UD 9: TÉCNICAS DE

SEPARACIÓN DE SUSTANCIAS

MÓDULO:
TECNICAS GENERALES DE LABORATORIO
 CONTENIDOS
1. INTRODUCCIÓN

2. FILTRACIÓN

3. DECANTACIÓN

4. DIÁLISIS

5. CENTRIFUGACIÓN

6. ELECTROFORESIS

7. CROMATOGRAFíA
 INTRODUCCIÓN

Muestra biológica  antes de comenzar  elegir la técnica o método más adecuado.

Tener en cuenta las propiedades físicas y estructurales de las sustancias o moléculas y los objetivos del estudio de la muestra.

Propiedades físicas de las sustancias o moléculas:

● Forma: la configuración molecular, permite distinguir moléculas de la misma naturaleza química, pero distinta conformación.

● Tamaño: permite su distinción de otra con la misma naturaleza química.

● Carga: la carga suele venir definida por el medio en el que se encuentren, así como por los grupos ácidos o básicos de su
superficie. Estas sustancias se podrían separar por simples variaciones de pH del medio donde se encuentran o del nº de cargas
positivas o negativas que presente un determinado medio.

● Polaridad: depende del nº de enlaces polarizados que presente y de la distribución de los mismos. Un enlace está polarizado,
cuando hay una distribución desigual de los e-, entre los átomos que forman ese enlace. A mayor polaridad de un enlace, más
polar va a ser la molécula y más fuerte la interacción.

● Volatilidad: capacidad de una sustancia o molécula de pasar de estado sólido o líquido a estado gaseoso. Además, cuanto más
débil sea la interacción entre las moléculas (sustancias poco polares), más elevada es la volatilidad
 FILTRACIÓN
La filtración es un método que implica separación de partículas sólidas dentro de una disolución. Es una
de las técnicas de separación más frecuentes utilizadas en el laboratorio.

Tiene dos aplicaciones generales:

• Eliminar impurezas sólidas presentes en una disolución que os nos interesen.

• Separar el filtrado (sustancia sólida separada) y recogerlo con algún interés

analítico.

Este método es muy utilizado cuando queremos deshacernos del disolvente.

Puede que nos interese quedarnos con el sólido o el filtrado.

 FILTRACIÓN
En un proceso de filtración siempre vamos a tener:

• La sustancia porosa o filtro: retiene las partículas.

• El sedimento: parte sólida.

• Filtrado: parte líquida

• Fuerza filtrante: fuerza que obliga a pasar el líquido a través del filtro.

Existen varios métodos en función de los que nos interese aislar.

Describiremos los más utilizados en un laboratorio de análisis clínicos y anatomía patológica.

 FILTRACIÓN
Se suele utilizar un papel de filtro, papel fabricado de celulosa con tamaño de poro
varIable, aunque existen más tipos de filtro dependiendo de su composición y finalidad.

TIPOS DE FILTROS

● Filtro de papel: fibras de celulosa con un tamaño de poro de 2-30µ. Su gramaje

(g/m2) indica la capacidad de carga. A mayor gramaje mayor resistencia a la rotura.

● De microfibra de vidrio: fibra de vidrio de borosilicato. Gran capacidad de carga y

alta capacidad de retención de partículas de pequeño tamaño, hasta de <1µ. Se
utilizan en filtrados de proteínas y células.

● Filtros de membrana: delgadas películas de polímeros con poros muy finos de 0,3
a 10 µ. El filtrado queda ultralimpio y estéril. Se suelen usar en microbiología.
Materiales: acetato de celulosa, nylon, teflón - filtración de solventes orgánicos
agresivos, hidrofóbico
 FILTRACIÓN
En el campo de la aplicación clínica en el laboratorio, las
principales sustancias a filtrar son:

● Los microorganismos o contaminantes, como pueden

ser los virus, las bacterias, los hongos, las endotoxinas o
el polen;

● Las partículas biológicas, como pueden ser los coloides,

las proteínas, los lípidos, los hidratos de carbono o los
ácidos nucleicos.

En la tabla se exponen estas diferentes sustancias, el tipo de

filtro de se podría usar en cada uno de los casos, el tamaño de
poro necesario para retenerla
 FILTRACIÓN
TIPOS DE FILTRACIÓN
Por gravedad:

● Filtro liso

● Filtro de pliegues

Por vacío o a presión reducida

Por material poroso

A pequeña escala con pipeta Pasteur o filtros adaptados.

 FILTRACIÓN
TIPOS DE FILTRACIÓN

Por gravedad: utilizamos la fuerza gravitatoria para hacer pasar un líquido a través de un embudo con un filtro y obtener la separación. El
sólido queda retenido en el embudo y el líquido queda en el vaso colector.

Se suele utilizar papel de filtro, se coloca de forma cónica, por su adaptación a los embudos. Es frecuente utilizarlo de manera que forme
unos pliegues, pero también se puede utilizar liso.
● Filtro liso: cuando nos interesa quedarnos con el sólido. Se suele hacer una pequeña rasgadura para que se adhiera mejor el papel al
embudo y no se formen burbujas de aire. También se humedece un poco antes de iniciar la filtración.

● Filtro de pliegues: cuando nos interesa quedarnos con el filtrado. Debe sobresalir un poco por encima del embudo, no hay que usar el
diámetro del embudo para hacer el primer recorte porque si no queda un filtro muy pequeño. El de pliegues el más rápido porque
tiene más superficie de filtración.
 FILTRACIÓN
Filtración por gravedad
El procedimiento llevado a cabo para realiza una filtración por gravedad se divide en tres partes.
Seleccionando el poro del papel del filtro necesario para nuestro proceso atendiendo al material que queramos filtrar.
.

Primera parte:
1. Recortar un círculo de papel de filtro de tamaño ligeramente superior al embudo que vamos a
utilizar y doblar por la mitad. El papel debe sobresalir un poco del embudo, entre 0,3 cm y 0,5
cm.
2. Doblar por la mitad.
3. Doblar el semicírculo por la mitad.
4. Abrir el pliegue.
5. Doblar cada una de las mitades hacia el centro en la misma dirección.
6. Volver a doblar cada una de las nuevas mitades otra vez por la mitad, en la misma dirección.
7. Desplegar el papel y doblar las mitades de nuevo por la mitad, pero en dirección opuesta.
8. Abrir el filtro.
.
 FILTRACIÓN
Segunda parte:
1. Con un soporte de pie y un arco metálico, sujetar un embudo de vidrio.
2. Debajo del embudo, colocar un matraz Erlenmeyer o un matraz de boca estrecha. Es importante, que exista un flujo de aire
entre el embudo y el matraz para igualar las presiones de dentro y de fuera.
3. Colocar el filtro de papel dentro del embudo.

Tercera parte:
1. Verter el matraz con la disolución a filtrar dentro del embudo con el papel de filtro. Enfocar al centro del embudo al principio y después, repartir por
toda la superficie para evitar la saturación del filtro.
2. Al llegar al final, arrastrar el sólido que queda en el matraz; para ello, añadir un poco más del disolvente utilizado para realizar la disolución.
Podemos utilizar una espátula para empujar el sólido hacía el embudo y así. asegurarnos que se filtra todo el contenido de la disolución.
3. Lavar con un poco de disolvente el matraz que contenía la disolución inicialmente y vertemos en el embudo. A veces, hay que añadir disolvente
previamente calentado ayuda a disolver impurezas y eliminarlas.
.
 FILTRACIÓN

Por a vacío o a presión reducida: la fuerza impulsora para que el líquido atraviese el filtro es la que ejerce la presión atmosférica cuando
aplicamos el vacío al sistema.

Es el método más rápido y a veces permite la filtración de aquellas suspensiones en las que la fuerza de gravedad no es suficiente para el
proceso. Es de utilizad cuando tenemos mucho solido que filtrar o si el precipitado es muy fino.

El equipo para filtrar a presión reducida requiere una bomba de vacío. Creando el vacío, se fuerza a que la disolución pase velozmente a
través del filtro. Para ello se necesitan materiales que aguanten la presión del vacío sin fracturarse, por tanto, deberán ser de vidrio o de
cerámica.

El embudo puede ser de dos tipos: Büchner o Hirsch. El Büchner se utiliza para cantidades más
grandes que el Hirsch. Los dos tienen un funcionamiento similar.

El embudo Büchner es un embudo de cerámica con un fondo agujereado para permitir el paso del
líquido. El Hirst es igual, pero con forma cónica. El más utilizado de los dos es el embudo
Büchner.
 FILTRACIÓN

Por a vacío o a presión reducida

El procedimiento es el mismo que en el proceso anterior, con ligeras modificaciones. .
Primera parte:
1. Colocar el matraz Kitasato (necesario que tenga la boca de vacío) sobre un pie metálico y sujetar apretando la parte
estrecha del matraz con unas pinzas. Sujetar bien, pero no presionar.
2. Colocar un cono de goma en la boca del Kitasato, que servirá como adaptador y colocar el embudo encima. Encajar
bien el embudo para que no existan fugas y se pueda hacer el vacío correctamente..
3. Colocar un papel filtro del mismo tamaño o ligeramente inferior al de la superficie horizontal del embudo. El filtro que
utilizamos para esta filtración es un filtro redondo y plano. El filtro se adapta al embudo que tenemos.
4. Con una goma unir la boca del vacío del Kitasato con la boca de la bomba de vacío. La bomba de vacío tiene una llave
que se abre y se cierra para generar el vacío. Es recomendable utilizar una trampa de seguridad por si revierte el
contenido del matraz por un cambio de presión. Evitará que parte de la disolución llegué a la bomba y viceversa, que la
contaminación de la bomba llegué hasta la disolución
 FILTRACIÓN

Por a vacío o a presión reducida

Segunda parte: Después del montaje, procedemos a filtrar.
1. Abrir la bomba para crear el vacío y humedecer un poco el papel de filtro situado dentro del embudo con el mismo
disolvente de la disolución. El líquido es succionado hacia el Kitasato. Así, se adhiere completamente a la superficie,
obteniendo una mayor eficacia en la filtración.
2. Verter la disolución a filtrar dentro del embudo con el papel de filtro. Enfocar al centro del embudo al principio y después,
repartir por toda la superficie para evitar la saturación del filtro. Hay que tener cuidado con los bordes del embudo y evitar
que el filtrado caiga en esos puntos.
3. Al llegar al final debemos arrastrar el sólido que queda en el matraz. Para ello, añadimos un poco más del disolvente
utilizado para realizar la disolución.
4. Lavar con un poco de disolvente el matraz que contenía la disolución inicialmente y verter en el embudo. A veces, es
necesario añadir disolvente previamente calentado, ya que ayuda a disolver impurezas y eliminarlas.
5. Conectar el vacío para secar bien el sólido retenido en el embudo. Si se extiende por la superficie, ayudará a su secado.
6. Desconectar el vacío para evitar accidentes e incidentes.
FILTRACIÓN

Filtración a pequeña escala con pipeta Pasteur o con filtros adaptados:

Se sigue el mismo procedimiento que para filtrar por gravedad. Como embudo tenemos una pipeta con un
algodón, o una bola de lana de vidrio, compactado en la parte más estrecha. Se utiliza para cantidades
pequeñas de líquido.

Se usan filtros comerciales de pequeño tamaño, los cuales llevan una membrana adecuada a la naturaleza de
la sustancia que se quiere filtrar. Para efectuar el filtrado nos ayudamos de una jeringuilla.

El procedimiento sería el siguiente:

1. Con la jeringuilla extraemos la disolución de lo que queremos filtrar.
2. Una vez esté la disolución dentro de la jeringuilla, colocamos el filtro en ella.
3. Empujamos con el émbolo de la jeringuilla hasta el final, vertiendo el filtrado en un recipiente nuevo y
limpio.
FILTRACIÓN

Filtración con material poroso:

Básicamente es el mismo procedimiento que el filtrado por gravedad o por presión reducida, ya que se pueden utilizar los dos
métodos de filtrado, pero la diferencia es que se hace pasar por un material que retiene partículas finas, previamente
compactado. Se suele utilizar para filtrar soluciones coloidales o polvorientas. En ocasiones, se utiliza como primera filtración y
después, se filtra con cualquiera de los otros métodos
FILTRACIÓN

● Tenemos filtros de diferentes materiales y de diferentes tamaños para adaptarlos a diferentes jeringuillas de diferentes tamaños.

● Entre los materiales más comunes se encuentra la celulosa, la fibra de vidrio, distintos tipos de polímeros de plásticos, etc.
Podemos, incluso, filtrar según la naturaleza hidrófoba o hidrofílica de la disolución, ya que existen cada vez más, filtros
adaptados para ello.

● Se utilizan normalmente jeringuillas de plástico, pero si conocemos la naturaleza de la disolución a filtrar y su comportamiento
frente al agua, se pueden usar, en caso de que fuera necesario, de vidrio.
DECANTACIÓN

Proceso físico de separación de mezclas, principalmente heterogéneas, utilizando en exclusiva para separar mezclas de
sólido-líquido y de líquido-líquido.

Fundamento: se basa en la diferencia de densidades entre los componentes que forman la mezclan, por los que al
dejarlos en reposo se produce la separación de ambos.

Aplicaciones: Se suele emplear la separación de dos líquidos inmiscibles, cuando se han tenido que mezclar para algún
tipo de reacción, por una simple contaminación. Esta técnica es menos eficaz que la filtración o la centrifugación, por
tanto, se suele utilizar como paso previo, para eliminar partículas grandes.
DECANTACIÓN

TIPOS DE DECANTACIÓN
● Sólido-líquido: Se utiliza cuando un componente sólido se deposita en un
líquido. Si el sólido es bastante denso y grueso, puede depositarse en el fondo
del contenedor. Así, cuando el contenedor está inclinado, el líquido o
sobrenadante puede ser separado, derramándose en otro recipiente.
● Líquido-líquido: Se separan los líquidos que no se pueden mezclar y tienen
densidades diferentes; el líquido más denso se acumula en la parte inferior del
sistema.
Se necesita un embudo de bromo o embudo de decantación, que es un
embudo especializado que se utiliza sobre todo para la separación de
componentes líquidos.
DECANTACIÓN
Procedimiento de decantación líquido-líquido:

1. Montar el soporte metálico con el embudo de decantación, asegurándose que la llave del embudo está cerrada.

2. Colocar el vaso de precipitado debajo del embudo.

3. Añadir la mezcla homogénea al embudo de decantación.

4. Esperar el tiempo necesario para que se produzca la separación de los componentes.

5. Cuando estén los componentes separados abrir la llave del embudo para liberar el componente que se sitúa en la parte
inferior del embudo.

6. Quitar el vaso de precipitado con el primer componente y colocar un 2º vaso de precipitado, para extraer el segundo
componente.
 DIÁLISIS
● Proceso de separación química de dos o más sustancias, a través de una membrana semipermeable.
● Fundamento: las sustancias se separan gracias la diferencia existente entre los índices de difusión de dichas sustancias,
es decir, por la presión osmótica que se genera a través de la membrana semipermeable.

● Procedimiento:
1. Colocar la muestra con las distintas sustancias en un recipiente y conectarlo a otro
recipiente, normalmente con agua pura, a través de una membrana semipermeable.

2. Una vez que los dos recipientes están unidos, las moléculas con menor tamaño,
como el agua, algunas sales o iones, podrán pasar a través de la membrana, desde
donde están en mayor concentración a donde están en menor concentración.

3. Las moléculas de mayor tamaño, como las proteínas o los ácidos nucleicos que no
pueden atravesar los poros de la membrana se quedarán en el lugar donde sean
depositados, normalmente la muestra a analizar.
ACTIVIDADES
● Contesta a las siguientes cuestiones:

Indica qué técnica utilizarías para cada una de las siguientes suspensiones, justificando tu respuesta.

● Solución bacteriana

● Mezcla heterogénea de dos líquidos

● Suspensión coloidal

● Antibiótico termolábil

Realiza un esquema de filtración por vacío.

Realiza un esquema de filtración por gravedad.

¿Cuáles son las diferencias entre la filtración a vacío y la filtración por gravedad=

¿Ventajas de utilizar un filtro de pliegues frente al filtro liso?

ACTIVIDADES
● Contesta a las siguientes cuestiones:

Indica qué técnica utilizarías para cada una de las siguientes suspensiones, justificando tu respuesta.

● Solución bacteriana: filtro de membrana de poro 0,1-50uM (en función del tamaño de las bacterias)

● Mezcla heterogénea de dos líquidos: embudo de decantación

● Suspensión coloidal: filtro de membrana 0,1-0,15uM

● Antibiótico termolábil: jeringuilla con filtro

¿Ventajas de utilizar un filtro de pliegues frente al filtro liso?

- La superficie de filtración es mayor, aumentando así la velocidad de filtración.

- Permite el paso del aire, dado que al tener pliegues, el papel de filtro no se adhiere a las paredes del embudo.
ACTIVIDADES
Realiza un esquema de filtración por vacío. Realiza un esquema de filtración por gravedad.