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PROCESOS FERMENTATIVOS

M.C. Iris Betsabee Ocampo Suarez

Introduccin

El principal objetivo de un proceso fermentativo es el de obtener productos metablicos tiles a partir de materiales biolgicos (sustratos). El proceso fermentativo comprende dos principales fases distintas: la fermentacin y la recuperacin de los productos.

Introduccion Para el cultivo de microorganismos en condiciones ptimas, as como para la produccin, por parte de los microorganismos, de los metabolitos o las enzimas deseadas, deben ser desarrollados procedimientos de fermentacin.

Introduccin Pero tambien el desarrollo de cepas mediante manipulacin gentica y/o la regulacin del metabolismo mediante la optimizacin del medio de cultivo as como el control adecuado de los factores fsico-qumicos que afectan al rendimiento de las fermentaciones industriales (02, Temperatura, pH, etc).

Introduccin
La recuperacin del producto o "procesamiento posterior" (del ingls downstream processing) conlleva la extraccin y purificacin de los productos biolgicos. La recuperacin en los procesos bioqumicos difiere de la recuperacin qumica, principalmente, en que los materiales biolgicos son frecuentemente mucho ms lbiles.

Introduccin
Por lo tanto, la produccin de productos metablicos tiles a partir de microorganismos con lleva una ntima relacin entre la ciencia y la tecnologa. Por un lado se deben desarrollar los microorganismos de inters industrial y por otro se debe asegurar que estos microorganismos puedan crecer en gran cantidad bajo aquellas condiciones que originen el mejor rendimiento posible del producto.

Fermentacion
La Fermentacin es un proceso catablico de oxidacin incompleto, totalmente anaerbico, siendo el producto final un compuesto orgnico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones. Fue descubierta por Pasteur, que la describi como la vie sans lair (la vida sin el aire).

Fermentacin
El proceso de fermentacin es anaerbico ya que se produce en ausencia de oxgeno. Esto significa que el aceptor final de los electrones del NADH producido en la glucolisis no es el oxgeno, sino un compuesto orgnico que se reducir para poder reoxidar el NADH a NAD+. El compuesto orgnico que se reduce (acetaldehdo, piruvato etc) es un derivado del sustrato que se ha oxidado anteriormente.

Fermentacin
Sin embargo, en la industria la fermentacin puede ser oxidativa, es decir, en presencia de oxgeno, pero es una oxidacin aerbica incompleta, como la produccin de cido actico a partir de etanol. Las fermentaciones pueden ser: Naturales, cuando las condiciones ambientales permiten la interaccin de los microorganismos y los sustratos orgnicos susceptibles. Artificiales, cuando el hombre propicia condiciones y el contacto referido.

Productos, reacciones y grupos microbianos responsables de los procesos fermentativos mas importantes
Lactico + etanol + CO2 Biomasa + CO2

Lactobacilos. Streptococcus Leuconostoc

O2

Hongos comerciales Levaduras Zimomonas

Clostridium butiricum

Clostridium propionicum y Propioniobacterium Enterobacterias


Los grupos que mas interesan desde el punto de vista alimentario son: enterobacterias y clostridium (Sanitario) y bacterias lacticas , propionibacterias y levaduras (Productivo)

De acuerdo con Steinkraus (1995), la fermentacin de los alimentos sirve a 5 propsitos generales:
Enriquecimiento de la dieta a travs del desarrollo de una diversidad de sabores, aromas y texturas en los substratos de los alimentos. Preservacin de cantidades substanciales de alimentos a travs de cido lctico, etanol, cido actico y fermentaciones alcalinas. Enriquecimiento de substratos alimenticios con protena, aminocidos, cidos grasos esenciales y vitaminas. Detoxificacin durante el proceso de fermentacin alimenticia. Disminucin de los tiempos de cocinado y de los requerimientos de combustible.

Fermentacin En lneas generales, un proceso tpico de fermentacin comienza con la formulacin y esterilizacin del medio de cultivo as como la esterilizacin del equipamiento. Las clulas se crecen primero en un cultivo de mantenimiento (5 a 10 mL), posteriormente en un matraz (200 a 1.000 mL) y de ah en un prefermentador (10 a 100 L) para finalmente inocular el fermentador de produccin (1.000 a 100.000 L).

Fermentacion Una vez que la fermentacin se ha completado, las clulas se separan del cultivo lquido. Si el producto es intracelular, se rompen las clulas, se eliminan los restos celulares y se recupera el producto del fluido libre de restos celulares. Si el producto es extracelular, se purifica a partir del sobrenadante libre de clulas.

Biorreactor Un biorreactor es la parte principal de cualquier proceso fermentativo en el cual se emplean sistemas microbianos para la manufactura economica de una amplia variedad de productos biologicos utiles.

Biorreactor La funcion principal de un biorreactor diseado apropiadamente es la de proveer un medio controlado para alcanzar el crecimiento optimo y la formacion de productos finales optimos o cualquiera de ambos, en el sistema celular particular empleado.

Se encuentran dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: Tanque agitado Air lift".

Tanque agitado En el tanque agitado, la agitacin se realiza mecnicamente mediante un eje provisto de turbinas accionado por un motor. El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee pequeos orificios espaciados regularmente.

Tanque agitado El chorro de aire que sale de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la turbina inferior generndose de este modo miles de pequeas burbujas de aire, desde las cuales difunde el 02 hacia el seno del lquido. El sistema de agitacin se completa con cuatro o seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que imprimen las turbinas al lquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor mezclado.

Tanque agitado El tanque est rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que permite controlar la temperatura.

Biorreactor Air Lift En los reactores de tipo "air lift, el mismo aire inyectado promueve la agitacin. Bsicamente consiste en dos cilindros concntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulacin de lquido ascendente en el compartimento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el mezclado.

Funcionamiento de biorreactores

La tecnologa de los procesos fermentativos es una amalgama de tcnicas biolgicas e ingeniera qumica, se hace necesario conocer los tipos de fermentadores disponibles y sus principales caractersticas.

Los siguientes puntos son los considerados como los criterios ms importantes para el funcionamiento de un biorreactor: 1.- El tanque debe disearse para que funcione aspticamente durante numerosos das, as como para las operaciones de ms larga duracin. 2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireacin y agitacin para cubrir las necesidades metablicas de los microorganismos.
3.- El consumo de energa debe ser tan bajo como sea posible.

4.- Debe tener un sistema para el control del pH.

5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras. 6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura. 7.- Las prdidas por evaporacin no deben ser excesivas. 8.- El diseo del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el funcionamiento, recoleccin, limpieza y mantenimiento sean mnimas. 9.- El tanque debe ser verstil para la aplicacin de diversas modalidades de procesos.

10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras. 11.- La geometra del fermentador debe ser similar a otros tanques ms pequeos o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a diferentes escalas. 12.- Deben emplearse los materiales ms baratos que proporcionen resultados satisfactorios. 13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.

Funcionamiento El mantenimiento de un ambiente asptico y unas condiciones aerbicas son, probablemente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar. Los fermentadores ms ampliamente utilizados a nivel industrial estn provistos de mecanismos de agitacin, dispersin y aireacin as como de sistemas para el control de la temperatura, pH y formacin de espuma.

Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del siguiente modo: Mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentacin o la flotacin. Mantener constante y homognea la temperatura. Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes. Suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo. El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo deseado.

Factores fisico-quimicos que afectan al rendimiento de las fermentaciones industriales

1.- Oxgeno 2.- Temperatura 3.- pH

Oxgeno Uno de los factores ms crticos en la operacin de fermentacin a gran escala es el suministro de un intercambio de gases adecuado. El oxgeno es el sustrato gaseoso ms importante para el metabolismo microbiano y el anhdrido carbnico es el producto metablico ms importante.

Oxigeno El oxgeno no es un gas muy soluble ya que una solucin saturada de oxgeno contiene aproximadamente 9 mg/L de este gas en agua. Debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido mximo de oxgeno realmente es ms bajo de lo que debera ser en agua pura. Por lo tanto, el suministro se logra pulverizando aire en el fermentador durante el proceso.

Oxigeno Una vez disuelto el O2 ste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada clula individual. Para ello deben ser superadas varias resistencias parcialmente independientes: a.- La resistencia dentro de la pelcula de gas a la interfase. b.- La penetracin de la interfase entre la burbuja de gas y el lquido. c.- Transferencia desde la interfase al lquido. d.- Movimientos dentro de la solucin de nutrientes. e.- Transferencia a la superficie de la clula.

Oxigeno
La ley de Henry describe la solubilidad del oxgeno en soluciones de nutrientes en relacin a la presin parcial del oxgeno en la fase gaseosa:

P0 C= H
Donde: C = concentracin de O2 de la solucin de nutrientes a cierta saturacin P0 = presin parcial del gas en la fase gaseosa H = constante de Henry que es especfica para cada tipo de gas.

Temperatura La temperatura es otro de los parmetros esenciales para el xito de una fermentacin. Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la ptima tienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la produccin celular, es decir su productividad.

Temperatura Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrs al choque trmico con la consiguiente produccin de proteasas celulares que ocasionan una disminucin en el rendimiento de los productos proteicos. A fin de obtener rendimientos ptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un margen estrecho de temperatura y a ser posible constante.

Temperatura La velocidad de produccin de calor debida a la agitacin y a la actividad metablica de los microorganismos no se ve compensada por las prdidas de calor que resultan de la evaporacin, por lo que se debe recurrir a sistemas de refrigeracin. Dentro de stos, los ms utilizados en las fermentaciones industriales son las camisas de agua.

Temperatura La relacin temperatura-velocidad de crecimiento esta dada por la ecuacin de Arrhenius: = Ae Ea/RT Donde = velocidad de crecimiento A = constante de Arrhenius Ea = energa de Activacin (kcal/mol) R = constante de los gases T = Temperatura absoluta

pH La mayor parte de los microorganismos crecen ptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de cultivo y aadir un cido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH.

pH Esta adicin del cido o base debe ser mezclada rpidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el fermentador.

Agitacion La agitacin es la operacin que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases. Una fermentacin microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones lquido-slido, gas-slido y gas-lquido.

1 La fase lquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir, en algunos casos, una segunda fase lquida si existe un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos. 2 La fase slida consiste en clulas individuales, bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan. 3 La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxgeno, para la eliminacin del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.

Agitacion Una adecuada agitacin de un cultivo microbiano es esencial para la fermentacin ya que produce los siguientes efectos en las tres fases: 1 Incrementar la velocidad de transferencia de oxgeno desde las burbujas de aire al medio lquido; los microorganismos no pueden utilizar oxgeno gaseoso, sino solamente el que se encuentra en disolucin.

2 Aumentar la velocidad de transferencia de oxgeno y nutrientes desde el medio a las clulas. Debido al movimiento se evita que las clulas creen reas estancadas con bajos niveles de oxgeno y nutrientes. 3 Impedir celulares. la formacin de agregados

4 Aumentar la velocidad de transferencia de productos metablicos de las clulas al medio. 5 Aumentar la tasa o la eficiencia de la transferencia de calor entre el medio y las superficies de refrigeracin del fermentador.

Tipos de fermentacion En funcin de los flujos de entrada y salida, la operacin de un biorreactor puede ser de tres modos distintos: Lote (Batch) o discontinua Lote alimentado (Fed-Batch) Continuo o quimiostato

Fermentacin discontinua Una fermentacin por lotes (Batch) o discontinua puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al inicio de la operacin se aade la solucin esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin.

Fermentacion discontinua A lo largo de toda la fermentacin no se aade nada, excepto oxgeno (en forma de aire), un agente antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio de cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo de las clulas observndose las cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia, fase logartmica, fase estacionaria y fase de muerte.

Fermentacion discontinua Cuando se ha alcanzado el nivel deseado de reaccin, se vaca el reactor, se limpia y el proceso se repite. En los procesos comerciales la fermentacin frecuentemente se interrumpe al final de la fase logartmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios).

Desventajas - Dificultad de controlar la velocidad de crecimiento, excepto variando la composicin del medio o las condiciones de proceso. - Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el crecimiento debido al aumento de la presin osmtica del medio o toxicidad de nutrientes. - Alta demanda de oxgeno puede generar una limitacin debido a una insuficiente capacidad del reactor para transferir O2 al medio. - Inconvenientes para remover calor. - Tiempos muertos productividad. entre procesos disminuye la

Fermentacion discontinua alimentada Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentacin alimentada. En los procesos alimentados, los sustratos se aaden escalonadamente a medida que progresa la fermentacin. La formacin de muchos metabolitos secundarios est sometida a represin catablica (efecto glucosa).

Fermentacion discontinua alimentada Por esta razn en el mtodo alimentado los elementos crticos de la solucin de nutrientes se aaden en pequeas concentraciones al principio de la fermentacin y continuan aadindose a pequeas dosis durante la fase de produccin.

F(t) SR(t)

Vf, Xf VR = Vf - V0 V0, X0, S0

RESERVORIO

BOMBA BIORREACTOR

Fermentacion discontinua alimentada El batch alimentado es particularmente til en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formacin de producto son sensibles a la concentracin del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. As, este mtodo se emplea cuando se quieren evitar fenmenos de inhibicin por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentracin de biomasa.

Ventajas - Limitar la demanda de O2 del cultivo. - Obtener altas concentraciones de sustrato evitando el efecto osmtico y txico de nutrientes. - Incrementar la tasa de produccion (metabolitos secundarios, protenas recombinantes) para maximizar el coeficiente de rendimiento. - Maximizar el crecimiento Crabtree en levaduras). celular (efecto

Fermentacin continua En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin nutritiva estril se aade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultneamente del sistema.

Fermentacin continua En algunos sistemas continuos el medio nutriente es inoculado con el cultivo microbiano al entrar al reactor y los organismos llevan a cabo su actividad a medida que el lquido fluye a travs del sistema y salen del sistema junto con el medio.

Fermentacin continua Los organismos pueden separarse de la corriente que lleva al producto y reciclarse para inocular el lquido de alimentacin. En un sistema continuo con mezcla completa, las condiciones son uniformes en todo el reactor, en un equilibrio de mezcla de nutrientes, organismos y productos.

Ventajas - Opera por periodos largos; tiempos muertos bajos. - Costos de operacin y trabajo bajos. - El cultivo se mantiene con coeficientes de crecimiento constantes. - Crecimiento balanceado, composicin celular constante. -Generacin de biomasa productividad y conversin. constante como

- Volumen de reactor reducido en comparacin a la productividad similar en proceso por lotes.

Desventajas - Alto costo por alta calidad de equipos y accesorios. - Requiere gran reservorio para almacenamiento de medio o suministro continuado de sustrato. - Esterilizacin continuada, separacin continuada de producto y niveles de purificacin. - Biosensores sofisticados y automatizacin computarizada para operacin ptima.

Desventajas - Se incrementa el riesgo de contaminacin debido a la amplia operacin. - Posibilidad de mutacin, incremento de fagos por los cambios genticos debido a la presencia de plasmidios e incremento de estos. - La conversin total de sustrato exige sistema de multiniveles, inmovilizacin celular o recirculacin celular que encarece el costo de operacin.