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Funciones de

los ácidos nucleicos

PCR como
herramienta de estudio

Alejandra Estévez, PhD

alestevez@yahoo.com
Universidad del Valle de Guatemala
Temas a tratar en la presentación
• Resumen de ácidos nucleicos.
• Composicion de ácidos nucleicos.

• Funciones de ácidos nucleicos (transcripción y traducción).

• Herramientas para estudiar dichas funciones.


> RNA--- RT-PCR, Primer extension, Northern Blot
> DNA---PCR, Southern Blot, AFLPs, RFLPs
• PCR : diseño de reacción, programas de amplificación y diseño
de primers.
• Modificaciones del PCR
Temas a tratar en la presentación
• Resumen de ácidos nucleicos.
• Composicion de ácidos nucleicos.

• Funciones de ácidos nucleicos (transcripción y traducción).

• Herramientas para estudiar dichas funciones.


> RNA--- RT-PCR, Primer extension, Northern Blot
> DNA---PCR, Southern Blot, AFLPs, RFLPs
• PCR : diseño de reacción, programas de amplificación y
diseño de primers.
• Modificaciones del PCR
Breve resumen de ácidos nucleicos
• La información que dicta las estructuras de la enorme variedad de
moléculas de proteínas que se encuentran en los organismos está
codificada en moléculas conocidas como ácidos nucleicos.

• La información contenida en los ácidos nucleicos es transcripta y luego


traducida a las proteínas.

• Son las proteínas las moléculas que finalmente ejecutarán las


"instrucciones" codificadas en los ácidos nucleicos.

• Los ácidos nucleicos están formados por cadenas largas de nucleótidos.


Breve resumen de ácidos nucleicos

Un nucleótido está
constituido por tres
subunidades
diferentes: un grupo
fosfato, un azúcar de
cinco carbonos y una
base nitrogenada
Breve resumen de ácidos nucleicos

• Tipos de azúcar : DNA (desoxirribosa) , RNA (ribosa)


Breve resumen de ácidos nucleicos

• Tipos de bases nitrogenadas

Uracilo se encuentra únicamente en el RNA


Breve resumen de ácidos nucleicos

ESTRUCTURA DEL ADN

*Esqueleto de desoxirribosa-
fosfatos

* Cadenas antiparalelas
5’ -3’ / 3’-5’

* T-A (dos ptes de Hidrógeno)

* C-G (tres ptes de Hidrógeno)


Breve resumen de ácidos nucleicos

• Estructura de un ácido nucleico.


Temas a tratar en la presentación
• Resumen de ácidos nucleicos.
• Composicion de ácidos nucleicos.

• Funciones de ácidos nucleicos (transcripción y traducción).

• Herramientas para estudiar dichas funciones.


> RNA--- RT-PCR, Primer extension, Northern Blot
> DNA---PCR, Southern Blot, AFLPs, RFLPs
• PCR : diseño de reacción, programas de amplificación y diseño
de primers.
• Modificaciones del PCR
Funciones de los ácidos nucleicos

• Aunque sus componentes químicos son muy semejantes, el DNA y el RNA


desempeñan papeles biológicos muy diferentes.

• El DNA es el constituyente primario de los cromosomas de las células y es


el portador del mensaje genético.

• La función del RNA es transcribir el mensaje genético presente en el DNA y


traducirlo a proteínas.

El descubrimiento de la estructura y función de estas moléculas es hasta


ahora, indudablemente, el mayor triunfo del enfoque molecular en el estudio
de la biología.
Funciones de los ácidos nucleicos: (I) transportadores de energía

• Los nucleótidos, además de su papel en la formación de los ácidos


nucleicos, tienen una función independiente y vital para la vida celular.

Cuando un nucleótido se modifica por la unión de dos grupos fosfato, se


convierte en un transportador de energía, necesario para que se produzcan
numerosas reacciones químicas celulares.

• El principal portador de energía, en casi todos los procesos biológicos, es


una molécula llamada adenosín trifosfato o ATP

Ciclo de Krebs
Fotosintesis
Funciones de los ácidos nucleicos: (I) transportadores de energía

SIGNIFICADO ENERGÉTICO

• La energía contenida en los glúcidos de reserva como el almidón y el


glucógeno, y en los lípidos, puede verse como el dinero depositado a plazo
fijo; no esta disponible fácilmente.

• La energía de la glucosa es como el dinero en una cuenta corriente,


accesible, pero no tanto como para realizar todas las operaciones
cotidianas (catabolizada previamente).

• La energía en los nucleótidos modificados, en cambio, es como el dinero de


bolsillo, disponible en cantidades convenientes y aceptado en forma
generalizada e inmediata.
Funciones de los ácidos nucleicos: (II) portador de la información genética

• El DNA es el constituyente
primario de los cromosomas de
las células y es el portador del
mensaje genético, contenido en
unidades o “genes”.

Para diagnosticar las mutaciones a


nivel cromosómico: ABERRACIONES
CROMOSÓMICAS, se construye un
CARIOTIPO.

Esto implica el cultivo de las células


en el laboratorio y la cosecha de los
cromosomas cuando la célula está en
metafase.

Se obtiene una suspensión de células


que se gotea en un portaobjeto, se
tiñen y se analizan al microscopio.
Funciones de los ácidos nucleicos: (II) portador de la información genética

DNA  cromosomas  gen

¿Qué es un gen?
• Es una secuencia de nucleótidos en la molécula de ADN, equivalente a
una unidad de transcripción.

• Contiene la información, a partir de la cual se sintetiza un polipéptido,


una enzima, un ácido ribonucleico: mensajero, de transferencia,
ribosomal o pequeños ARNs reguladores.

• En el genoma humano la mayoría de los genes son únicos y se


expresan en forma independiente.
Funciones de los ácidos nucleicos: (II) portador de la información genética

Modelo simplificado de un gen humano

PROMOTOR
Secuencia que no se traduce Secuencia que no se traduce

Intrón 1 Intrón 2 Intrón 3

5` 3`

Región reguladora EXON 1 EXON 2 EXON 3 EXON 4 EXON n Región reguladora

Unidad de transcripción
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÌA MOLECULAR

Hebra molde

Transcripción

Traducción
El código genético es la secuencia de nucleótidos en el ARNm,
cada tres = un codón, significa un aminoácido en la proteína

Se dice que el código genético “es degenerado”


Funciones de los ácidos nucleicos: (III) Expresión de la información genética

Tipos de RNA
Los distintos tipos de RNA permiten la expresión del DNA:

• Como mensaje genético que determina la secuencia de


aminoácidos en la síntesis de proteína: RNA mensajero o
mRNA (3-5% del RNA celular).

• Como molécula que activa a los aminoácidos para poder ser


incorporados en una nueva proteína: RNA de transferencia o
tRNA (10% del RNA celular).

• Como elemento estructural básico de las partículas encargadas


de llevar a cabo la síntesis proteica, los ribosomas: RNA
ribosómico o rRNA (80-85% del RNA celular)
Funciones de los ácidos nucleicos: (III) Expresión de la información genética

• Transcripción
(núcleo)
 Iniciación
 Elongación
 Terminación

• Traducción
(citoplasma)
 Iniciación
 Elongación
 Terminación
Transcripción Traducción
DNA mRNA proteínas

• Transcripción = síntesis de
ARNm.
• Ocurre en el interior del núcleo
(cel eucariotas).

• Necesita:
– Una cadena de ADN que
actúe como molde.
– Enzimas: ARN-polimerasa.
– Ribonucleótidos trifosfato
de A, G, C y U.
Funciones de los ácidos nucleicos: (III) Expresión de la información genética

Proceso de Transcripción:

• Iniciación La ARN-polimerasa hace que la doble hélice de ADN se abra 


exposición de la secuencia de bases del ADN  unión de los
ribonucleótidos.
• Elongación Adición de sucesivos ribonucleótidos para formar el ARN. La
cadena de ARN sintetizada es complementaria a la hebra de ADN que se
utiliza como molde.
ARN-polimerasa: “lee” ADN 3’-5’

síntesis ARN 5’-3’


• Terminación La ARN-pol reconoce en el ADN unas señales de
terminación que indican el final de las transcripción. Implica la separación
de la ARN-pol del ARN transcrito.

mRNA >>Extremo 3’ se añade una secuencia de ribonucleótidos de


adenina
cola poli-A (utilizar en ensayos de detección).
>>Extremo 5’ se añade una “caperuza” permitirá identificar este
extremo en el proceso de traducción posterior.
Funciones de los ácidos nucleicos: (III) Expresión de la información genética

Traducción

mRNA
rRNA

proteínas
Transcripción Traducción
DNA mRNA proteínas
• La cadena peptídica se sintetiza por la unión de los sucesivos aa que se van
situando en el ribosoma transportados por los correspondientes tARN.
• El ribosoma se desplaza a lo largo de la cadena de mARN.

Ribosoma
Cadena de
amino-
tRNA
ácidos

mRNA

• La velocidad de síntesis proteica es alta: hasta 1400 amioácidos por minuto.


• Varios ribosomas pueden leer a la vez un mismo ARNm = polirribosoma o
polisoma. Mayor efectividad y ahorro de tiempo.
RESUMEN

Funciones de los ácidos nucleicos en una célula

6. Transportadores de energia >>> ATP


7. Portadores de la información genética en cromosomas—
genes
8. Intervienen en el proceso de transcripción y traducción,
procesos que permiten la expresión de la información
contenida en el DNA nuclear.
Temas a tratar en la presentación
• Resumen de ácidos nucleicos.
• Composicion de ácidos nucleicos.

• Funciones de ácidos nucleicos (transcripción y traducción).

• Herramientas para estudiar dichas funciones.


> RNA--- RT-PCR, Primer extension, Northern Blot
> DNA---PCR, Southern Blot, AFLPs, RFLPs
• PCR : diseño de reacción, programas de amplificación y
diseño de primers.
• Modificaciones del PCR
Herramientas para estudiar dichas
funciones?

> RNA--- RT-PCR, Primer extension,


Northern Blot

> DNA--- PCR, Southern Blot, AFLPs


Temas a tratar en la presentación
• Resumen de ácidos nucleicos.
• Composicion de ácidos nucleicos.

• Funciones de ácidos nucleicos (transcripción y traducción).

• Herramientas para estudiar dichas funciones.


> RNA--- RT-PCR, Primer extension, Northern Blot
> DNA---PCR, Southern Blot, AFLPs, RFLPs
• PCR : diseño de reacción, programas de amplificación y
diseño de primers.
• Modificaciones del PCR
Estudio de las Funciones de los ácidos nucleicos:
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

• Concepto básico: repetición


• Originalmente la única
cíclica de la síntesis de DNA
forma de obtener
dirigida por oligonucleótidos
suficientes copias de un
complementarios a un DNA
fragmento de DNA para
blanco (primers) produce una
estudiarlo era clonando en
amplificación geométrica
bacterias
(logarítmica).

• 1983- Kary Mullis (Cetus)


• Finalidad: detectar la
inventa el PCR
presencia/ausencia de una
zona especifica del DNA.
PCR: Ingredientes
• Molde de DNA (50-1000ng/100 µl para
genes de una copia)

• Bases de datos de secuencias


(Proyectos de genomas)

• Oligos iniciadores (primers) de 16-27 nt


(0.1-0.5 µM)

• Polimerasa de DNA termoestable:


termoestable Taq,
Pfu (antes tenían que agregar enzima
después de cada ciclo)

• dNTPs (los bloques de construcción del


DNA, sustratos de la Taq)

• Magnesio (cofactor de la Taq)

• Termociclador : una máquina que


cambie temperaturas automáticamente,
en ciclos de 95ºC, 55ºC y 72ºC
(programa de amplificación**)
PCR: Programa de Amplificación
• Denaturalización Inicial

• Desnaturalización

• Hibridación o Annealing
X Ciclos

• Extensión

• Extensión Final
PASO 1: Desnaturalización
(94º-98ºC)

Desnaturalización con calor


para abrir las hebras de
DNA y permitir hibridación
con oligos iniciadores
específicos (primers).
PASO 2: Annealing (45º-65ºC)
• Los oligos se unen al DNA
molde
• La temperatura controla la tasa
de hibridación (annealing).
• A 55ºC, bajo la mayoría de
condiciones de sal, oligos de 18
Exceso de oligos nt forman uniones de hidrógeno
con el molde de DNA
•La reacción es eficiente porque
existen oligos en exceso de 108. • Se ajusta la temperatura de
acuerdo al contenido de G/C o
•10,000 moléculas (1.6x10-20 A/T y al largo del oligo (sitios
moles) de molde vs. 5 picomoles web calculan el Tm basado en
(5x10-12 moles) de oligos concentración de sal y
secuencia)**
PASO 3: Extensión
(65º-75ºC)
• Gracias a la estabilidad de la
polimerasa aislada de
bacterias que viven a altas
temperaturas, la extensión se
hace a una temperatura
mayor a la de la hibridación,
asegurando especificidad.
• El largo del producto
esperado determina el tiempo
necesario para la extensión
(1 min/kb).
• Taq trabaja de 5’ ---3’ con su
actividad exonucleasa
Repetición: X ciclos

• Denaturalización Inicial

• Desnaturalización
• Hibridación o Annealing X Ciclos
• Extensión

• Extensión Final

• Se suele utilizar de 25 a
40 ciclos, según los reque-
rimientos del protocolo.
Resultado
2N

• La secuencia entre los oligos es copiada


exponencialmente (no el molde original)
original

• Empezamos con 2 oligos unidos a hebras


complementarias y con puntas 3’
apuntando hacia cada uno

• Terminamos con copias del molde que


contienen puntas 5’ idénticas a cada oligo

• Dato: las Taqs dejan extremos 3´con Poli


A, propiedad que puede aprovecharse
para realizar TA cloning.
El termociclador
• Aparato programable para
variar la temperatura de un
bloque de metal que conduce
el calor a las muestras dentro
de un tubo de plástico.

• Para obtener cambios de


temperatura eficientes, se
necesita máximo contacto
entre tubo y bloque de
calentamiento.

• Se usan tubos o placas de


pared delagada de 0.2mL.

• El volumen de reacción (10-


100 µl) afecta la eficiencia

Si el termociclador no tiene tapadera caliente, debe usarse aceite


mineral para cubrir la reacción y prevenir evaporación y condensación
en la tapadera
Programación del termociclador
Archivo del termociclador:
•Temperatura y tiempo de cada
incubación
•Número de ciclos
•Ligación a otros programas
•Algunos termocicladores
pueden variar la velocidad a la
que cambia de una temperatura
a otra (ramp rate)
•Algunos termocicladores con
opción a “gradiente”
gradiente de
temperatura, que permite
evaluar distintas temperaturas
de annealing a la vez
Especificidad
• Temperaturas abajo de 50ºC
permiten hibridación no específica
en la que el oligo forma sólo algunos
pares de base con el molde

Parámetro
fundamental: • Los productos pequeños son
sintetizados más rápidamente,
Tm o melting siendo más competitivos
temperature de los
primers
• A pesar de que la hibridación
original no era específica, los
productos acumulados sí tendrán
Visualización del producto de
hibridación perfecta con el oligo y
PCR mediante un gel de
competirán por los reactivos con el
agarosa.
producto no deseado.
Factores determinantes de
especificidad
• Mg+2 es cofactor de
Taq, estabiliza la
interacción entre
hebras de DNA (a
bajas concentraciones,
los dNTPs lo atrapan)
• A altas [Mg+2] menor
astringencia**
• El Tm determina la
temp de hibridación
(5ºC abajo del Tm).
Qué es la Astringencia?
• Los factores que más influyen en el proceso de hibridación (afectan
especificidad) son la temperatura,
temperatura el pH y la concentración de cationes (Mg2+).

• La modificación de estos parámetros condiciona la fidelidad con la que se


produce el annealing… en inglés esta situacion se denomina “stringency”,
traducido en ocasiones como “astringencia” es decir, el número de pares de
bases erróneos que puede tolerar un híbrido bajo ciertas condiciones.

• Si se emplean soluciones con baja concentración salina o la reacción se lleva a


cabo a temperatura elevada, es poco probable que se forme un híbrido estable
(hibridación de gran fidelidad o de "high stringency").
stringency Estas condiciones se usan
para evitar la aparición de falsos resultados positivos.

• Por el contrario, las soluciones con alta concentración salina o las bajas
temperaturas permiten la formación de híbridos imperfectos (algunos pares de
bases no están correctamente emparejados). Estas condiciones de baja fidelidad
(“low stringency”)
stringency se usan para detectar secuencias relacionadas con la del
primer, aunque no sean perfectamente complementarias (por ejemplo, para
géneros de bacterias o para detectar genes relacionados con algún gen ya
caracterizado).
RESUMEN
Factores a tener en cuenta en una reacción de PCR

• Seleccionar el programa de amplificación ADECUADO: temperatura


de annealing de acuerdo al TM de los primers y número de ciclos.
• Fidelidad o Astringencia: regular la concentración de sales – cloruro de
magnesio cofactor de la Taq- según nuestro interés (permitimos o no
uniones imperfectas).
• Reactivos utilizados: Taq nativa, Taq recombinante, Taq hotstart, Taq
Platinum (con act proofreading).
• Cantidad de sustrato: no saturar la reacción con demasiado DNA.
• Presencia de inhibidores: diluir muestra, ejemplo muestras de sangre.
• Diseño de primers (ejercicio de la práctica del día de hoy).
Temas a tratar en la presentación
• Resumen de ácidos nucleicos.
• Composicion de ácidos nucleicos.

• Funciones de ácidos nucleicos (transcripción y traducción).

• Herramientas para estudiar dichas funciones.


> RNA--- RT-PCR, Primer extension, Northern Blot
> DNA---PCR, Southern Blot, AFLPs, RFLPs
• PCR : diseño de reacción, programas de amplificación y
diseño de primers.
• Modificaciones del PCR (para trabajar con DNA)
Modificaciones al PCR: PCR Multiplex
Multiplex
• Varias parejas de oligos para diferentes secuencias
Objetivo:
• Buscar varias regiones del DNA simultáneamente
• Controles internos de amplificación
• Páneles para varios patógenos más costo-eficientes
• Ej. Detectar P. vivax y/o P. falciparum en una sóla muestra
Modificaciones al PCR: PCR Anidado

• Dos rounds de PCR: 1era amplificación es diluída en una segunda con oligos internos
• Verifica especificidad y diluye inhibidores
• Transferencia de producto abriendo el tubo no es recomendada para uso en
laboratorio clínico CONTAMINACIÓN CON AEROSOLES
• Ej. Diferenciar Entamoeba histolytica de E. dispar, Plasmodium falciparum de P. vivax
Modificaciones al PCR:
PCR en tiempo real
• Ventaja sobre PCRs anteriores es el método de detección del producto de
amplificación: mientras que en el PCR tradicional se debe recurrir a geles de agarosa o
poliacrilamida, en el PCR en tiempo real la máquina va registrando la producción de
producto a medida que se va originando, de aquí su nombre de PCR en “tiempo real”.

• Se basa en detectar la fluorescencia emitida cuando se genera el fragmento específico


durante la amplificación. Existen diversos formatos de detección que, en teoría, se
pueden utilizar con todos los equipos de PCR en tiempo real, aunque cada fabricante
recomienda el formato más adecuado para su(s) sistema(s).

• Formatos de detección

 SYBR® Green
 Sondas marcadas o sondas Taqman®
 "Molecular Beacons"
 Doble sonda marcada o sondas "LightCycler"
PCR en tiempo real:
Formatos de detección
 SYBR® Green
 Sondas marcadas o sondas Taqman®
 "Molecular Beacons"
 Doble sonda marcada o sondas "LightCycler"

SYBR® Green
• Formato más sencillo es el que usa moléculas fluorescentes que se intercalan en el DNA
de cadena doble, siendo la más utilizada SYBR® Green (menos tóxica que el bromuro de
etidio)

• El uso de intercaladores fluorescentes, sin embargo, presenta algunos inconvenientes,


como por ejemplo que cualquier producto amplificado (específico o inespecífico) producirá
fluorescencia o que no se puede utilizar para detectar productos múltiples, aunque hay
técnicas para solventarlos.
PCR en tiempo real:
Formatos de detección
 SYBR® Green
 Sondas marcadas o sondas Taqman®
 "Molecular Beacons" quencher
 Doble sonda marcada o sondas "LightCycler"
Marcador
fluorescente
Sondas Taqman®

• Diseñadas por Applied Biosystems, hacen uso


de la actividad 5' exonucleasa de la Taq (Thermus
aquaticus) DNA polimerasa.

• Estas sondas tienen un marcador fluorescente


en el extremo 5' y una molécula que absorbe
("quencher") la fluorescencia emitida por el
marcador en el otro extremo. La sonda hibrida
con el fragmento específico (si está presente) y, a
medida que se sintetiza la hebra complementaria
al fragmento, la sonda se va degradando por la
acción exonucleasa, liberando el marcador que
ahora sí emite fluorescencia .
Resumen
Modificaciones al PCR

Elegir en función a nuestro objetivo y costos


PCR Multiplex-detección simultánea de blancos
PCR Anidado-especificidad y diferenciación de
especies ó genes
PCR en tiempo real-protocolo más sensible y
rápido, uso diagnóstico, minimiza contaminación.

 SYBR® Green ($)


 Sondas marcadas o sondas Taqman® ($$)
 "Molecular Beacons" ($$$)
 Doble sonda marcada o sondas "LightCycler” ($$$$)
Actividad Práctica

Diseño de Oligonucleótidos
(primers)
Actividad Práctica: Diseño de primers

Existen numerosos programas para el diseño de oligos:

• http://www.autoprimer.com/ Free 30 day trial, free to


Beckman Coulter customers.

• http://www.idtdna.com/ OligoAnalyzer3.0 - Tm, hairpins, dimers,


%GC

• PrimerQuest - primer design, minimum template size is 200bp

• Basic Sciences at the Northwestern University Medical School -


oligonucleotide properties calculator.
http://www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html

• http://healthcare.partners.org/dnacore/oligotoolform.cfm - Takes
into account degererate bases. Do not use degenerate primers in
SNP detection.

• Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_
Actividad Práctica: Diseño de primers
Mediante el uso de programas:

• Encontrar la secuencia blanco (Entrez DNA, http://


www.ncbi.nih.gov/Entrez/)

• Diseñar primers con el Primer3

• Verificar calidad de nuestros primers con el programa de IDT:

> si hay formación de “selfdimers” o “heterodimers” (si


forman dímeros entre si),
> si forman una estructura de tipo “hairpin” (=horquilla),
> si tienen Tm compatibles,

• Verificar utilizando BLAST-N si los primers pegan en alguna región de


algún gen relacionado o especie asociada.

NOTA: Los programas no son infalibles, siempre se debe verificar a MANO


Reglas generales para el
diseño
• <50% GC (Tm abajo de 70ºC)
• Evitar repeticiones de 4 nts
(GGGG)
• G o C en el 3’ (GC clamp)
incrementa la estabilidad del
oligo
• Prevenir usar oligos que
formen “hairpins” (horquillas) o
que hibriden consigo mismos
“homo-dímeros” o con la pareja
“hetero-dímeros”.
• Utilizar ΔG como parámetro.
Tm= Temperatura de fusión
(melting temperature)
• Temperatura a la que el 50% del oligo está en una sóla
hebra y el 50% está en forma de doble hebra

• Se calcula en base a la secuencia y largo (entre más largos,


más alta la temperatura necesaria para separarlos)

• G:C forman 3 puentes de H mientras que A:T forman sólo 2


• Tm=2(NA + NT) + 4(NG+NC) (N=número)

• Rango recomendado: 45-65ºC


• Programa que calcula Tm: http://biotools.idtdna.com/
Ejemplo de cálculo de Tm:
5’ CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC 3’

Regla general Programa IDT


• Tm= (9x4) + (12x2) = 60ºC • Tm=52ºC a 50 mM sal,
• Tm= 57ºC a 100 mM sal
• El cálculo de IDT permite
obtener el Tm en relación a
la [sales monovalentes] en
la reacción
Programa que identifica posibles
dímeros y horquillas http://biotools.idtdna.com/
Perspectiva: de las
computadoras a la vida real

• El uso de programas para diseñar oligos


incrementa la probabilidad de encontrar la mejor
opción, pero en la práctica sólo es por prueba y
error que se pueden identificar oligos que
funcionen bien para cada aplicación !!!!

• Gracias a la nueva tecnología de microarreglos, el


costo de síntesis de oligos ha bajado a la mitad y
es posible hacer más pruebas
Gracias