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MAESTRIA EN TECNOLOGIA DE ALIMENTOS CURSO :BIOQUIMICA DE ALIMENTOS TEMA:

PROTENAS EXTRADAS DE GERMEN DE TRIGO DESGRASADO: PROPIEDADES NUTRICIONALES Y ESTRUCTURALES


Presentador por: Carmen Flores Tania Barrientos Martha Pichihua

La Molina, Septiembre ,2011

OBJETIVO
Estudiar la clasificacin de las protenas sin grasa de germen de trigo en funcin a la composicin de aminocidos. Predecir la calidad Nutricional y distribucin del peso molecular de las subunidades como sus propiedades trmicas.

MUESTRAS DE ANALISIS
Germen de trigo crudo (RWG) Harina de germen de trigo desgrasada (DWGF)

Preparacin de DWGF

RWG fue seleccionado ,limpiado para eliminar contaminantes

Desgrasado con n-Hexano x8hr. Secados al aire. a temperatura aprox. 20C.

Molienda en Molino de martillos, utilizando 60mesh

Almacenamiento en frascos de vidrio a 4

METODOLOGIA DE COMPOSICION PROXIMAL


La composicin proximal de GTR y DWGF se determinaron de acuerdo a los mtodos oficiales de la AOAC 1984.

CONTENIDO DE HUMEDAD
La humedad se determino midiendo la perdida de peso de la muestra al someterla 105 C

5g. De Muestra (GTR ,DWGF )

T :105 C Min.12hr

Enfriar la muestra x 30min

Pesado rpido de muestra

Contenido de humedad (%) = 100(((B-A) - (C-A))/(B-A))


Donde: A = Peso de la charolilla seca y limpia (g) B = Peso de la charolilla + muestra hmeda (g) C = Peso de la charolilla + muestra seca (g)

DETERMINACIN DE CENIZAS
Las cenizas se determino midiendo la perdida de peso de la muestra al incinerarla a 550 C

Pre-calcinar la muestra (GTR ,DWGF )

Incinerar la muestra de 2.5g a 5.0g a 525C en mufla-4hr.

Colocar en el desecador hasta enfriar

Pesado rpido de crisol con cenizas

Contenido de ceniza (%)= 100((A - B)/C)


A = Peso del crisol con muestra (g) B = Peso del crisol con ceniza (g) C = Peso de la muestra (g)

LPIDOS CRUDOS

Los lpidos crudos se evalu utilizando el mtodo de extraccin Soxhlet utilizando Ether de petrleo como disolvente

Lpidos crudos (%) = 100((B - A)/C)


A = Peso del matraz limpio y seco (g) B = Peso del matraz con grasa (g) C = Peso de la muestra (g)

EXTRACCION DE PROTENAS

Nitrgeno en la muestra (%) = 100[((A B)/C) 0.014]


Protena cruda (%) = Nitrgeno en la muestra * 5.45
A = Acido clorhdrico usado en la titulacin (ml) B = Normalidad del cido estndar C = Peso de la muestra (g)

METODOLOGIA: FRACCIONAMIENTO PROTEINAS(OSBORME 1924)


Concentrado y liofilizado

1 Sobrenadante

ALBUMIINA

Pesado de Muestra 1/10 (W/V)


Precipitado re suspender en: Tris- HCl 50mM pH:8 NaCl 0.5mM Precipitado re suspender en: 70% (V/V)-Solucin acuosa 2-propanol (2PrOH)-2hr.

Centrifugar a 4C 8000 RPM x20min.


2 Sobrenadante

Concentrado , dializado con agua DI -72Hr.liofilizado

GLOBULINA

Agitacin en frio 2h T C: Ambiente

Centrifugar a 4C 8000 RPM x20min.


3 Sobrenadante

Concentrado , dializado con agua DI -72Hr.liofilizado

PROLAMINA

Centrifugar a 4C 8000 RPM x20min.


Precipitado re suspender en: 0.05 M NaOH
4 Sobrenadante

Concentrado , dializado con agua DI -72Hr.liofilizado

Centrifugar a 4C 8000 RPM x20min.

GLUTENINA

METODOLOGIA: PREPARACION AISLADO PROTEICO


Se centrifuga nuevamente 3000 RPM x20min. Temp. Ambiente DWGF

Se disperso con NaCl 0.5M (1:8,w/v)-Temp. Ambiente Se ajusto pH 9.5 /30min agitacin

Centrifugar a 3000 RPM x20min. Temp. Ambiente

Los precipitados se lavaron 3 veces con agua pH:4.00

Se ajusta pH: 7.00 con 0.1M Na OH

E l sobrenadante se ajusta pH 4.0 con HCl 1.0M (precipitar protenas)

El precipitado dispersado fue liofilizado

METODOLOGIA: ANALISIS DE AMINOACIDOS


150 mg de proteinas fraccionadas

150 mg de aislado proteico

HIDROLISIS ACIDA 5ml de HCl 6M en atmosfera modificada de Nitrgeno por 24Hr. 110C.

La metionina y la cistena se determino por oxidacin de productos de acuerdo al procedimiento de acido perforico de Moore (1963)antes de hidrlisis en HCl 6M.

Cada hidrolizado se completo con 50 ml de agua destilada en un matraz previamente aforado.

Los aminocidos fueron sometido anlisis RP-HPLC (Agilent 1100)

El triptofano se determino despus de la hidrlisis alcalina por cromatografa de intercambio inico con la derivacin de o-ftaldehido seguido por la deteccin de fluorescencia (Ravindran y Bryden 2005)

La composicin de aminocidos fue reportado aminocido/100 g protena

PARAMETROS DE CALIDAD NUTRICIONAL


1)Proporcin de aminocidos
Aminocidos esenciales de protena (E) Aminocidos Totales en protenas (T)

2)El puntaje de aminocidos (AAS)


mg de aminocidos /g protena de prueba mg de aminocidos /g de la FAO/OMS/UNU patrn STD x100

AAS : Indica que aminocidos son mas limitante de la protena en comparacin con una protena de referencia.

3) Prediccin de ndice de eficiencia de la Protena (PER)


Fue determinado por 3 ecuaciones de regresin desarrollado por Alsmeyer (1974) i. PER=-0.684+0.456 (Leu)-0.047 (Pro) ii. PER=0.468+0.454 (Leu)-0.105 (Try) iii. PER=-1.816+0.435 (Met)+0.780 (Leu)+0.211(His )-0.944(Tyr )

4)Prediccin Biolgica (BV)


Fue calculado usando la ecuacin de regresin of Morup y Olesen (1976) BV=

qi=ai muestra/ai muestra referencial para ai <=ai referencia qi= ai referencial/ ai muestra >=ai referencia ai: representa mg de aminocidos /g total de aminocidos esenciales

SDS-PAGE-ELECTROFORESIS DESNUTARILIZADA
Sistema discontinuo (Laemmli 1970) 4% apilamiento 12% GEL SEPARADOR Corriente constante 20mA-3hr. Teidos con Azul brillante (Coomassie R-250)

Peso Molecular de Protenas

BARRIDO CALORIMETRICO DIFERENCIAL DSC


La desnaturalizacin trmica de las fracciones proteicas fue examinada con -Perkin Elmer DSC Pyris
Muestras liofilizadas (1mg cada una) 10uL de 0.01M buffer (Fosfato) pH:7.5 El barrido se realiza de 30 a 120C Velocidad de calentamiento 10C /min. Indio-STD de temperatura y energa de calibracin La temperatura de desnaturalizacin trmica (Td) y la desnaturalizacin de entalpia (H) se calculo por temrogramas.

ANALISIS ESTADISTICO
Los datos fueron analizados por ANOVA utilizando el paquete estadstico SAS (v. 8.1, SAS Institute, Cary, NC). Mnimos cuadrados (LSD) fueron utilizados para determinar diferencias significativas en el nivel 5%. Cada valor se determina por triplicado. Los resultados se expresan como media Desviacin STD

RESULTADOS Y DICUSIN

Composicin qumica proximal

Rendimiento de rango=24-37%

Composicin de Aminocidos

Calidad Nutricional estimado a base de aminocidos