PRUEBAS BIOQUIMICAS

UTILIZACION DE CITRATO Es uno de los test del IMVIC usado para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de utilizar el citrato como nica fuente de carbono produciendo alcalinidad.

 La prueba se realiza en tubos de medio slido muy inclinados, ya que la utilizacin se produce slo en condiciones aerobias, que contienen un indicador de pH, AZUL DE BROMOTIMOL que vira de color verde a azul al alcalinizarse el medio, adems se considera positivo el hecho de que se formen colonias sobre el agar.

UTILIZACIN DE LACTOSA Es un disacrido compuesto de Glucosa + Galactosa unidos por un puente de oxgeno conocido como B - Galactosdico. Al hidrolizarse, este enlace es daado y libera los dos azcares. Para utilizar la lactosa el microorganismo necesita la presencia de dos enzimas: BGalactsido permeasa que permite el transporte de la molcula a travs de la

pared celular y la enzima B galactosidasa hidroliza el enlace B galactsidico una vez entra a la clula.

PRUEBA ONPG (Orto -nitrofenil B-D- galac topiransido): es un compuesto estructural mente muy similar a la lactosa, excepto en que la glucosa ha sido reemplazada por un grupo O - nitrofenilo.

Esta prueba detecta la enzima BGalactosidasa mucho ms rpido que en la fermentacin de la lactosa. Es ideal para la identificacin de fermentadores tardos de lactosa deficientes en B Galactsido permeasa. El ONPG permeabiliza ms rpidamente la Pared celular que la lactosa y la enzima B galactosidasa la hidroliza en galactosa y O nitrofenol (libre amarillo)

BIOQUIMICAS

ACTIVIDAD CITOCROMO-OXIDASA La presencia de citocromo oxidasa en la cadena de transporte de electrones puede detectarse utilizando un aceptor de eartificial, el tetrametil- pfenilendiamina. Este test se usa para diferenciar Pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo).

Se utiliza como reactivo el tetrametil pfenilendiamina al 1% el cual se encuentra deshidratado en las tirillas de la prueba de oxidasa, sobre ellas se coloca el cultivo a identificar con un asa que no sea de hierro o con un palillo (dara falsos positivos) Es positiva cuando aparece un color azul en la zona de depsito de la bacteria. Debe ser interpretada mximo 10-20 segundos

REDUCCION DE NITRATOS enzima(Nitrato Reductasa) Algunas bacterias pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiracin. El nitrato puede ser reducido a nitrito . Las enterobacterias y Pseudomonas son usualmente positivos. Las bacterias se inoculan en medios que contienen 1% nitrato potsico.

El nitrito procedente de la reduccin de los nitratos puede detectarse aadiendo alfa naftilamina y cido sulfanlico (Reactivo de Griess) producindose un color rosa-rojo complejo Inestable de Diazonio. Reduccin de Nitrato hasta Nitrgeno gaseoso Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido ms que hasta nitrito producindose N2. Si al aadir polvo de zinc no aparece color rojo es que no queda nitrato porque se ha reducido a gas

UTILIZACION DE LA UREA Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa hidrolizan la urea liberando amonio. Se produce un cambio de coloracin por el indicador Rojo de fenol que en condiciones alcalinas vira a rojo. Caldo o agar Urea Stuart fuertemente Tamponado Caldo Urea de Christensen menos tamponado (pequeas trazas)

PRODUCCION DE INDOL, MOTILIDAD Y SULFUROS (SIM):

Es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido Triptfano. A partir de la enzima Triptofanasa indol, cido pirvico y amonio. Se detecta al agregar p dimetilaminobenzaldehido que al reaccionar con el indol Anillo rojo.

Para detectar la produccin de sulfuro de hidrgeno la prueba ms confiable es la de SIM, por carecer de carbohdratos, es semislido y posee hierro peptonizado como indicador y tiosulfato de sodio como fuente de azufre. La movilidad de detecta por el desplazamien to que se proyecta sobre la lnea de inoculacin por la presencia de flagelos.

DESCARBOXILACION DE LA LISINA, ORTININA Y ARGININA: Algunos microorganismos poseen enzimas que pueden descarboxilar aminocidos especficos, remueven molculas de CO2 de un aminocido para formar aminas Alcalinas. Ej.: Lisina cadaverina Ornitina putrescina Arginina citrulina

La ms usada es la descarboxilacin de la Lisina. Indicador prpura de bromocresol. pH del medio inicial es de 6 y desciende a 5.5 por una acidificacin inicial de la glucosa produciendo cidos en pequea cantidad. Luego descarboxila el aminocido y revierte la acidez hasta producir aminas, oscurecindose el medio por el viraje del indicador. Tambin se puede detectar la produccin de H2S y gas.

Otras pruebas bioqumicas:

Agar Hierro Triple Azcar (TSI) Caldo Rojo de Metilo Voges Proskauer Agar Motility Agar OF (Oxidacin Fermentacin) Caldo Malonato Fenilalanina Dnasa Coagulasa

 MEDIOS DE CULTIVO:
1. Agar Mac Conkey: contiene Peptona, polipeptona, lactosa, sales biliares, sal, Agar agar, Rojo neutro, Cristal violeta Las colonias de bacterias fermentadoras de lactosa se observaran rojas con precipitado de sales biliares pH 6.8: Ej: E. coli, Klebsiella, Enterobacter sp. No fermentadores de lactosa transparentes Fermentadores lentas rosa plido 24-48h

Extracto de levaduras, NaCl, Sales Biliares, lactosa, sacarosa, salicina, Tiosulfato de Sodio, citrato frrico de amonio, Fuscina cida, azul de timol. -Ideal para incrementar el crecimiento de Salmonella y Shigella sp. Se producen cidos a partir de los carboh dratos y al reaccionar con la fuscina cida y el azul de timol producen un

2. Agar Hektoen: contiene Peptona,

azufre y el H2S se detecta mediante la fuente de hierro el citrato frrico de amonio. -Los fermentadores rpidos de lactosa (E.coli),son inhibidos moderadamente y producen colonias naranjas brillantes a rosado salmn. -Salmonella sp colonias azul verdoso con centro negro por el H2S. -Shigella sp colonias verdes y plidas a la periferia

-El tiosulfato de sodio es la fuente de

3. Agar Eosina Azul de Metileno: contiene

Peptona, lactosa, sacarosa, HK2PO4, agar, Eosina y azul de metileno. -Fermentadores de lactosa fuertes colonias negro verdoso con brillo metlico. -Fermentadores dbiles (Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Hafnia sp) colonias prpura -No fermentadores (Proteus, Salmonella, Shigella sp) Colonias transparentes EMB levine: carece de sacarosa