto: vector usando la enzima Ligasa del virus T4. La reaccin de ligacin fue dejada a 4C durante 16 horas.

 Los resultados de la secuenciacin conrmaron satisfactoriamente la identidad del inserto clonado. La secuencia obtenida (GENE BANK ACCESSION NUMBER DQ011221) fue traducida y comparada con la protena P del virus de rabia cepa CVS-11 reportada (NCBI, X55727), mostrando un 98% de homologa.

 La protena traducida a partir de la secuencia del inserto clonado presenta cinco aminocidos cambiados, en las posiciones 40 (Gln-Arg), 47 (Asp-Asn), 98 (Asp-Asn), 165 (Glu-Gli) y 222 (Ile-Leu).

 Ninguno de los aminocidos cambiados corresponde a los sitios conocidos de fosforilacin de la protena P, lo cual indica que esa funcin no fue alterada en la protena recombinante.

INSRTALO EN UN PLSMIDO

 Plsmidos: molculas de DNA que adicionalmente tienen la capacidad de replicarse dentro de la clula receptora usando sus propios sistemas de control. Los plsmidos bacterianos son molculas de DNA pequeas, circulares, de doble cadena, cuya funcin natural es la de transferir a las bacterias genes de resistencia a los antibiticos.

 Una vez confirmado su tamao, el producto de PCR fue purificado usando el kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) y clonado en el vector pGEMT-Easy (PROMEGA). Antes de proceder a la clonacin, el producto de PCR fue cuantificado por espectrofotometra y fue colocado en una reaccin de ligacin con el vector en una proporcin 3:1 inserto: vector usando la enzima Ligasa del virus T4. La reaccin de ligacin fue dejada a 4C durante 16 horas.

Construccin del plsmido recombinante

 Vector de clonacin pGEM-T Easy (PROMEGA). Mapa circular donde se muestran los elementos de referencia del vector, incluyendo el polyl-inker con las enzimas de restriccin para las cuales tiene secuencias diana (rectngulos en el lado derecho).

 El plsmido recombinante obtenido fue transfectado en bacterias Escherichia coli JM109 cultivadas en medio LB y ampicilina (100 g/ml) puesto que el vector contiene el gen que codifica para la enzima -lactamasa y que confiere resistencia al antibitico. Las bacterias transformadas y seleccionadas fueron amplificadas para someterlas a extraccin de DNA plasmdico por el mtodo convencional de lisis alcalina.

Obtn la protena codificada por la secuencia del gen.

Fosfoprotena del virus de rabia (protena P).

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La clonacin se basa en el hecho de que las molculas de DNA pueden incorporarse en vectores de clonacin (plsmidos bacterianos, fagos o csmidos), los cuales son a su vez molculas de DNA que adicionalmente tienen la capacidad de replicarse dentro de la clula receptora usando sus propios sistemas de control.

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Adicionalmente, el DNA incorporado dentro del vector puede codificar para una protena de inters y ser usado como un vector de expresin para lograr la expresin de una protena fornea a la cual se le conoce como protena recombinante.

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Un vector que permite que la protena codificada por el gen se sintetice, se conoce como vector de expresin y estos poseen adems de las caractersticas anteriores, seales de transcripcin y traduccin que dirigen la expresin de la protena codificada por el inserto.

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El plsmido recombinante obtenido fue transfretado en bactrias Escherichia coli JM109 cultivadas en medio LB y ampicilina (100 g/ml), puesto que el vector contiene el gen que codifica para la enzima -lactamasa y que confiere resistencia al antibitico. Las bacterias transformadas y seleccionadas fueron amplificadas para someterlas a extraccin de DNA plasmdico por el mtodo convencional de lisis alcalina.

Transformacin de bacterias E. coli

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 a) Ensayo de PCR:

Cada una de las colonias de E. coli resistentes a ampicilina, escogidas al azar fueron resuspendidas en aproximadamente 50 l de agua desionizada estril y 10 l de esta suspensin fueron sometidos a 98C durante 10 minutos en un termociclador Perkin Elmer. Luego 5 l de esta suspensin fueron usados como plantilla para una reaccin de PCR con los primers PFKpnI y PRSmaI. Los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 2% teido con bromuro de etidio.

Confirmacin de la identidad del inserto

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 b) Anlisis por restriccin enzimtica: Se us

1 l de DNA plasmdico purificado de cada una de las colonias recombinantes como plantilla en ensayos de PCR con los primers PFKpnI y PRSmaI. Luego 2 l de cada producto de PCR fueron sometidos a digestin con las enzimas de restriccin BamH I, Sty I, Hpa II; Hae III y Hind III. Para cada reaccin de digestin, fue usado el buffer en el que la actividad especfica de la enzima fuera del 100%, segn las recomendaciones del fabricante.

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 c) Secuenciacin: Dos clonos confi rmados por

PCR y restriccin enzimtica fueron enviados a MWG (The Genomic Company) para un proceso de secuenciacin confiable, con 2 lecturas sobre el DNA plantilla con los primers del vector pGEMT-Easy (T7 y Sp6) y cada lectura con su respectiva rplica.

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Se tomaron 100(l del extracto bacteriano que contiene la protena de fusin biotinilada y fueron transferidos a un tubo de microcentrfuga de 1.5 ml. Se centrifug a 13.000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante se retir y el pellet fue resuspendido en 50 (l de buffer Laemli 1X. La muestra fue sometida a 95C por 5 minutos con vrtex ocasional.

Deteccin de la protena recombinante

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Este tratamiento lisa las clulas y reduce y carga negativamente las protenas con SDS. Luego se pusieron 5(l de la muestra tratada con calor sobre un minigel de poli-acrilamida al 12% en un sistema SDS-PAGE junto con marcadores de peso molecular.

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Las muestras fueron separadas por 90 minutos a 100V. Siguiente a la electroforesis las protenas fueron transferidas a 30V durante 16 horas desde el gel hasta una membrana de PVDF. La membrana fue incubada con estreptavidina acoplada a fosfatasa durante 30 minutos a temperatura ambiente y fi nalmente incubada con una solucin de nitroblue tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT-BCIP) que permite localizar las protenas biotiniladas como bandas de color prpura oscuro.

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Los primers permitieron amplificar un producto de tamao esperado (914pb), correspondiente al gen de la protena P. El tamao fue confirmado por electroforesis en gel de agarosa y tincin con bromuro de etidio.

Amplificacin del gen P

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 Amplificacin por RT-PCR del gen de la protena P del virus de rabia. Gel de agarosa al 1.5% teido con bromuro de etidio en el que se observa el producto de PCR de 914 pb obtenido a partir de cDNA de cerebro de ratn infectado con virus de rabia. Carril 1: marcador de peso molecular ladder 100 pb; carril 2: control negativo (sin DNA); carril 3: cDNA de cerebro de ratn infectado con virus de rabia (cepa CVS-11).
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Usando un sistema de revelado con fosfatasa alcalina fueron detectadas las protenas de fusin biotiniladas producidas por la transformacin de E. coli con el vector PinPoint.

Deteccin de la protena recombinante P

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La nica protena biotinilada expresada endgenamente por E. coli fue detectada como una banda de 22,5 kDa; como era de esperarse el pptido seal incorporado en el vector de expresin tambin fue detectado con un peso molecular de 13 kDa en el extracto de bacterias transformadas con el vector sin inserto. Asimismo y de manera muy eficiente fue expresada la protena P recombinante en E. coli.

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El sistema de expresin usado produjo una protena biotinilada de aproximadamente 50 kDa, lo cual resulta de la fusin de la protena P silvestre (37 kDa) mas el pptido seal biotinilado (13 kDa). Adicionalmente, las formas truncadas de la protena P fueron expresadas y detectadas como protenas de fusin biotiniladas de tamao ms pequeo. La efi ciencia en la expresin de las diferentes formas de P fue diferencial, siendo la forma de completa de P, predominantemente expresada.

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