CONSERVACIÓN Y CONTROL DE CEPAS MICROBIANAS

Colección de Cultivo y servicio que ofrece

¿Qué son las Colecciones de Cultivo?

- Son organizaciones que principalmente se ocupan de guardar

convenientemente cepas de microorganismos,células superiores o
diversos materiales biológicos y los suministran, previa petición,a
laboratorios microbiológicos o de biología celular.

- Son por lo tanto servicios de apoyo a los trabajos de microbiología

¿Cuándo aparecieron las primeras colecciones de cultivo?

-Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catálogo

-La más antigua Lobaina (Belgica) (Hongos)
-La ATCC,en 1925.No vinculos directos con la Universidad,es de
carácter comercial (Manassas,USA).
-La CECT,nace en el CSIC(Villanueva)(1960).
-PRCC ,Profesor J.L.Ramos (Pseudomonas putida)

A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion internacional

denominada World Federation for Culture Collection (WFCC).
En Europa a su vez estan agrupadas en la “European Culture Colletion
Organization (ECCO) que se fundó en 1982.
Servicios que prestan las Colecciones de Cultivos

1.-Recolección,conservación y suministro de cepas microbianas.

-Recolección: Es el servicio mas típico de una CC. Las

colecciones reúnen cepas que les llegan a través de distintos
conductos, las conservan convenientemente y las suministra
previa petición.
-Conservación:
-Suministro: Se hace por correo de superficie, aéreo o mensa-
jería, pero siempre empaquetado correctamente (tres envueltas)
siempre hay que considerarlo como material “potencialmente
patógeno”

2.-Recopilación de datos de las cepas microbianas y difusión de los

mismos
Fichas, ordenadores, redes electrónicas, publica de catálogos
3.-Servicio de guardería de las cepas microbianas
Se pueden guardar por encargo cepas microbianas,cobrando
una tasa anual y manteniendo el secreto de este depósito.

4.-Identificaciones microbianas.
5.-Depósito de cepas microbianas.

-Depósito público: Cualquier microbiólogo puede depositar

una cepa, que considere interesante,en la colección. Esta cepa se
incorpora en el catálogo y puede suministrarsela a cualquier otro
microbiólogo que la solicite.

-Depósito no público:Algunas CC reciben el nombramiento

de Autoridad Internacional de Depósito para fines de patentes,de esta
manera se garantiza la descripción total y reproducción del proceso
patentado. Una vez conseguida la patente,la cepa puede suministrarse
previa autorización escrita del propietario,aunque no figure en el
catálogo.
6.-Organización de Cursos
7.-Investigación.
8.-Asesoramiento en general
 Normas generales para la conservación de
cepas microbianas
Los tres objetivos para una correcta conservación:

1.-Mantenimiento en Cultivo puro.(PUREZA)

2.-Que este viva.(VIABILIDAD)
3.-La cepa debe guardarse geneticamente estable(ESTABILIDAD)

Lapage en 1977 decía que:

a) Un cultivo inicial de una especie es una población

b) Un subcultivo es una población diferente derivada de este
cultivo inicial.
c) Una cepa es una suceción de subcultivos del cultivo inicial
¿los datos del cultivo inicial seran los mismos en la cepa?

NO necesariamente porque se producen cambios en los subcultivos

Los métodos en la conservación de las cepas microbianas tienen

Como objeto fundamental minimizar estos cambios
 La conservación de cepas
microbianas
• Método de elección o de conservación a largo plazo
– Conservación por congelación
– Conservación por liofilización

• Métodos Alternativos
– Conservación por transferencia periódica
– Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar
esteril
• Métodos Restringidos
– Desecación en papel de filtro
– Desecación en suelos,arena silicagel,etc
– Desecación en bolitas de alginato
– Desecación en sal gorda para halobacterias
 Conservación de microorganismos por
congelación

La crioconservación consiste en la conservación de los

microorganismos a temperaturas inferiores a cero grados centígrados.
Se basa en la paralización del metabolismo celular por la disminución
del agua disponible.

Objetivos de la crioconservación
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento
-El estado fisiológico de la célula
- Mantenimiento de la estabilidad
- Mantenimiento de la pureza
 Hielo
Hielo
Hielo
H2O
Hielo
BACTERIA
H2O
H2 O
H2O
Hielo Hielo

Hielo Hielo
 AGENTES
CRIOPROTECTORES
• OBJETIVOS • CARACTERISTICAS
– Minimizar daños – No tóxico para la
durante la congelació. célula.
– Limitar la formación – Penetrar facilmente en
de hielo (tasa de la menbrana celular.
congelación) – Unirse a los
– Vitrificación del agua electrolitos o a las
moléculas de agua.
 Crioprotectores más comunes
• Glicerol
• Dimetilfulfóxido (DMSO)
• Ácido glutámico
• Glucosa
• Sacarosa
• Meso inositol
• Lactosa
• Leche Descremada
 Conservación de microorganismos por
congelación

La crioconservación consiste en la conservación de los

microorganismos a temperaturas inferiores a 0 grados centígrados. Se
basa en la paralización del metabolismo celular por la disminución
del agua disponible.

Objetivos de la crioconservación
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento (-70º,-139º)
-El estado fisiológico de la célula (Final f.logarítmica)
- Mantenimiento de la estabilidad
- Mantenimiento de la pureza
 Conservación de microorganismos por
congelación

La crioconservación consiste en la conservación de los

microorganismos a temper.inferiores a cero grados centígrados. Se
basa en la paralización del metabolismo celular por la disminución
del agua disponible.

Objetivos de la crioconservación
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento
-El estado fisiológico de la célula
- Mantenimiento de la estabilidad (fenotípica y genotípica)
- Mantenimiento de la pureza (Hacer alícuotas)
 Conclusiones
• Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la fase
logarítmica, a la temperatura óptima, en el medio más adecuado.
• Ajustar el nº de células a una concentración final de 2-6x106
cél/ml. Añadir los crioprotectores adecuados a una
concentración óptima.
• Repartir la suspensión en ampollas de congelación,cerrarlas
hermeticamente y mantenerlas 30 minutos a 30º.
• Disminuir la tª lo mas rápido posible.
• A la hora de recuperar los microorganismos, descongelar
rápidamente, sumergiendo las ampollas con el cultivo congelado
en un baño a 37-40ºC.
 FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LA
CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
POR LIOFILIZACIÓN

• Liofilización
– Es un método de conservación a largo plazo.
– Se basa en la paralización del metabolismo
celular por falta de agua:congelación y
sublimación
 PROCESO

Congelar el
agua libre de Eliminación del agua
las células
Agua congelada Vapor de agua
Sublimación

1ª Fase de la 2ª Fase de la
Desecación Desecación
 PROCESO

P
R
O
T Congelación
E
C
T
Rápida
O
R
Tª ambiente,4ºC,-196ºC
Tubos marcados

BOMBA

BOMBA
condensador

Sellado al
vacio

Ampolla
 Tipos de Liofilizadores
• Liofilizador con
centrifugación
– Se utilizan ampollas de vidrio
taponadas
– La suspensión se centrifuga
durante la 1ª fase de la
desecación
– Se estrechan las ampollas
y,después de conectarlas a
una bomba de vacío,se sellan.
Ventajas:Se utiliza la centrifugación para que
el proceso de congelación sea suave y de
forma homogénea
• Liofilizador con estantes
– La suspensión se prepara en
viales y,es precongelada a
Tª muy bajas antes de
aplicar el vacío.
– La segunda etapa de la
desecación se realiza
también en el liofilizador.
Ventajas:La Desecación es
de manera progresiva y
continuada
 ¿Cuándo aplicar la Liofilización?
Es un método ampliamente utilizado para conservar distintos
Microorganismos.
SI NO
-Bacterias,Levaduras, -Dificultad de un crecimiento
Hongos,Algunos virus,Algas Adecuado.
-Microorganismos delicados
Ejemplos:Rhodospirillum, que no resisten el paso de
,Azospirillum,vibrio y demás congelación.
bacterias marinas. -A tamaños de células mayores,
-Levaduras miceladas con difi- menos efectivo es el proceso
cultad en la esporulación. Protozoos,Células animales,
-Hongos con grandes conidios o Células vegetales,Arqueobac-
con dificultad en la esporulación. terias y bacterias delicadas
 FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN
POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIÓN

Condiciones de Cultivo
El medio de cultivo
Dependerá del tipo de microorganismo y sus
requerimientos nutricionales.
Fase de crecimiento del cultivo.
F.exponencial. Suspenciones celulares de 108-109
Células/ml en bacterias, algo inferiores en
hongos y levaduras.
Condiciones de incubación.
Tª,aerobiosis, anaerobiosis, etc.
 FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN
POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIÓN

Preparación de las células para su conservación

- Composición del medio de la suspensión y adecuada densidad óptica
El medio de la suspensión deberá proteger la viabilidad de las células. Usar el
crioprotector adecuado en cada caso.
Glucosa 7,5% para Anaerobios
Glucosa 15% para Levaduras.
Glutámico 0,67M para Bacterias Lácticas.
Inositol 5% para Bacterias.
Leche descremada para Levaduras, Hongos y Actinomicetos.

- Tipos de ampollas,tubos y viales para la liofilización.

Dependerán del equipo del que se disponga o del tipo de muestra a liofilizar.
Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o borosilicato, porque por su elevada
resistencia ofrecerán muchas dificultad en su apertura.
 FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN
POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIÓN

-Temperatura durante la sublimación.

Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de –50ºC.

-Grado de deshidratación alcanzado.

Lo más alto posible.

-Atmósfera de oxígeno en el tubo.

Las células liofilizadas se guardan en tubos al vacío para evitar
Rehidratación o presencia de gases (como el oxígeno) que pueden
dañar las células.

-Condiciones de almacenamiento.
La temperatura debe ser constante a 18ºC y sin bajar de los 0ºC
y, en oscuridad
 LIOFILIZACIÓN
VENTAJAS DESVENTAJAS

-El alto coste inicial del

-Reducción de la variabilidad
del microorganismo.
-La preparación de forma
-Largo tiempo de
conservación.
-Aplicabilidad para la
producción y distribución
de los lotes
equipo.
incorrecta de los distintos
lotes puede desembocar en
un estancamiento de la
viabilidad y/o en pérdidas
en la estabilidad de los
caracteres de los
microorganismos
Conservación por transferencia
periódica
Es un método en el que los organismos
permanecen activos durante el proceso. Consiste
en la inoculación de microorganismos en un
medio de cultivo adecuado,la incubaión a una Tª
adecuada para obtener crecimiento y finalmente el
almacenamiento bajo unas condiciones adecuadas.
El proceso es repetido a intervalos que garanticen
la obtención de un cultivo fresco antes de la
pérdida del viejo.
 PARA UNA BUENA
RESIEMBRA PERIÓDICA
• Medio de cultivo.
• Temperatura, tiempo y condiciones de incubación.
• Intervalo entre dos resiembras
– Reducción de la temperatura de almacenamiento.
– Medios no enriquecidos,con limitación de nutrientes.
– Restricción de la accesibilidad de aire del cultivo.
 Conservación por suspensión en agua
destilada o en agua de mar esteril
Es un método alternativo muy usado y que da altos porcentajes
de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos
filamentosos como en levaduras y algunas bacterias. Consiste en
Suspender en agua esteril unas cuantas células del cultivo que se
quiere conservar. Para los hongos filamentosos que no esporulan,
se puede poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del
Hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se
hace en agua de mar diluida.
 La conservación de cepas
microbianas
• Métodos Restringidos
– Desecación en papel de filtro
– Desecación en suelos,arena silicagel,etc
– Desecación en bolitas de alginato
– Desecación en sal gorda para halobacterias
Métodos de desecación Papel de filtro
Paquete
cerrado

Paquetes
Papel semicerrado
15 minutos
Watman nº4 121ºC

Desecador
P
R
O
T
E
Papel con
C
T
cultivo 2-3 semanas
O
R 4ºC
Cultivo Suspensión Gotas de
celular cultivo
Cerrado de
Los paquetes
 Métodos de desecación Suelo

G
E
R
20 minutos Tierra esteril
121ºC 4ºC
M
Microorganismos
I en fase
N durmiente
P
R A
O 4-5días Agotamiento
T
E 25ºC C de
C
T I nutrientes
O
R Ó Almacenamiento
a 18ºC
Cultivo Suspensión de
N
esporulado esporas
Métodos de desecación Bolas de Alginato

Gotas Placa petri con

Papel secante

Alginato 3%
13 minutos
121ºC

CaCl2 0,03M Medio de Cultivo Gotas de alginato

esteril 0,75M Sacarosa con cultivo
48horas
Gotas de alginato
DESECACIÓN
con cultivo Corriente de aire estéril
30 minutos ó bomba de vacío a
Temperatura controlada
Cultivo Suspensión Polimerización del
en agua esteril
Alginato Pérdida del 30% del peso