UNIVERSIDAD DE CONCEPCION

Patogenicidad Bacteriana

Identification of a Mycobacterium tuberculosis

Gene That Enhances Mycobacterial Survival in
Macrophages.

Jun Wei, John L. Dahl, James W. Moulder, Esteban A. Roberts, Peadar O’Gaora, Douglas B. Young
and Richard L. Friedman. Journal of Bacteriology. 2000.

Juan Pablo Cuevas G.

 Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium es el único género de la familia de las bacterias Mycobacteriaceae. El

género Mycobacterium está formado por bacilos aerobios inmóviles y no esporulados 
algunos de los cuáles son patógenos que causan graves enfermedades en los mamíferos,
incluyendo tuberculosis y lepra.

Es una bacteria alcohol-ácido resistente, frecuentemente incolora, aeróbica estricta. Su

crecimiento está subordinado a presencia de oxígeno y al valor del pH circundante. Es muy
resistente a las condiciones de frío, congelación y desecación. Por el contrario, es muy
sensible a las de calor, luz solar y luz ultravioleta.

Es considerado un importante patógeno humano responsable de 3,1 millones de muertes en

el mundo al año (Bloom, 1994).
 Mecanismo
patogénicidad

Tanto la mycobacteria virulenta y avirulenta se internaliza en monocitos y

macrófagos, pero solo la mycobacteria patogénica sobrevive y replica
intracelularmente (Ramakrishnan & Falkow, 1994; McDonough, et al, 1993).

M. tuberculosis es resistente a la muerte por macrófagos y sobrevive a la

fagocitosis:

Resistencia a muerte por

Inhibción de la fusión fagosoma-
intermediarios reactivos de
lisosoma.
oxígeno y nitrógeno.
(Armstrong & Hart, 1975)
(Lowrie, 1983)

Modificación de la composición lipídica de la membrana

Inhibición en acidificación de celular de la mycobacteria alterando su capacidad de
fagosomas interaccionar con células inflamatorias e inmunes.
(Sturgill-Koszycki et al., 1994) (Ilangumaran et al., 1995)
Tasa estimada de nuevos casos de tuberculosis (TB)
por 100.000 habitantes a nivel mundial en 2014.

(WHO, 2015)
 Objetivo

Estudiar cómo las mycobacterias logran sobrevivir dentro de las células

fagocíticas, especialmente enfocado al modelo de M. tuberculosis.
Resultados
Selección de M. smegmatis transformado con el DNA de
M. tuberculosis H37Rv para mejorar la supervivencia en
células U-937.

Sólo un clon (p69) demostró un incremento en la supervivencia

intracelular trasncurridas 48 h.
Selección de M. smegmatis transformado con el DNA de
M. tuberculosis H37Rv para mejorar la supervivencia en
células U-937.

A las 3 h postinfección, numerosos bacilos de M. smegmatis estaban

Estos resultados confirman que M. smegmatis (p69) fue internalizado
presentes en el citoplasma de células U-937, ya sea bien ajustado
por células U-937 y está presente intracelularmente en el citoplasma
dentro del fagososma (2 A) o dentro de fagosomas más espaciados (2
dentro de éstas.
B)
Digestión por restricción y análisis de secuencias de p69.

Estos ORFs corresponden a los genes hipoteticos Rv2417c, Rv2416c y

Rv2415c, respectivamente, pertenecientes al genoma de M. tuberculosis.
Digestión por restricción y análisis de secuencias de p69.

Sólo uno de los tres ORFs

codificados en el inserto p69, el
ORF2, contiene la región
promotora putativa y un sitio de
unión a ribosoma
Digestión por restricción y análisis de secuencias de p69.

Estos resultados sugieren que ORF2 del p69 aparenta ser el gen que confiere
el aumento en el fenotipo de supervivencia intracelular en M. smegmatis.
 Subclonamiento y análisis de deleción de ORF2.

Estos resultados confirman que el gen ORF2 de M. tuberculosis es el responsable

Se realizó
de mejorarunelanálisis
fenotipo
de depleción
intracelulardeldeDNA
supervivencia
inserto en p69
asociado
para verificar
con p69 que en
ORF2M.
es escencial para
smegmatis. Por mejorar
lo tanto el fenotipo
ORF2 es de supervivencia
el gen que intracelular
mejora laobservado
supervivencia
en M.
smegmatis (p69).
intracelular (eis).
 Eficiencia en la selección de transformantes que contienen
a eis mediante células U-937.

Los resultados demostraron que en los ensayo de supervivencia intracelular

eficientemente
Plásmidos se enriquecían
de estos clones los
fuerontransformantes con fenotipos
aislados y caracterizados por de
supervivencia
digestiónmejorados
con BamHIy yque el gen
SmaI paraeis confiere una
determinar ventaja dedesupervivencia
el porcentaje identidad
real en M.p69.
con smegmatis que contienen a este gen.
Demostración de la presencia del gen eis sólo en M.
tuberculosis y M. bovis BCG.

Ninguna
Los DNAsdegenómicos
las especies de número
de un mycobacterias no patógenas,
de especies incluyendofueron
de mycobacterias a M.
smegmatis, hibridaron
examinados conBlot,
por Southern la sonda marcada
utilizando con DIG
una sonda para con
marcada detectar eis. Los
Digoxigenina
resultados
(DIG) demuestran
generada por PCR que eisfin está
con el presente
de detectar solamentedeen
la presencia eis.mycobacterias
patógenas y sus derivados producidos en laboratorio.
Identificación del producto génico putativo de eis.

La aparición de esta proteína de 42

kDa se correlaciona directamente
con un aumento en la
supervivencia intracelular de los
diferentes transformantes que
contienen al gen eis intacto.
 CONCLUSIONES
• En este estudio la línea celular tipo macrófago humana U-937 se utilizó para demostrar que un
clon de M. smegmatis avirulento trasformado con el DNA de la cepa virulenta de M.
tuberculosis H37Rv, muestra un incremento significativo en la supervivencia intracelular por al
menos 48 h.

• La evidencia indica que la supervivencia prolongada del clon p69 en células U-937 se debe a
la presencia del gen de M. tuberculosis designada como eis, y que la disrupción de este gen
implica la pérdida del fenotipo de supervivencia celular.

• La identificación de eis, utilizando a M. smegmatis y células U-937 sugieren la potencialidad

de este sistema para la identificación adicional de genes que contribuyen a la supervivencia de
mycobacterias virulentas dentro de los macrófagos.

• La expresión de la proteína Eis (42 kDa) se correlaciona con el incremento de supervivencia

de de M. smegmatis p69 en células U-937. Estos resultados sugieren el posible rol de eis y su
producto proteico en la supervivencia intracelular de M. tuberculosis.

• Estudios exploratorios sugieren que Eis expresado en M. smegmatis está localizado en su

superficie. Dicha locación sugiere la participación de la proteína Eis en las interacciones
producidas entre la superficie de la mycobacteria y la membrana de la célula hospedera.
 REFERENCIAS
• Bloom, B. R. (ed.) 1994. Tuberculosis: pathogenesis, protection, and control. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.

• McDonough, K. A., Y. Kress, and B. R. Broom. 1993. Pathogenesis of tuberculosis: interaction of

Mycobacterium tuberculosis with macrophages. Infect. Immun. 61:2763–2773.

• Ramakrishnan, L., and S. Falkow. 1994. Mycobacterium marinum persists in cultured mammalian
cells in a temperature-restricted fashion. Infect. Immun. 62:3222–3229.

• Armstrong, J. A., and P. D. Hart. 1975. Phagosome-lysosome interactions in cultured

macrophages infected with virulent tubercle bacilli. Reversal of the usual non-fusion pattern and
observation on bactericidal survival. J. Exp. Med. 142:1–16.

• Lowrie, D. B. 1983. How macrophages kill tubercle bacilli. J. Med. Microbiol. 16:1.

• Sturgill-Koszycki, S., P. H. Schlesinger, P. Chakraborty, P. L. Haddix, H. L. Collins, A. K. Fok, R. D.

Allen, S. L. Gluck, J. Heuser, and D. G. Russell. 1994. Lack of acidification in Mycobacterium
phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science 263:678–681.

• Ilangumaran, S., S. Arni, M. Poincelet, J. M. Theler, P. J. Brennan, Nasirud- Din, and D. C.

Hoessli. 1995. Integration of mycobacterial lipoarabinomannans into glycosyl-phosphatidylinositol-
rich domains of lymphomonocytic cell plasma membranes. J. Immunol. 155:1334–1342.
GRACIAS POR SU
ATENCIÓN
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Identification of a Mycobacterium tuberculosis

Gene That Enhances Mycobacterial Survival in
Macrophages.

Jun Wei, John L. Dahl, James W. Moulder, Esteban A. Roberts, Peadar O’Gaora, Douglas B. Young
and Richard L. Friedman. Journal of Bacteriology. 2000.

Juan Pablo Cuevas G.