Tecnologías de DNA

Recombinante

    María Eugenia Cabrejos, PhD

Año 2006
Análisis Animales, microorganismos y plantas
Forense genéticamente modificados

Anticuerpos

Cáncer

Diagnóstico

Estructura,
Estructura y Purificación de
 
Localización de Genes  
Proteínas
Terapia Génica
Herramientas para la Manipulación de DNA
Enzimas de Restricción o Endonucleasas
•endonucleasas sintetizadas por diversas bacterias como sistema de defensa
(degradación de DNA foráneo: fagos)

•reconocen secuencias palindrómicas: igual lectura en ambas direcciones

5´-GCATGC-3´
3´-CGTACG-5´

•generan tres tipos de extremos en el DNA: romos, 5´-cohesivos, 3´-cohesivos

   
Existe una gran cantidad

de enzimas de restricción.

Difieren en los sitios

de reconocimiento

y corte.

   
Separación de fragmentos de dsDNA según su tamaño molecular.

Electroforesis en gel:
d) Agarosa
e) Poliacrilamida

Visualización mediante intercalación de Bromuro de Etidio

  y exposición a luz ultravioleta.
 
 Caracterización tamaño de fragmentos (bp)
y construcción de mapa genético.

   
Ubicación secuencia blanco

en contexto cromosómico

y número de copias

“Southern blot”.

Detección del fragmento blanco

por uso de sondas secuencia
específica, marcadas con:

• γ32P-ATP
• Fluoróforo
• Sistema acoplado a enzimas

   
Preservación fragmento
y aumento número de
copias de DNA blanco:
clonamiento.

   
 Vectores de clonamiento
Características genéricas

– Origen de replicación
– Marcador de selección (resistencia a antibiótico)
– Sitio de policlonamiento

   
Proceso de clonamiento

•Sitio dirigido
•Uso de adaptadores
•Partidores universales flanquean
polylinker: secuenciación, PCR

2 ATP
2 AMP + 2 PPi

   
Inserción de constructos en células para su propagación

3.
• Transformación química
• Electroporación
• Transfección con liposomas

2.

   
 Screening de colonias

Análisis de plasmidios

   
 Confirmación constructo por
secuenciación de dsDNA
(eventual PCR y restricción)

   
 Características de diversos Vectores

– Plasmidios (20 Kb): replicación en bacterias, clonamiento DNA,

cDNA, expresión proteínas, generación sondas, secuenciación.

– Bacteriófagos (25 Kb): cDNA y librerías genómicas, el huésped

puede presentar problemas de replicación.

– Cosmidos (45 Kb) cDNA y librerías genómicas, clonamiento de

fragmentos grandes puede traer problemas de empaquetamiento
del fago, no recomendado para expresión de proteínas, no se
replican en células de mamífero.

– BAC (300 Kb): acepta grandes fragmentos de DNA, librerías

genómicas, replicación restringida a bacterias, no se usa para
exresión de DNA.

– YAC (1000 Kb): versión “miniatura” de cromosomas humanos

acepta grandes fragmentos de DNA, librerías genómicas, deben
ser crecidos en levaduras.

   
– TI plásmido: restringido a transferencia génica en plantas.
 Yeast artificial chromosome (YAC)
El vector contiene:

•yeast centrómero (CEN) y telómeros (TEL) de levadura

•orígenes de replicación (autonomously replicating sequence (ARS))

•URA3 gen involucrado en uracil síntesis para la selección positiva de células transformadas
con YAC

•Un origen de replicación (ORI) y marcador de selección (Amp) bacteriana necesarios para
propagar el vector

   
 Particularidades YAC

   
 Genotecas Genómicas vs cDNA
• Librería Genómica es usada para DNA procariontes
(no contiene intrones)
• Librería de cDNA es usada para sistemas eucariontes (procesa los
intrones).

Síntesis cDNA:
• Puficación RNA total
(eventual purificación de mRNA)
• RT-PCR
e) Adaptadores y clonamiento familia cDNAs
f) PCR convencional con partidores específicos

   
 Identificación cDNA Generación de sondas antisentido
“Northern blot”
Clonamiento cDNA flanqueado por promotores
de RNA polimerasas virales - ensayo de run off -
uso de ribonucleótidos modificados para facilitar
Aparamiento de bases la detección
permite hibridación de
DNA:DNA
o
DNA:RNA

   
 Construcción

Mapas

Genéticos

Mediante

Bioinformática

(Empalme Clones)

   
 Alineamietno de clones secuenciados (PHRAP)

   
 Primaria vs. Derivada
Bases de Datos de Secuencias

ACGT
GC RefSeq
C TC
Labs
A A
GA G
GA G
ATCATCT TATAGCCG
TA AGCTCCGATA
TA CCGATGACAA
GC
CG
Sequencing GC
Centers ACG T Genome
CGT
A
Curators Assembly
T
T
AC
TG T G
GA

AT
A CA

A
AC
TGC

CG
G
TT TTGACA Updated
ACG A

C
CGTGA

CG
AC
CT

TA
CG C

TAT AT
continually
A

GC
GT

AGC TGA C
ATTGTG
C GA

TA
TG

TAT

CG GA
G
TA

C
CAGCTACT C by NCBI
TGA
A ATT GACA
G
A

ATTG TATAGCCG
AT TATAGCCG ATATAGCCG
T
TATAGCCG
TA

AT T
TA TT C

GA GenBank
AT UniGene
Updated ONLY
TACTTTCTT
GA G A
GA GA by submitters C TCA A
GA G
GA G
T
A ATC A C ATCATCT Algorithms
 
 Web Access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov

   
 The Entrez System: Text Searches

   
 Sistema ENTREZ

Gene UniGene
CancerChromosomes UniST
S
Homologen
e SNP

Genome Nucleotide PopSet

Books GEO

PubMed Entrez Taxonomy

MeSH GEO
Datasets
OMIM
Protein
PMC

Journal Structur
  Domains   3D Domains
s e
 Mapas Génicos Humanos

   
 Al inicio: línea del locus
LOCUS AY182241 1931 bp mRNA linear PLN 04-MAY-2004
DEFINITION Malus x domestica (E,E)-alpha-farnesene synthase (AFS1) mRNA,
complete cds.
ACCESSION AY182241
VERSION AY182241.2 GI:32265057
KEYWORDS .
SOURCE Malus x domestica (cultivated apple)
ORGANISM Malus x domestica
Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta;
Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicots;
rosids; eurosids I; Rosales; Rosaceae; Maloideae; Malus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1931)
AUTHORS Pechous,S.W. and Whitaker,B.D.
TITLE Cloning and functional expression of an (E,E)-alpha-farnesene
synthase cDNA from peel tissue of apple fruit
JOURNAL Planta 219, 84-94 (2004)
REFERENCE 2 (bases 1 to 1931)
AUTHORS Pechous,S.W. and Whitaker,B.D.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (18-NOV-2002) PSI-Produce Quality and Safety Lab,
USDA-ARS, 10300 Baltimore Ave. Bldg. 002, Rm. 205, Beltsville, MD
20705, USA
REFERENCE 3 (bases 1 to 1931)
AUTHORS Pechous,S.W. and Whitaker,B.D.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (25-JUN-2003) PSI-Produce Quality and Safety Lab,
USDA-ARS, 10300 Baltimore Ave. Bldg. 002, Rm. 205, Beltsville, MD
20705, USA
  REMARK  
Sequence update by submitter
COMMENT On Jun 26, 2003 this sequence version replaced gi:27804758.
 Forma en que se entiende la Información
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1931
/organism="Malus x domestica"
/mol_type="mRNA"
/cultivar="'Law Rome'"
/db_xref="taxon:3750"
/tissue_type="peel"
gene 1..1931
/gene="AFS1"
CDS start (atg) 54..1784 stop (tag)
/gene="AFS1"
/note="terpene synthase"
/codon_start=1
/product="(E,E)-alpha-farnesene synthase"
Coding sequence /protein_id="AAO22848.2"
/db_xref="GI:32265058"
GenPept Identifiers
/translation="MEFRVHLQADNEQKIFQNQMKPEPEASYLINQRRSANYKPNIWK
NDFLDQSLISKYDGDEYRKLSEKLIEEVKIYISAETMDLVAKLELIDSVRKLGLANLF
EKEIKEALDSIAAIESDNLGTRDDLYGTALHFKILRQHGYKVSQDIFGRFMDEKGTLE
NHHFAHLKGMLELFEASNLGFEGEDILDEAKASLTLALRDSGHICYPDSNLSRDVVHS
Implied LELPSHRRVQWFDVKWQINAYEKDICRVNATLLELAKLNFNVVQAQLQKNLREASRWW
protein ANLGIADNLKFARDRLVECFACAVGVAFEPEHSSFRICLTKVINLVLIIDDVYDIYGS
EEELKHFTNAVDRWDSRETEQLPECMKMCFQVLYNTTCEIAREIEEENGWNQVLPQLT
KVWADFCKALLVEAEWYNKSHIPTLEEYLRNGCISSSVSVLLVHSFFSITHEGTKEMA
DFLHKNEDLLYNISLIVRLNNDLGTSAAEQERGDSPSSIVCYMREVNASEETARKNIK
   
GMIDNAWKKVNGKCFTTNQVPFLSSFMNNATNMARVAHSLYKDGDGFGDQEKGPRTHI
LSLLFQPLVN"
 EST hits Arabidopsis mRNA

5’ EST hits
3’ EST hits

   
Genómica

• Generalidades
• FISH
• RFLP
• VNTR
Marcadores de selección:
• RAPD Análisis de paternidad, análisis forenses, etc.
• Microsatélites
• SNP
• Ligamiento
• Microarreglos
• Diagnóstico

   
 Generalidades

   
Generalidades

   
Aproximación Cromosómica
• FISH
• uso de sondas fluorescentes
• Estudio de algunas alteraciones cromosómicas

   
Localización cromosómica de los distintos tipos de DNA repetido.

Minisatélite telomérico

Satélite clásico

Microsatélite

Minisatélite DNAr
hipervariable

   
 Sickle Cell Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP)
Polimorfismo en la longitud de fragmentos
obtenidos por corte en la doble hebra de DNA

   
 Techniques: 
RFLP in criminal cases  Blood on suspect’s Victim’s
Suspect’s clothes blood
blood
A murder trial : 
­ Is the suspect guilty ? 
­ Evidence: Blood samples from:
­ the victim
­ the suspect
­ blood found in suspect’s jeans 
and shirt.
7) The suspect’s blood does not 
match the blood found on the 
clothes.
8) The jeans and shirt have the same 
type of blood
9) The blood on the clothes matches 
the victim’s blood perfectly. 
   
10) The suspect is guilty. 
 A PCR­RFLP combination assay
• Frequently both techniques are used together, so that multiple samples of the 
same original DNA sequence can be assayed in different ways and several 
times (replicates).
• Also, making copies (using PCR), allows saving the original sample. 
• Generally, the two ends of a gel are not the actual samples of interest, but 
reference bands (standards of know molecular weight, or various types of 
control for the techniques used).

Actual samples

Homozygote Homozygote
For allele 1 for allele 2

heterozygote
   
Restriction fragment length polymorphism
Restriction digest
Gel or gel + Southern blot
Identify linkage to the mutant allele

   
VNTRs
Simple sequence repeats
Highly variable
Excellent for linkage and human identity

   
   
DNA “fingerprints” de una muestra
de sangre que quedó en la escena
de un crimen (*) y de la de siete
sospechosos. Los patrones de
hibridación obtenidos son
específicos para cada
individuo debido al alto grado de
polimorfismo del DNA minisatélite
hipervariable.

   
   
   
RAPD
Highly variable
Unknown origin
Reproducibility?

   
   
 Microsatélites

• Repeated length 1,2, or 3 words

– AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
– CACACACACACACACACA

• DNA polymerase “slips” during replication

– Mismatch repair process either corrects the problem, or changes

the template!

• Length 3 words are particularly problematic (when in coding

sequence)

– Huntington’s disease
– Fragile X syndrome

   
 Extensión Microsatélite

   
Linkage
Allele/marker segregates with a disorder

   
 Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

• Replication errors:
– Substitution / Insertion / Deletion

• Non-coding
– No affect on gene sequence, but may affect gene expression

• Synonymous
– Contained in coding sequence, but codon redundancy ensures
no change in protein sequence

• Non-Synonymous
– Changes protein sequence, adds stop codon, messes up
translation frame

   
 Techniques: 6) Sequencing for determining Single 
Nucleotide Polymorphisms (SNP’s)
• In SNP’s alleles show variations in one 
or very few scattered nucleotides.
• Most SNP’s have little or no effect on 
the phenotype, and are therefore 
harmless. However, they are very 
common in each person’s genome.
• Thus, SNP’s can become like the 
individual signature of a person.
• SNP’s  can be used in:
­ ascertaining identity
­ studying inheritance patterns
­ studying rates of mutation 
­ paternity in certain cases. 

   
 DETECCION DE ANEMIA FALCIFORME POR PCR-SSCP

   
Diagnóstico

   
Análisis desórdenes

conocidos

   
   
 DNA Microarray

Técnica que permite testear la expresión diferencial de genes de

un tejido alterado o de interés, respecto de la situación control.

Proceso general

Poly-A 10% Biotin-labeled Uracil

Cells cDNA
RNA Antisense cRNA
IVT
AAAA L L L
(In-vitro
Transcription)
Fragment (heat, Mg2+)

Labeled
fragments
Hybridize Wash/stain Scan
L
L
  L  
 Preparación Chip: matriz

   
Chip Genómico

   
Etapa de hibridación

GeneChip Biotin Hybridized Array

Labeled cRNA
L
L
L
L L
+ L L

+
L
L
L
L
L
SAPE
Streptavidin-
phycoerythrin

   
   
Microorganismos y/o Animales modificados genéticamente

•Ratones Knockouts
•Bacterias productoras de proteínas recombinantes
•Transgénicos (inyección DNA foráneo, tratamiento células ES)
•“Dolly”
•Terapia Génica

   
Ratones Knockouts: uso de células ES

• creación vector con mutación

• recombinación homóloga en células
• Selección células recombinantes/knockouts G418 (Neo) elimina células tipo nativa sin
integración del vector y ganciclovir mata células con integración del vector al azar (que lleva
gen tk).

Sin Mutación en gen X

Células resistente,
pero sensible a gancyclovir
(nucleósido análogo que será
fosforilado por timidina kinasa
(tk) y será incporprado al DNA
en replicació, inactivándolon).

Mutación en gen X
Células resistente a neomicina
y gancyclovir

   
 Ratones Knockouts: uso de células ES

   
Ratones Knockouts: uso de células ES

   
 Vectores de Expresión
(Bacteriano)
• Contiene un promotor bacteriano para la síntesis de mRNA, el cual posee las
señales para ser traducidos al interior de microorganismos bacterianos.

• La gran dificultad es que a veces el plegamiento del polipéptido al interior de la

bacteria no es el adecuado para generar una proteína funcional.

• O bien, el mRNA se degrada o la proteína resulta letal para la bacteria.

   
 Sistema de expresión en “dos pasos”

– Cromosomal lac inducible T7 RNA polimerasa

– T7 RNA pol inicia expresión de plasmidio con secuencia codificante
(cDNA)

   
 Expresión Bacteriana de la
hormona de crecimiento
(hGH)

– remoción secuencia señal

humana
– adición secuencia señal
bacteriana

   
 Proteínas Recombinantes con uso clínico

   
 Incorporación de DNA foráneo a nuevo organismo

Inyección en estadío de una célula de pez Medaka

•expresión transiente
•expresión permanente

Uso de células ES

Células que Embrión

contienen en estadío de
transgen blastocito
Embrión
modificado
genéticamente

   
Ratones Transgénicos
Síntesis mRNA hormona de crecimiento en repuesta a metales pesados.

   
Resultado fenotípico ratones transgénicos

   
Peces Transgénicos
Complejo hormonal con promotor fuerte en salmón.

   
 Animales Transgénicos

para la expresión de

proteínas recombinantes

de aplicación variada.

   
 Experimento de clonamiento de “Dolly” realizado
por Erich Wilmot en Escocia.
Potencia total de un núcleo de una célula diferenciada

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 Terapia Génica
• Ex vivo TG contempla incorporar el gen a células del cuerpo afectado y
reintroducir las células modificadas al cuerpo.
• In vivo TG introducir el gen directamente al cuerpo.
• Viral-based versus non-Viral-based TG
• Somatic Gene Therapy (OH3)
– … corrects cell populations or tissues.
• Germinal Gene Therapy (OH4)
– … results in whole “transgenic” organisms.

   
Métodos de incorporación de DNA foráneo a células blanco

   
 Paul Simon
“Niño Burbuja”, (1970)

• SCID “severe combined immuno

deficiency disease
• desorden genético recesivo
• Mutación en gen para la enzima
adenosina deaminasa (ADA)
sanguínea
• respuesta inmunológica
disminuida
• no existía terapia hasta
traamiento con TG
• introducción del gen normal en
células ES mediante retrovirus
avirulento
• trasplante de células con gen
ADA normal
• recuperación respuesta inmune
• recuperación vida normal.

   
 ¿Qué nos hace diferentes?

   
   
1. 2.

3. 4.

5. 6.

   
Mutations: Changes in the DNA sequence 
Point mutations: 
­ One base pair is changed.
­ Most common, often harmless, result in Single Nucleotide Polymorphisms (SNP’s)
1) Missense: Results in one aminoacid change. Can be serious
2) Nonsense: Change a codon into a stop codon. The resulting protein is shorter, lacking 
aminoacids. 
Frameshift mutations:
­ One or two base pairs are inserted or deleted
­ They change every subsequent codon, causing large changes. The resulting proteins can be 
shorter, but will definitely have many differences, making them non­functional.
1) Addition : one or more bases are added.
2) Deletion: One or more bases are deleted.

   
PCR-SSCP: POLIMORFISMO CONFORMACIONAL DE CADENA UNIC

DNA Mutado DNA Control Mut Normal E

l
e
c
PCR t
r
o
f
o
r
e
s
i
s

   
 ELECTROFORESIS BIDIRECCIONAL: PROTEOMA

Mezcla pH 4.0
proteica
Separación por carga Isoelectroenfoq
(1º dirección) ue

Aplicación sobre pH 10.0

el 2º gel

pH4.0 pH 10.0

Separación por PAGE- SDS

tamaño
(2º dirección)

Tinción
  con nitrato de plata;  colorantes fluorecentes
 Rango de 1 unidad de pH: 1000 spots de proteínas

Isoelectroenfoque

Peso molecular x 10-3

PAGE-
SDS
Analisis con espectrometría de masa MALDI-TOF-MS

   
Definición

Transgen: Gen foráneo introducido en un organismo.

Gen Knockout: Mutación selectiva de un gen y posterior

reemplazo del gen normal, inactivándolo, es decir,
haciendo nula su función en el genoma del mutante.

Recombinación homóloga: el fragmento de DNA introducido

reemplaza al gen endógeno. Poco frecuente.

Recombinación no homóloga: el fragmento de DNA

introducido se inserta en sitio no específico. Alta
frecuencia.

   
   
 Rhys Evans (April 2002 UK)
• Gene Therapy used to 
cure a toddler of 
SCID
• Took Bone Marrow 
from the child, then 
used a virus to carry a 
new version of the 
gene into the immune 
cells from the 
marrow.
   
 Micro RNA (miRNA)
• a family of  21–25­nucleotide small RNAs that 
negatively regulate gene expression at the post­
transcriptional level;
• primary transcripts of miRNAs are processed 
sequentially by two RNase­III enzymes, Drosha and 
Dicer, into a small, imperfect dsRNA duplex 
(miRNA:miRNA*) 
 mature miRNA strand plus its complementary strand 
(miRNA*). 

• RNA­induced silencing complex (RISC) is operated 
  by miRNA;miRNA* and Ago­proteins
 
 Depending on RISC components,
RISC may target homologous mRNA
for cleavage,
  or stall mRNA translation 
 Elizabeth P Murchison
    and Gregory J Hannon
miRNA incorporated into effector complexes