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CONTENIDOS

1. Fundamentos

2. Clasificación

3. El proceso cromatográfico

4. Parámetros fundamentales

5. Aplicaciones de la cromatografía

2
1. Fundamentos 1903: usó columnas de adsorción para separar
pigmentos vegetales

Fase

móvil
Pigmentos

vegetales

Fig.1
Fase
Tswett (1872-1919)
estacionaria

Chroma: color
CROMATOGRAFÍA
Graphein: escribir

3
2. Clasificación

• 2A. Según la disposición de la fase estacionaria:

– Cromatografía plana:
• Cromatografía en capa fina
• Cromatografía en papel

– Cromatografía en columna
• Cromatografía de líquidos
• Cromatografía de gases
• Cromatografía de fluidos supercríticos

4
2. Clasificación
CROMATOGRAFÍA PLANA

Papel Cromatografía en papel

Fase estacionaria

Adsorbente sobre soporte Cromatografía

Gel de sílice, poliamida…. en capa fina

Lámina de vidrio, de plástico o
Tapadera
metálica

METODOLOGÍA DE TRABAJO
Papel
Frente de
fase móvil

Fase
móvil

1 5 Fig.1
2 3 4

5
2. Clasificación
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Muestra
Fase (A+B)
móvil

B
Fase
estacionaria
B
A

A B

6
2. Clasificación

• 2B. Según el tipo de fase móvil:

• Cromatografía de líquidos (LC)

En columna o en superficie plana
• Cromatografía de gases (GC)

• Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)

En columna

7
2. Clasificación

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA

Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio

LC Reparto Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre líquidos
inmiscibles
Adsorción Sólido Adsorción

Intercambio iónico Resina de Intercambio Iónico Intercambio iónico

Exclusión por Líquido en intersticios de un sólido Distribución/Exclusión

tamaños polimérico

GC Gas-líquido Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre gas y líquido

Gas-sólido Sólido Adsorción

SFC Especies orgánicas enlazadas a Distribución entre fluido

superficie sólida supercrítico y superficie
enlazada

8
3. El proceso cromatográfico

Muestra
(A+B)
Fase
móvil

B
Fase
estacionaria A B

B
A
B

Detector ● ● ● ● ● ●
●
Señal analítica

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6

A
B

Tiempo, min t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6
9
4. Parámetros fundamentales

Resolución Resolución
= 0,5 = 0,75

Señal
Señal

Resolución
=1 Resolución
= 1,5
Señal
Señal

Tiempo Tiempo

F1
10
5. Aplicaciones de la cromatografía
ANÁLISIS CUALITATIVO

Disolución estándar
Señal analítica

F1

CH4 Nonano
La muestra no contiene
Octano Decano
metano ni octano.
Tiempo Si los contiene será a
concentraciones inferiores
Muestra a los correspondientes
límites de detección
Señal analítica

CH4 Octano ¿Nonano? ¿Decano?

Tiempo

Identificación positiva: - Comparación de datos de retención

- Uso de detectores en línea 11
5. Aplicaciones de la cromatografía
ANÁLISIS CUANTITATIVO

Área

Señal analítica
Altura, h

Fig.1
tm tr Tiempo

MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO

1. Calibración con patrones
0,4
Preparación de disoluciones patrón
0,3

Obtención de sus cromatogramas 0,2

Área de pico, s

0,1

0,0
0 5 10 15 20 25 30
12
Concentración, ng ml-1
5. Aplicaciones de la cromatografía

0,35
B. Método del estándar interno
0,30

0,25

Se añade a disoluciones 0,20

patrón y a muestras 0,15

0,10

Analito 1 0,05
Señal analítica

0,00

Area de pico/Area del estándar interno

Estándar 0 10 20 30 40 50 60

interno Concentración, ng ml-1

Analito 2

Tiempo
Fig.1

13
 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA TLC

CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)

• proteínas
Separación de biomoléculas…
• péptidos
• aminoácidos
• lípidos
• ADN/ARN …

… en función de su diferente distribución en dos

análisis y
FASES (¡siempre!)
purificación

Botánico

Ruso Mikhail
F. MÓVIL:líquido (solvente)
A
Tswett
gas
B ( 1906)

FASE FASE ESTACIONARIA F. ESTACIONARIA: sólida

MÓVIL

líquida
• Separación de los componentes de una muestra.

• Los componentes de una mezcla son distribuidos

entre dos fases: una es estacionaria y una móvil.

• La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido

soportado en un sólido o en un gel (matriz).

• La fase estacionaria puede ser empaquetada en una

columna, extendida en una capa, distribuida como
una película, etc...
• La fase móvil , que contiene la mezcla a separar,
puede ser un líquido o un gas.
• La separación entre dos sustancias comienza
cuando una es retenida más fuertemente por la
fase estacionaria que la otra, que tiende a
desplazarse más rápidamente en la fase móvil.

• Las retenciones pueden tener su origen en dos

fenómenos de interacción que se dan entre las
dos fases:

• Adsorción: que es la retención de una especie

química por parte de los puntos activos de la
superficie de un sólido quedando delimitado el
fenómeno a la superficie que separa las fases o
superficie interfacial.

• Absorción: que es la retención de una especie

química por parte de una masa y debido a la
tendencia que esta tiene a formar mezcla o a
reaccionar químicamente con la misma.
 CLASIFICACIÓN

3 CRITERIOS

1- Según el estado físico de la fase móvil:

FASE MÓVIL líquido  Cromatografía de LÍQUIDOS

gas  Cromatografía de GASES

2- Según la causa por la que se separan los componentes de la muestra (relacionado con las

propiedades físicas de las biomoléculas):

• Solubilidad • Hidrofobicidad
• Tamaño • Interacciones por afinidad biológica
• Carga • Interacciones inespecíficas

3- Según la metodología utilizada para el desarrollo de la cromatografía

(relacionado con la fase estacionaria):

FASE ESTACIONARIA  Sobre superficie plana: planar

 En columna
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

Fase Fase Tipo

móvil estac. Clase (propiedad) Nombre Ejemplo

Líquida Líquida Reparto Solubilidad Fase normal EN PAPEL

Fase inversa

Tamaño Exclusión GEL FILTRACIÓN

Interacciones Intercambio INTERCAMBIO

Sólida Adsorción
electrostáticas iónico IÓNICO

(¡NO
Hidrofobicidad Interacción EN CAPA FINA o TLC
absorción!)
Hidrofóbica

HIDROFÓBICA

Interacciones Afinidad AFINIDAD (GST)

por afinidad

Interacciones Adsorción
HIDROXIAPATITO
inespecíficas
 CROMATOGRAFÍA EN SUPERFICIE PLANA
CÁMARA
F. ESTACIONARIA
CROMATOGRÁFICA
(polar)

FLUJO

propiciado por
MUESTRA
CAPILARIDAD

FASE MÓVIL

FRENTE de avance del solvente (apolar)

distancia avanzada por la molécula

hidrofóbica Rf=

distancia avanzada por el frente

Rf es característico para cada soluto para una

hidrofílica composición dada de fase móvil y un determinado tipo

de superficie
 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

PROPIEDAD: Solubilidad

SOPORTE  celulosa del papel

F. ESTACIONARIA  (LÍQUIDA) H2O absorbida en la celulosa.

F. MÓVIL  (LÍQUIDA) Disolvente orgánico

H2O H2O

H2O H2O
H-
H2O H2O
H-
H2O H- H2O

H2

H2OO H2O

Molec. Hidrofílica  LENTA Molec. Hidrofóbica  RÁPIDA

Retenida por f.estacionaria Disuelta en f. móvil

 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)

PROPIEDAD: Hidrofobicidad

SOPORTE  plancha de metal o vidrio

F. ESTACIONARIA  (SÓLIDA) sólido pulverizado sobre plancha de metal o

vidrio. El más usado es el gel de sílica.

F. MÓVIL  (LÍQUIDA) Disolvente orgánico

Molec. Hidrofóbica  RÁPIDA

Molec. Hidrofílica  LENTA
Disuelta en f. móvil
Retenida por f. estacionaria
• Adsorbente: cuanto más finamente dividido esté
mayor será su adhesión al soporte.

• Adsorbentes más utilizados son:

• Celulosa
• Almidón
• Azucares
• Gel de sílice (silicagel)
• Óxido de aluminio (alúmina)
• Carbón activo (carbón en polvo)
• Gel de sílice o silicagel es uno de los más utilizados.

• pH entre 4-5
• tamaño del grano de 10 a 40 µ
• tamaño de poro de 20 a 150 Å

• Agente aglomerante: yeso (sulfato de cálcico) proporciona

firmeza al adsorbente

• Adsorbente polar

• Puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos

-OH de forma que se haga apto para separar componentes
lipofílicos (esteroides, ácidos grasos, ceras, vitaminas
liposolubles). Proceso llamado cromatografía de fase reversa
• La alúmina u óxido de aluminio

• Adsorbente ligeramente básico debido a la presencia de moléculas

de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina.

• Puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas ácidas,

básicas y neutras.

• Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas.

• adsorbente de carácter polar, retendrá con mayor avidez a los

componentes polares.

• El adsorbente se prepara en agua destilada. Proporción : dos

partes de agua y una de adsorbente. Ver fabricante

• Soporte del adsorbente láminas de vidrio

• El espesor de la placa en general suele ser de:

• 0.1-0.2 mm. para separaciones analíticas

• 0.5- 2 mm. para separaciones preparativas

• La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades

• Se dejan reposar

• Activar el adsorbente: dejar las placas reposar toda la noche a

temperatura ambiente o calentar 30 minutos a 105-110 ºC
• Aplicación de la muestra

• Los compuestos a separar se disolverán en un solvente

orgánico con punto de ebullición lo suficientemente bajo para
que se evapore después de la aplicación.

• mezcla cloroformo: metanol (1:1).

• disoluciones al 1% de las muestras, aplicar 2 µl,carga 20 µg de

producto sólido.

• Siembra: micropipetas y tubos capilares.

• Se realiza tocando con la punta del capilar sobre el papel

cromatográfico dejando una distancia al borde inferior y entre
muestras de un centímetro aproximadamente.

• Se deja secar para evaporar el disolvente, solo quedará la

muestra a analizar
• La elección del eluyente o fase móvil dependerá lógicamente del
componente que se va a separar y del material en que la
separación se lleva a cabo.

• Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

• Eter de petróleo
Eter dietílico
Ciclohexano
Acetato de etilo
Tetracloruro de carbono
Piridina
Benceno
Etanol
Cloroformo
Metanol
Diclorometano
Agua
Ácido acético
Desarrollo de la cromatografía

• Ascendente: el eluyente asciende en forma vertical, por la acción

de la capilaridad

• La cromatografía se realiza en una cuba. El eluyente se introduce

en la cámara una hora antes del desarrollo, para permitir la
saturación de la atmósfera.

• El tiempo de desarrollo suele ser corto en analítica, en una

cromatografía preparativa puede llevar horas.

• La cromatografía puede desarrollarse durante un tiempo prefijado

o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija
desde el origen para estandarizar los valores de RF.

• El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde

• Se deja secar el papel por acción del aire

• Localización de sustancias o revelado

• Si los compuestos separados no son coloreados es necesario

revelar la posición de dichos compuestos:

• Métodos químicos
• Métodos físicos

• Métodos químicos

• Reacción química entre un reactivo revelador y los

componentes separados.

• Se pulveriza con los reactivos reveladores en posición

horizontal y bajo campana.

• Por bañado del papel sumergiéndolo en un recipiente

adecuado con el revelador.
• Reveladores generales

• Reactivo yodo: forma complejos coloreados con los

componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón). Las
manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente
señalar las manchas aparecidas: reversible y no destructivo.

• Acido sulfúrico: reacciona con los componentes orgánicos

produciendo manchas negras: Irreversible y destructivo

• Reveladores específicos

• 2,4 – dinitrofenilhidracina: para aldehidos y cetonas

• Verde de bromocresol: para ácidos carboxílicos
• Paradimetil aminobenzaldehido: para aminas
• Ninhidrina: para aminoácidos
• Métodos físicos

• Al colocar el cromatograma bajo una lámpara ultravioleta, y

dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen
manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes.
• Constantes Rf

• RF (Ratio of Front) es una manera de expresar la posición de un

compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la
retención de un componente.
• Se define como:

• La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente

desde el centro de la mancha.

• RF reproducibles: deben fijarse tipo de papel, fase móvil, fase

estacionaria, cantidad de muestra.

• máximo valor de RF: es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.

 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

EMPAQUETADO APLICACIÓN
ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES
COLUMNA MUESTRA

RESERVORIO
LECHO
f. móvil
CROMATOGRÁFICO

f. estacionaria

COLUMNA MUESTRA

FLUJO

gravedad

DIFUSIÓN

llave

SEPARACIÓN
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

PERFIL DE ELUCIÓN

FRACCIONES Moléc. distribuida en f.móvil

Moléc. distribuida en

f.estacionaria

respuesta del detector

ANÁLISIS DEL
1 2 3 4 5 6 7 8 9
CONTENIDO DE LAS

FRACCIONES

Espectrofotométrico
Cromatograma: gráfica de alguna

función de la concentración de un
Abs 280nm – Proteínas
soluto frente al tiempo de elución o el
Otras Abs - Colorantes 1 2 3 4 5 6 7 8 9
volumen de elución
fracción
Tiempo de

retención

Longitud de la

columna

Resolución de la

columna
 CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN

SOPORTE  Resina de micropartículas esféricas formadas por

polímeros hidrofílicos: dextrano, agarosa, poliacrilamida o mezcla de

ellos

Tamaños de poro  intervalo o rango de fraccionamiento.

FASE MÓVIL

Sephadex G25: 1000 – 5000 Da

Sephadex G200: 5000 – 250000 Da

F. ESTACIONARIA  LÍQUIDA solvente acuoso (el mismo que el de MICROPARTÍCULAS

F. ESTACIONARIA

la fase móvil) que se encuentra dentro de micropartículas.

F. MÓVIL  LÍQUIDA solvente acuoso que atraviesa la columna por

los espacios intersticiales (entre las micropartículas).

 CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN

Molec. GRANDES  RÁPIDAS

Avanzan con mayor velocidad a través de los

espacios intersticiales: afinidad con fase móvil

Molec. PEQUEÑAS  LENTAS

Son retenidas por las fibras de las micropartículas y

APLICACIÓN
avanzan con menos velocidad: afinidad con fase
MUESTRA

estacionaria
PERFIL DE ELUCIÓN

grande
pequeña

respuesta del detector

ELUCIÓN

1 2 3 4 5 6 7 8 9
fracción
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

PROPIEDAD: Interacciones electrostáticas (carga)

SOPORTE  Resina de micropartículas formadas por polímeros sintéticos o

naturales (dextranos, celulosas, agarosa).

F. ESTACIONARIA  SÓLIDA Grupos con cargas iónicas unidos al soporte FASE MÓVIL

Carga positiva (+)  intercambiadores de aniones (-):

cromatografía intercambio aniónica

Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+):

cromatografía intercambio catiónica

F. ESTACIONARIA

F. MOVIL  LÍQUIDA Solvente que anula la interacción electrostática.

MICROPARTÍCULAS
2 posibilidades: Gradientes de pH  cambio de carga

de las moléculas de la muestra

Gradientes iónicos (salinos)  competencia

por grupos electrófilos

 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
•Gradiente de pH
Molec. CARGA (-)  NO SE RETIENEN
•Gradiente salino

Molec. MENOR CARGA (+)  RÁPIDAS

Son desplazadas más fácilmente por la fase móvil

Molec. MAYOR CARGA (+)  LENTAS

Son retenidas por los grupos cargados iónicamente de la fase

estacionaria

PERFIL DE ELUCIÓN
APLICACIÓN
q+
MUESTRA
Q+
respuesta del detector
+

+
Na
ELUCIÓN

1 2 3 4 5 6 7 8 9
fracción
Las proteínas

presentan carga a

distintos pH debido a

sus pI
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

PROPIEDAD: Interacciones específicas entre dos moléculas

hormona-receptor

proteína-metal o cofactores como ATP

antígeno-anticuerpo

SOPORTE  Matriz de micropartículas hidrofílicas sin carga, con rigidez, inerte y

FASE MÓVIL
estable (agarosa, acrílica).

F. ESTACIONARIA  SÓLIDA Ligandos (grupos químicos) específicos

unidos a la matriz

-- Comerciales: Concavalina A  une glicoproteínas

Proteína A  une IgG (anticuerpos)

-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz F. ESTACIONARIA

MICROPARTÍCUL
F. MÓVIL  LÍQUIDA Solución que anula o disminuye la afinidad con el ligando de la
AS
fase estacionaria.

-- Solución con el propio ligando  Molécula + ligando libre

-- Solución con algo que interacciona con el ligando  Molécula

 CROMATOGRAFÍA

DE AFINIDAD

Molec. NO INTERACCIÓN  RÁPIDAS

No se unen al ligando de la fase estacionaria

Molec. INTERACCIÓN  LENTAS

Se unen al ligando de la fase estacionaria

Elución específica.

PERFIL DE ELUCIÓN

ELUCIÓN
LAVADO
ESPECÍFICA
molécula

respuesta del detector

APLICACIÓN

MUESTRA

LAVADO

ELUCIÓN
1 2 3 4 5 6 7 8 9
ESPECÍFICA fracción
Cromatografía Líquida de Alta
Resolución.
• La muestra debe ser soluble en solventes orgánicos o acuosos,
sin importar el peso molecular.
• La fase móvil no debe disolver ni alterar químicamente la fase
estacionaria .
• Si se utilizan más de dos solventes deben ser totalmente
miscibles entre sí.
• Adsorción: compuestos lipofílicos, de polaridad baja o
intermedia, a veces, isómeros.
• Partición ( polar o apolar): isómeros, oligómeros y mezclas
complejas.
• Intercambio iónico
• Exclusión molecular
 HPLC Cromato
grafía
Convencional
Formatos de
columnas
•Diámetro
Alta eficiencia.
4-10 mm 1-10cm
•Largo
Alta resolución
3-30 cm cromatográfica.
5-150 cm HPLC utiliza bombas

Fases estacionarias de alta presión.

Diámetro de 3-10 µm 50-150 µm Disminuye el tiempo

partículas de retención y

aumenta la
N 2000-15000 Menor a 2000
resolución.
H 20 µm 1mm
Condiciones de
operación
Presión 30-400 atm Menor 2,5 atm
F 0,3-1,5 ml/min 0,1-20 ml/min
Volumén de 5-500 µm 0,5-100 ml
muestra
Cromatogramas Suelen expresarse Suelen expresarse
 SEPARACIÓN OPTIMA
• COMPLETA: Separación de todos los
componentes.

• DE CALIDAD: Separación de cada uno de

los componentes.

• EFICIENTE: Equilibrio entre tiempo y

costos.
 CROMATOGRAFÍA GASEOSA

SOPORTE  Columna (metal, vidrio o teflon) empacadas o rellenas ( tierra

de diatomea calcinado)

Tubular abierta (10- 100 m de longitud).

Ideal para mezcla de compuestos con volatilidades

muy diferentes.

Adsorción
F. ESTACIONARIA Un sólido poroso partícula do.

Una película líquida ( cubre el sólido particulado).

Absorción
Una película líquida delgada depositada sobre la pared

interna de la columna. .

Baja volatilidad, químicamente inerte, estabilidad térmica.

Cierta solubilidad con la muestra

F. MÓVIL  gas, llamado gas portador o carrier (nitrogeno,

Helio o Hidrogeno).
Cromatografía Gaseosa
 Aplicaciones
• Determinación de ácidos grasos.
• Determinación de terpenos.
• Determinación de hidrocarburos derivados
del petróleo.
MUCHAS GRACIAS
Y EXCELENTE DÍA
 CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS

-Logo encabezado de páginas OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Dirección web: http://ocw.um.es
-Página 3, Fig.1. Dirección web: http://es.wikipedia.org/wiki/Mija%C3%ADl_Tsvet .
-Página 5, Fig.1. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chromatography_tank.png.
-Página 10, Fig.1 y Fig.2. Dirección web: http://bcs.whfreeman.com/qca/default.asp.
-Páginas 11, 13, 15 y 17, Fig.1. Dirección web: http://bcs.whfreeman.com/qca/default.asp.
-Página 18, Fig.1. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chromatogram_1.jpg. Autor: CCC/CHT
Original uploader was Sortjai at nl.wikipedia.
-Página 19, Fig.1. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chromatogram.png. Autor: User Dubaj on
sk.wikipedia

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