Biotecnología Vegetal

‡ Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos y micropropagación y mejoramiento de plantas y producción de compuestos de interés comercial producción de metabolitos secundarios producción de proteínas producción de polímeros biodegradables y establecimiento de plantas transgénicas plantas resistentes a virus plantas con rutas metabólicas modificadas plantas mejoradas en cuanto a composición de proteínas, aceites, etc. y fitorremediación remoción de xenobióticos remoción de metales pesados

Sumario

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales Micropropagación vegetal Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis Sistemas de micropropagación vegetal Alcances de la propagación clonal masiva de plantas Referencias

Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos vegetales

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales

Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos vegetales

Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro

‡ Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciación / Rediferenciación

Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos vegetales

- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales

‡ La teoría de la totipotencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc. ‡ La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la rediferenciación de las células previamente desdiferenciadas. ‡ Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.

Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos vegetales

Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales ‡ Micropropagación vegetal ‡ Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis) ‡ Cultivo de meristemos ‡ Cultivo de suspensiones de células vegetales ‡ Cultivo de protoplastos ‡ Cultivo de anteras ‡ Cultivo de óvulos y embriones Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

Micropropagación vegetal Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

o propagación clonal masiva de plantas superiores.La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales ‡ La micropropagación vegetal. luz y fotoperíodo. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . ‡ Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperatura. posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala.

Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

. .).Cámara de cultivo. .Temperatura.La micropropagación vegetal requiere disponer de una infraestructura mínima especializada y de condiciones controladas de cultivo ‡ Laboratorio . . .Luz y fotoperíodo. etc. esterilización. .Area de preparación de medios.Explantes (elección. .Recipientes.Area de rusticación.Cuarto estéril.Asepsia. . ‡ Condiciones de cultivo Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . ‡ Material vegetal . .Area de lavado y esterilización. disección.Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento).

15 a 20 minutos en autoclave .8 Esterilización 1 atmósfera. ICarbohidratos Sacarosa. Mn2+. Co2+.Medios de cultivo: composición general Compuestos inorgánicos Macronutrientes: NO3. Zn+.. K+. glucosa. Cu2+. mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotínico (C) Biotina Aminoácidos Glicina Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0. SO42Micronutrientes: Fe2+. Mo2+.7 a 1%) Gelrite® pH 5.6 ± 5.. Mg2+. PO43. Ca2+.

Se usa entre 5 y 10 g/L Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . ‡ Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas.Formulación básica de un medio de cultivo para tejidos vegetales ‡ Soluciones concentradas de macroelementos (100x) ‡ Soluciones concentradas de microelementos (100x) ‡ Vitaminas grupo B (500 ó 1000x) ‡ Mio-inositol (100 mg/L) ‡ Azúcares: Generalmente sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L.

etc.Propiedades físicas de los medios de cultivo Semisólido Consistencia del medio Líquido ‡ El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). . ‡ El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías: Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . crecimiento lento. *también en medio semisólido . . ‡ En el caso de un medio sólido.Cultivo de suspensiones celulares. la concentración y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad.Cultivo de protoplastos.Inducción de embriogénesis*.).

Se modifica durante el crecimiento de los cultivos. . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes. .Se ajusta en el rango 5. . La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado.Constituye un factor crítico.8.5 ± 5.La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno.Propiedades físicas de los medios de cultivo ‡ Intercambio gaseoso: Los recipientes de cultivo se tapan con una película de polietieleno (Resinite”) para posibilitar el intercambio de gases. . ‡ pH: .

Composición de medios de cultivo comúnmente usados .

Composición de medios de cultivo comúnmente usados .

Reguladores del crecimiento comúnmente usados en los medios de cultivos vegetales .

.Etileno ‡ Generalidades: .Giberelinas .Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).Citocininas .Reguladores del crecimiento ‡ Grupos básicos de reguladores del crecimiento: .Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa.Actúan a bajas concentraciones .Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.Acido abscísico . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . .Auxinas . Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.

las hojas jóvenes.1 mg·Kg-1. tallos y frutos .Alargamiento y división celular .Auxinas: estos compuestos se emplean básicamente como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis O OH N Acido indol acético (AIA) (auxina endógena) ‡ Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero químico responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleóptilo de gramíneas.4-D) . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Su transporte es polar ‡ Auxinas sintéticas: .Acido naftalen acético (ANA) .Estimulación de la producción de etileno ‡ Se sintetizan en las yemas. los frutos y en el embrión.4-diclorofenoxiacético (2.Acido indol butírico (IBA) .Crecimiento de secciones de hojas.Acción herbicida . .2. La concentración endógena en la planta varía entre 0.Dominancia apical .001 y 0.Formación de raíces adventicias .

La concentración endógena en plantas varía entre 0.Retardo de la senescencia .Promoción de la división celular .Citocininas: en combinación con las auxinas. se encuentran en todos los tejidos.Isopenteniladenina (2iP) ‡ Citocininas sintéticas: . ‡ Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas: . determinan diferentes respuestas morfogenéticas ‡ Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro.Benziladenina (BAP) Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Se sintetizan en el embrión y las raíces. .1 y 500 Qg·Kg-1.Cinetina (Kin) .Zeatina (Zea) .Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos ‡ Citocininas endógenas: .Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citocininas) . ‡ Su transporte es no polar.

Estructura química de las principales citocininas .

a partir de plantas de arroz infectadas.Floración . ‡ Su transporte no es polar.Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo Acido giberélico (GA3) ‡ Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi. . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Se sintetizan en hojas jóvenes. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. ‡ Algunos efectos mediados por las giberelinas son: .Germinación de semillas en dormancia . Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. ‡ El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada.Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales . yemas y en el embrión.Crecimiento de yemas latentes .Movilización de reservas en la semilla.

Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

Elección del explante inicial y de la formulación del medio de cultivo .Multiplicación del material stock ‡ Enraizamiento .Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre .Etapas de la micropropagación vegetal ‡ Iniciación .Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro ‡ Rusticación .Establecimiento del cultivo in vitro ‡ Multiplicación .Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .Desinfección superficial de los explantes .

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .Organogénesis . No se obtienen por esta vía plantas completas directamente.La organogénesis es de origen pluricelular. El resultado es una planta completa.Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas en la diferenciación de novo de brotes y/o plantas completas ‡ Posibles vías morfogenéticas: .La embriogénesis se presupone de origen unicelular. Una célula del explante se aísla y constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Un grupo o cluster de células del explante inicial se desdiferencía inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico. .Embriogénesis ‡ Diferencias entre las dos posibles vías: .

Etapas implicadas en el protocolo de micropropagación de una especie vegetal Elección de una planta madre selecta Explantes ETAPA 1 Desinfección superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicación ETAPA 2 Formación de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes Pasaje a maceta en un invernadero Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ETAPA 3 ETAPA 4 .

Elección del explante inicial .

05%.Etanol 70%. el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar. . entre 5 y 30 min Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2).01 y 0.Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) al 5 a 20%.Enjuagues con abundante agua estéril (4 ó 5 veces).En el caso del HgCl2. entre el 0. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . entre 5 y 10 segundos. . .Los explantes deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal: .

Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro .

Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

Propagación vegetativa por embriogénesis somática .

Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por encapsulación en alginato .

Sistemas de micropropagación vegetal .

Sistemas de micropropagación vegetal Proliferación de yemas axilares o apicales Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

a partir de una única yema inicial.La tasa de multiplicación (t.m.Por ejemplo.El cultivo de meristemos es un caso especial del uso de esta técnica. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemos.000. entre otras variables.) se calcula con base en el número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explante inicial. . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . .m.Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes ‡ Proliferación de yemas apicales o axilares . .Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes.000 plantas en un solo año. con una t. entre una resiembra y otra sucesiva. de 5/mes podrían obtenerse 10. dependiendo de la especie en cuestión.

.

Sistemas de micropropagación vegetal Proliferación de tejidos desdiferenciados Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. meristemo. . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . células en suspensión. especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala. Esto debe tenerse en cuenta. etc.) .Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes.Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explante cultivado in vitro (disco de hoja.Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro ‡ Consideraciones generales: .Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos.

Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta .

Sistemas de propagación vegetativa in vitro Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

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Sistemas de micropropagación vegetal Cultivo de meristemos Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

Los meristemos son grupos de células indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta Los meristemos determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos ‡ Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales. . hongos y/o bacterias. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus. ‡ Son ampliamente utilizados como explantes para la criopreservación y conservación de germoplasma.

Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Meristemos intercalares . . . .Están localizados en la porción terminal o distal del vástago y de la raíz.Determinan el crecimiento radial de los órganos vegetales.Sus divisiones dan lugar a las células de los tejidos pimarios del tallo y la raíz. .Se limitan a la producción de órganos florales. . .Son organogénicos.Dan lugar a los tejidos de conducción.Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces .Derivan de la transformación de meristemos apicales.En el curso del desarrollo de la planta. ‡ Meristemos florales .En el cuerpo de una planta se reconocen diferentes tipos de meristemas ‡ Meristemos apicales . persisten restos de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros.Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces. ‡ Meristemos secundarios .

El empleo de los meristemos como explantes del cultivo in vitro constituye una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas Cultivo de meristemas Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .

. .El cultivo de meristemos facilita la eliminación de patógenos .El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción). 1934). Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . .Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.El número de partículas virales es menor en los meristemos que en otros tejidos (White.

5 mm. ‡ Etapas del cultivo . Eliminación de las primeras hojas.Elementos generales para cultivo in vitro. . . .) . .Disección del meristemo bajo lupa.Aspectos Asp técnicos del cultivo de meristemas ‡ Equipamiento .Propagación del material (a partir de estacas uninodales. . Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales . . .Regeneración de yemas axilares. Subcultivo a medio sin hormonas para la obtención de plantas completas.Elección del explante: escencialmente meristemos apicales de vástago.Instrumental de disección.Rusticación.Esterilización de la yema o porción apical del vástago conteniendo al meristemo propiamente dicho.Lupa estereoscópica. Tamaño aproximado 0.Transferencia del explante al medio de cultivo semi-sólido. Domo meristemático desnudo o acompañado por 2 ó 3 pares de primordios foliares. etc.

Si el explante incluye 2 pares de primordios el % de plantas sanas es menor.Consideraciones prácticas sobre el cultivo de meristemos ‡ La eficiencia del cultivo de meristemos como procedimiento para la obtención de plantas sanas dependerá del tamaño del explante.1 mm (o menor). Ejemplos prácticos: . 100% de plantas sanas. .Frutilla (Fragaria sp) / ¿patógeno?: Explantes de 0. . 10% de plantas sanas. ‡ Existe una situación de compromiso entre el tamaño mínimo posible del meristemo y su capacidad de desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales .Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X: Explantes de 0.Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V: Se obtienen altas eficiencias de saneamiento cultivando explantes de no más de 2 pares de primordios foliares.22 mm.

Alcances de la micropropagación vegetal ‡ Propagación vegetativa rápida y a gran escala ‡ Uniformidad seleccionada del material clonado ‡ Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales ‡ Reducción en el tiempo de multiplicación y en el espacio requerido para tal fin ‡ Mayor control sobre la sanidad del material propagado ‡ Introducción rápida de nuevos cultivares Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ‡ Conservación de germoplasma ‡ Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal .

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