Está en la página 1de 53

Deriva del griego MIKRO (pequeo) y del ingls ARRAY (distribucin ordenada).

Recibe varios nombres : micromatrices, microarreglos, biochips.

Consiste en un gran numero de molculas de ADN ordenadas sobre un sustrato slido de manera que formen una matriz de secuencias.

Estos fragmentos de material gentico pueden ser secuencias cortas llamadas oligonucletidos , ADN complementario o bien productos de PCR .

Los fragmentos de DNA de una sola hebra inmovilizados en el soporte se denominan SONDAS.

Los acidos nucleicos de las muestras a analizar se marcan por diversos met. y se incuban sobre el panel de sondas permitiendo la HIBRIDACION de secuencias homologas.

Durante la hibridacin , las muestra de material gentico marcadas se unirn a sus complementarias inmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo la identificacin y cuantificacin presente en la muestra.

Scaner y herramientas informticas para interpretar datos obtenidos.

Podemos determinar qu genes estn expresados o activados en una clula midiendo la cantidad de mRNA correspondiente a ese gen que hay en ella. El mRNA libre es muy inestable, por lo que para poder manipularlo la biotecnologa ha diseado herramientas para pasarlo a DNA y esos DNA que provienen de retro trascripcin in vitro de mRNA se llaman cDNA.

Deteccin del gen (gen presente/ausente) Seal de intensidad (medida de la expresin del gen)

Cuantitativo Se analizan muchos ms genes.

Cualitativo Aporta conocimiento molecular acerca de un proceso patolgico y un estado normal.

Fig 1. Tomada de Ana Dopazo. MICRO Y NANOTECNOLOGA EN MEDICINA: LOS CHIPS O MICROARRAYS DE ADN

Permiten el depsito de miles de puntos conteniendo genes o parte de genes sobre un portaobjetos para su estudio en paralelo. De esta manera es posible tener una visin instantnea de actividad de genomas completos o de un grupo selecto de genes.

Se combinan las tcnicas de hibridizacin de cidos nucleicos y deteccin por fluorescencia. De esta manera, slo en los puntos del portaobjeto donde haya ocurrido hibridizacin habr fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia detectada ser proporcional al nivel de expresin del gen en estudio.

MUESTRAS BIOLGICAS El xito de un ensayo de microarrays depende en gran parte de la calidad de la muestra obtenida. El RNA total debe estar intacto y puro, no debe contener protenas ni DNA contaminante.

Para ello se exige que sea evaluada su cantidad y calidad por espectrofotometra y su integridad por electroforesis (deben observarse las bandas de rRNA 28S y 18S en proporcin y peso molecular adecuado).
Se ha planteado el uso de mRNA universales o de especies diferentes que funcionen como controles internos del ensayo. Estos controles se procesan en conjunto con la muestra y contienen en el microarray sondas especficas que monitorean la calidad del ensayo.

El RNA total es obtenido de la muestra biolgica y marcado con un colorante fluorescente para su posterior deteccin. Las primeras propuestas fueron marcar con dos colorantes derivados de cianinas (Cy5 rojo y Cy3 verde) las muestras de RNA total durante el proceso de transcripcin reversa o modificar qumicamente los nucletidos a posteriori. La lectura se hace con detectores que permitan detectar los espectros de emisin de los dos colorantes en canales diferentes y generar imgenes separadas para cada uno de ellos.

Existen diversos tipos de microarrays segn las sondas utilizadas . Los tipos ms comunes son: Microarrays de cidos nucleicos Microarrays de oligonucletidos Microarrays de protenas Microarrays de tejidos (TMA)

Microarrays de cDNA
Las sondas son producidas en laboratorios mediante la amplificacin selectiva de cDNAs (100-3000 nucletidos) por PCR en placas de 96 pocillos. Estos amplicones se purifican, se verifica su calidad y cantidad y se depositan por capilaridad en portaobjetos de vidrio mediante costosos robots que requieren un ambiente libre de partculas.

Las sondas son porciones de DNA sinttico de cadena simple que pueden ser cortas (15-25 nucletidos) o largas (50-120 nucletidos). Estos fragmentos pueden ser presintetizados y depositados en portaobjetos por robots o sintetizados in situ y depositados por ink jet o fotolitografa (DNAchips).

Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son muestras de suero o tejido. Tcnica restringida por : La dificultad de fabricar e inmovilizar estructuras 3-D como son las protenas y detectar interacciones de protenas plegadas. No se dispone an de colorantes fluorescentes que permitan cuantificar eficientemente a estas molculas.

Cuadro No.1.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Acido ncleico procedente de la muestra, cuya secuencia genmica se pretende DETECTAR.

ACIDO NUCLEICO DIANA

Fragmentos de cidos nucleicos marcados cuya secuencia es complementaria a la del ADN diana.

SONDAS DE HIBRIDACION

Las sondas tienen tres formas fsicas diferentes: Clones de cDNA Productos de PCR Oligononcleotidos

Las sondas basadas en clones se depositan en la superficie del array en formas de fragmentos o genes completos generalmente procedentes de libreras gnicas. Tamao: cientos de pb a kb.

Los productos de PCR consiste en fracciones de genes generadas por PCR procedentes de Cdna, librerias genomicas o RNA. Tamao: 200 a 500 pb aprox.

Las sondas consistentes de oligonucleotidos tienen un tamao de 20 a 25 pb hasta 100 pb.

La deteccin de la hibridacin entre sondas de ADN inmovilizadas en el soporte y los fragmentos del material gentico de la muestra , requiere un marcaje previo para su posterior deteccin.

Marcaje Directo

Marcaje Indirecto

Cuadro No.2.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Cuadro No.3.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Para marcaje de sondas y dianas en microarrys el mtodo mas utilizado es el qumico o enzimtico utilizndose comnmente los fluoroforos cianininas , Cy5 rojo y Cy3 verde

Fig 1. Tomada de Paola Roxana Barrero . Aplicaciones de la tcnica de microarrays en ciencias biomdicas: presente y futuro.

Ventaja: Ofrece mayor superficie de union que los soportes lisos.


Cuadro No.4.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Cuadro No.5.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Cuadro No.6.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Cuadro No.6.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Se han desarrollado multiples tecnicas de inmovilizacion de sondas sobre las superficies de los mycroarrays , los cuales dependen de la aplicacin final del microarray y del tipo de soporte utilizado.

Los mtodos utilizados en la inmovilizacin de sondas sobre la superficie solida de mycroarrays, se basan en la unin covalente de las mismas al sustrato por medio de procedimientos quimicos.

La preparacion de los soportes de cristal o silicio implica generalmente un tratamiento previo con grupos reactivos aldehido o amino, de manera que formen una capa de uniforme de grupos reactivos quimicamente estables, hidrofilicos, para evitar uniones no especificas de las sondas con el soporte.

Generalmente , para conseguir la inmovilizacion especifica de las sondas se requiere una modificacin previa del oligonucleotido o Cdna por medio de la activacin mediante grupos amino, tiol y biotina, para esto se cubre la superficie del soporte con Estreptavidina

Cuadro No.7.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Existen dos tcnicas para inmovilizar los fragmentos de ADN en el soporte del array:

Sintetizar los oligonucleotidos en el propio soporte , mediante ciclos sucesivos.

Depositar mediante un brazo robotizado el fragmento presintetizado que corresponda.

Cuadro No.8.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Parmetros : Densidad y diseo del chip Composicin bioqumica Versatilidad Reproducibilidad Eficacia Calidad Coste Facilidad de automatizacin

Cuadro No.9.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Cuadro No.10.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Cuadro No.11.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Cuadro No.12.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Cuadro No.13.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Cuadro No.14.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

Entre los componentes de un microarrays estn los robots controlados por ordenadores , estaciones de lavado y secado. Los robots estn diseados para recolectar automticamente las muestras localizadas en placas multipocillo mediante agujas simultneamente.

Puede medirse en cada posicin de DNA la intensidad de la fluorescencia para cada uno de los fluorforos; en cada caso, el nivel de seal detectado en una posicin determinada es proporcional al nmero de copias de mRNA de ese gen que hay en la muestra problema ; el cociente de la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) es una medida de la expresin gnica comparada relativa al gen representado en esa posicin del chip

Bioconductor: Conjunto programas aplicaciones que trabaja lenguaje R precisa conocimiento bsico programacin S-Plus. de y gratuito con el y que de de en R

SAM & PAM: Programas gratuitos para Microsoft Excel R. El SAM descubre genes significativos, controlando la tasa de falsos positivos, y el PAM los clasifica mediante Mtodos centrides

BRB ArrayTools: Este software est diseado para Microsoft Excel y se utiliza para la visualizacin y el anlisis estadstico de datos de microarrays. Realiza comparacin y prediccin de clases y tests de permutaciones para los niveles de Significacin.

Est diseado especficamente para extraer informacin de microarrays y tiene muchos tipos de grficos

TM4
En apoyo a nuestro trabajo en curso de anlisis de microarrays de expresin gnica, hemos desarrollado una suite de software que permiten a los usuarios en el laboratorio para capturar, gestionar y analizar de forma eficaz los datos de experimentos de microarrays de ADN.

TAD: Base de datos del arsenal del tejido

TAD consiste en un interfaz activo del Web de la paginacin del servidor a una base de datos emparentada del SQL que automatice cuentas de la grabacin y la conexin de ellas a los datos clnicos para la interpretacin futura. Para darle una mejor idea de cmo TAD trabaja, hemos preparado una presentacin del PowerPoint que contena una serie de tiros de pantalla del programa en la accin.

1. Marcar la muestra del tejido a estudiar con un tinte fluorescente. 2. Aislar el mRNA de las clulas de inters y proceder a copiarlo mediante una sntesis in vitro para pasarlo a cDNA. 3. Desnaturalizar ese cDNA para obtener hebras simples. 4. Poner el cDNA troceado sobre el microarray donde las hebras simples de cDNA son atradas por las hebras simples de oligonucletidos del microarray unindose a ellas para volver a conformar la estructura de doble-hlice similar a la del DNA (proceso conocido como hibridacin). 5. Lavar el microarray para quitar las hebras simples de la muestra que no han hibridado. 6. Escanear el microarray con un lser para cuantificar la fluorescencia de cada gen.

La actividad de un gen est representada por el nmero de copias de mRNA de ese gen en una muestra de clulas. Un alto (bajo) nivel de fluorescencia indica que muchas (pocas) copias del mRNA de ese gen han hibridado en el chip y que, por tanto, el gen tiene mucha (poca) actividad en la clula.

Los microarrays de DNA nos permiten analizar el mRNA de las muestras estudiadas mediante ensayos de hibridacin: cada una de las especies de mRNA de las muestras problema , una vez extraidas y marcadas, son capaces de formar una doble cadena o aparearse con aquellas molculas de DNA inmovilizadas en la superficie del chip que tengan una secuencia complementaria a la suya, de acuerdo con las propiedades de complementariedad de bases de la estructura de los cido nucleicos.

La identificacin de nuevos genes marcadores. En el caso particular de nuevos genes marcadores de cncer, mediante el rastreo masivo de todos los genes que componen el genoma humano, analizando aquellos que muestren una expresin gnica diferente entre clulas normales y tumorales. Determinados tumores pueden actualmente diagnosticarse en una fase temprana de la enfermedad gracias a mtodos sencillos y no invasivos como es la deteccin en el suero sanguneo de marcadores de cncer especficos (por ej. el PSA, antgeno especfico de prstata, para el cncer de prstata).

El descubrimiento de nuevas herramientas diagnsticas y de clasificacin de tumores. Hasta ahora, los tumores se han venido clasificando siguiendo criterios histlogicos; esta categorizacin, aunque de gran valor, ha mostrado ser insuficiente: tumores que bajo el microscopio presentan el mismo aspecto engloban procesos neoplsicos con distintas manifestaciones clnicas y de respuesta a frmacos.

Cuadro No.14.Tomado de Microarrays y Biochipsde ADN.I nforme de vigilancia tecnologica.Genoma Espaa.Salud Humana.

1. Rivas-Lpez, M.J., Snchez-Santos, J.M. y De las Rivas, J. ESTRUCTURA Y ANLISIS DE MICROARRAYS. 2. MICROARRAYS Y BIOCHIPSDE ADN.I nforme de vigilancia tecnologica. Genoma Espaa. Salud Humana. 3. Ana Dopazo Gonzlez. MIICRO Y NANOTECNOLOGA EN MEDICINA: LOS CHIPS O MICROARRAYS DE ADN. Responsable de la Unidad de Anlisis Genmico . Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas 4. Aplicaciones de la tcnica de microarrays en ciencias biomdicas: presente y Futuro. Paola Roxana Barrero