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Cite esto: J. Am. Química. Soc. XXXX, XXX, XXX-XXX pubs.acs.org/JACS

Regulación alostérica a base de sustrato de una enzima

homodimérica
Pedram Mehrabi,†,‡,§,† Di Pietrantonio,∥,▽ Tae Hun Kim,∥⊥
, ,▽
Adnan Sljoka,∥,#,⊗ Keith Taverner,∥
Christopher Ing Natasha Kruglyak, † Pomes̀, Emil F. Pai,*,†,§,+,¶
,⊥,+ §,+ ⊥,+

y R. Scott Prosser*,†,∥,+,¶
†Department de Biofísica Médica, Universidad de Toronto, Toronto, Ontario M5G 1L7, Canadá
‡Department para la Dinámica Resuelta Atómicamente, Max-Planck-Instituto para la Estructura y la Dinámica de la Materia,
Luruper Chaussee 149, 22761 Hamburgo, Alemania
§Instituto Familiar Campbell para la Investigación del Cáncer, Centro de Cáncer Princesa Margarita, Toronto, Ontario M5G 1L7,
Véase https://pubs.acs.org/sharingguidelines para conocer las opciones sobre cómo compartir

Canadá
∥Department de Química, Universidad de Toronto, UTM, 3359 Mississauga Road North, Mississauga, Ontario L5L 1C6, Canadá
Descargado vía GUILFORD COLG el 22 de julio de 2019 a las 08:20:48 (UTC).

⊥Program en Medicina Molecular, Instituto de Investigación, Hospital para Niños Enfermos, Toronto, Ontario M5G 0A4, Canadá
#CREST
, Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST), Departamento de Informática, Escuela de Ciencia y Tecnología, Universidad
Kwansei Gakuin, Sanda 669-1337, Japón
+Departamento
de Bioquímica, Universidad de Toronto, 1 King's College Circle, Toronto, Ontario M5S 1A8, Canadá
⊗Center para el Proyecto de Inteligencia Avanzada, RIKEN, 1-4-1 Nihombashi, Chuo-ku, Tokio 103-0027, Japón
legítimamente los artículos publicados.

*Información de apoyo

RESUMEN: Muchas enzimas operan a través de la reactividad de

la mitad de los sitios en los que un solo protomero está catalizado
en un momento dado. En el caso de la enzima homodimérica,
fluoroacetate dehalogenasa, la unión al sustrato desencadena el
cierre de un dominio de tapa reguladora en el protomero vacío,
impidiendo el acceso del sustrato al sitio activo restante. Sin
embargo, el protomero vacío cumple una función crítica al
adquirir más desorden en la unión al sustrato, favoreciendo así
entropicalmente la reacción hacia adelante. La dinámica del
protomero vacío también se acopla alostéricamente al protomero
ligado, impulsando el intercambio conformacional en el sitio
activo y el progreso a lo largo de la coordenada de reacción.
Aquí, mostramos que en altas concentraciones, un segundo
sustrato se une a lo largo del canal de acceso al sustrato del
protomero ocupado, por lo tanto
amortiguando la dinámica de los interprotómeros e inhibiendo la catálisis. Si bien una mutación (K152I) anula la unión con el
segundo sitio y elimina el inhibidor effects, también reduce precipitadamente la tasa catalítica máxima, lo que implica un papel
para la bolsa alostérica a bajas concentraciones de sustratos, donde sólo un único sustrato se compromete con la enzima a la vez.
Mostramos que esta bolsa exterior first desuelve el sustrato, con lo que se deposita en el sitio activo. La unión del sustrato con el
sitio activo desencadena entonces que la bolsa exterior vacía sirva como un conducto alostérico interprotómero, permitiendo
■ una mayor dinámica y un muestreo de los estados de activaciónla necesarios
INTRODUCCIÓN cuestión depara
cómolauna
catálisis.
enzimaEstas redes
que ha alostéricashasta
evolucionado y losser
consiguientes cambios resultantes de la segunda unión de sustratoscomo se delinean utilizando la teoría de la transmisión
máximo efficient para un sustrato dado puede al mismo alostérica
Muchas
basadaenzimas han evolucionado
en la rigidez hasta alcanzar
y se validan mediante una notable
resonancia magnética nuclear y estudios funcionales. Los resultados ilustran el papel
catalización efficiency y de
specificity. 1
Si bien parasu estructura tiempo inhibirse cuando el sustrato es excesivo. 7 Hay muchas
de la dinámica a lo largo las redes alostéricas facilitar la función.
proporciona el entorno adecuado para el reconocimiento de situaciones en los sistemas vivos en las que la inhibición del
sustratos y specificity, la dinámica también desempeña un papel sustrato es una necesidad funcional. Un ejemplo bien conocido
fundamental en el proceso. Por ejemplo, la enzima flexibility es el de la acetilcolinesterasa, que se inhibe en la fase temprana
facilita la toma de muestras de conformadores que sirven para de la señalización, cuando las altas concentraciones transitorias
capturar y posicionar el/los sustrato(s) en el sitio activo, de acetilcolina están destinadas a comprometer los receptores
someterse a los pasos químicos requeridos y liberar el/los de la membrana postsináptica. A medida que las concentraciones de
producto(s). 2-6 Las actividades de las enzimas están acetilcolina libre disminuyen, la acetilcolinesterasa debe
estrechamente reguladas en muchos procesos celulares, a
menudo mediante la unión de inhibidores en los sitios
alostéricos o catalíticos. En más del 20% de las enzimas, el Recibido: 6 de abril de 2019
sustrato mismo puede servir como © XXXX inhibidor, suplicando
Sociedad Americana de A Publicado: 12 de junio de 2019 DOI: 10.1021/jacs.9b03703
Química J. Am. Química. Soc. XXXX, XXX, XXX-XXX
Revista de la Sociedad Química Americana Artículo

Figura 1. Múltiples sitios de unión de moléculas de sustrato en el lento mutante Y219F.(A) Una sección transversal a través de un protomero de
FAcD que muestra el canal de acceso al sustrato desde la superficie de la proteína hasta el sitio activo. Bajo altas concentraciones de sustrato, un
segundo sitio de unión de sustrato se revela en el canal de acceso del protomero unido, donde la cadena lateral de I253 del dominio de la tapa, es
desplazada por la unión del FAc. (B) LigPlots59 de las dos moléculas de sustrato mostrando los contactos entre los ligandos y la proteína para cada
uno de los sitios de unión. Dos enlaces de hidrógeno unen los oxígenos carboxílicos del FAc a las cadenas laterales de Y141 y K152 en el segundo
bolsillo. En contraste, hay five interacciones de unión entre el FAc y otros residuos en el sitio activo. (C y D) Mapa de densidad electrónica 2Fo-Fc
contorneado en 1σ alrededor del final del canal de acceso al sustrato del FAcD. (C) En el protomero vacío, sólo se pueden ver las moléculas de
agua y un ión de cloruro, mientras que el otro protomero (D) mantiene las dos moléculas de sustrato en lugares adyacentes.

efficiently catalizar la rápida degradación del compuesto para
terminar la transmisión de los impulsos nerviosos. 7,8 En el
presente estudio, presentamos los resultados relativos al
fenómeno de la inhibición del sustrato y los mecanismos
alostéricos en juego para una enzima homodimérica,
fluoroacetate dehalogenase (FAcD) de Rhodopseudomonas
palustris.
Como la mayoría de las enzima s son oligoméricas,
uno podría
anticipar que la forma más común de inhibición de sustratos
podría implicar la unión de sustrato(s) adicional(es) a
protomeros desocupados, lo que daría lugar a la inactivación o
atenuación de la catálisis mediante la inhibición alostérica del
oligómero general. 7,9-11 Alternativamente, dentro de una subunidad
dada, podemos prever un segundo sitio de unión de sustratos a
lo largo del camino de acceso al sitio activo. En este caso, se
esperaría que la unión por un segundo sustrato ralentizara el
acceso del sustrato al sitio activo (y la salida del producto del
mismo). 8 Una tercera posibilidad sería que el sustrato se ligara
a un sitio completamente different, no asociado ni a los sitios
activos ni a la vía de acceso, lo que daría lugar a una
inhibición alostérica. Estudios espectroscópicos y
cristalográficos recientes del FAcD
revelan que se somete a catálisis a través de la reactividad de la
mitad de los sitios,12-16 donde la dinámica del protomero vacío y
la alosteria interprofesional iniciada por la unión de sustratos se
catalizan en gran medida influence. 17 Al unirse un solo sustrato,
el acceso del sustrato al sitio activo en el protomero vacío se
impide estrictamente mediante un dominio de tope regulador
dinámico, que se examina a continuación. No obstante, se
produce la unión del sustrato del segundo sitio, aunque en una
bolsa alostérica a lo largo del canal de acceso al sustrato
asociado con el protomero ocupado. Sin embargo, como la
tasa catalítica es mucho más lenta que la tasa off para el
segundo sustrato, la salida del producto no se atenúa
significantly. Más bien, la bolsa alostérica se muestra aquí
como un centro de transmisión alostérica interprotómero. Por
lo tanto, la unión simultánea de los sustratos tanto al sitio
activo como a la bolsa alostérica restringen tanto la
transmisión alostérica como la dinámica de la enzima, lo que
resulta en una pérdida en el catalizador efficiency. Por el
contrario, a bajas concentraciones de sustrato, esta misma bolsa
alostérica mejora la efficiency catalítica. Esto se logra mediante
B un proceso en el que el sustrato seJ. Am.desolva first y luego se
Química. Soc. XXXX, XXX, XXX-XXX
deposita en el sitio activo, lo que desencadena una
DOI: 10.1021/jacs.9b03703
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Figura 2. El dominio de la tapa reguladora exhibe fluctuations correlacionado con la unión de los sustratos en el sitio activo. (A) La estructura del
FAcD, ligado
cristal de rayosaXundesustrato FAc, contrastando las distintas orientaciones del dominio de la tapa en los protomers libres y ligados al sustrato. (B)
Rayos X
C DOI: 10.1021/jacs.9b03703
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Figura 2. Continuación

estructura cristalina del FAcD, en la que se observa que dos sustratos se unen a un protomero. En este caso, se puede observar que la tapa
reguladora del protomero vacío adopta un estado "cerrado" más pronunciado, lo que implica una respuesta alostérica, mediada por la unión de un
segundo sustrato. C) Instantánea de la trayectoria del DM del FAcD en la que dos sustratos permanecen unidos a un protomero y pueden
observarse conformaciones alternativas de los dominios de la tapa reguladora. (D) Root-mean-square fluctuations para different estados de
ocupación de sustrato del monómero. Este análisis revela que los aminoácidos que forman el dominio cap se someten a significant fluctuations en
un estado de ocupación dependiente del estado (0 < 1 < 2 FAc). (E) Desviación cuadrática media de los átomos del dominio cap Cα con respecto
a la estructura cristalográfica del protomero unido al sustrato y vacío representado en el panel
B. La reducción de las excursiones de dominio de la tapa del estado de referencia del protomero vacío se produce de manera dependiente de la
ocupación. El dominio de la tapa de la
Los protomeros ligados al sustrato pueden adoptar diversos estados de conformación con una gran desviación de la estructura de referencia,
mientras quedinámica
respuesta el protomero sin sustrato
llevada a cabo adopta una única
a través de conformación
este centro cercanacada
a la estructura
protomero, cristalográfica.
la RMN 19F de fluorotryptophan enriquecida
alostérico, permitiendo el muestreo de los estados de activación con FAcD proporciona una lectura conveniente de la movilidad
necesarios para la catálisis. Los mecanismos asociados a esta local, estados de excitación adicionales y dinámicas alostéricas
exquisita regulación y el papel del segundo bolsillo en la del interprotomero. Junto con los experimentos de
alosteria interprotómica se examinan a continuación. cristalografía, RMN 19F y RMN (15N,1H) del WT FAcD, D110N
El FAcD cataliza la hidrólisis de los enlaces de carbono (intermedio de Michaelis-Menten), Y219F (mutante lento),
halógeno, H280N (intermedio covalente) y K152I (eliminación de la
specifically el enlace C-F, generando como productos el bolsa alostérica) proporcionan nuevos conocimientos sobre los
glicolato, un ión haluro y un protón. En estudios anteriores, procesos alostéricos, los mecanismos de inhibición del sustrato y
determinamos las estructuras cristalinas de los principales el papel de la bolsa
concentraciones alostéricano
de sustratos en la mejora de la catálisis bajo
intermediarios catalíticos, algunos de ellos estabilizados por saturados.
mutaciones de residuos implicados en la catálisis. 17,18 En ■ RESULTA
particular, la estructura compleja de Michaelis-Menten
determinada por la cocristalización del mutante D110N del LaDOS
cristalografía revela dos moléculas de sustrato
FAcD con sustrato, mostraba un sustrato unido en sólo uno de Un enProtomer bajo el exceso de sustrato. Para
los sitios activos del dímero. Para permitir experimentos
17 la progresión
monitorear de los eventos de unión asociados con la
inhibición de los sustratos, hicimos uso de cristales de rayos X
gráficos de cristales dependientes del tiempo, hemos hecho uso
que atrapan el hielo. 19 Utilizando un mutante catalíticamente
de un mutante (Y219F) cuya inusualmente baja tasa catalítica
lento (Y219F), fue posible capturar los estados de unión al
(kcat = 0,035 min-1) nos permite extender los tiempos de
sustrato y la subsiguiente generación de producto en el sitio
remojo del sustrato en los cristales de proteínas de minutos a
activo, después de remojar los cristales en el sustrato de 200
horas. Esto permite capturar sucesivas poses funcionales como
mM desde 30 min hasta 24 h, seguido de la congelación de
el complejo de Michaelis-Menten y un estado ligado al flash. A partir del Y219F sin sustrato, se puede capturar una
producto como una función cruda del tiempo, utilizando la progresión de estados del sitio activo que unen dos aguas y un
cristalografía de rayos X con trampa de congelación. Si bien el ión de haluro a la unión del sustrato FAc y la formación de un
mecanismo catalítico es similar tanto en el tipo salvaje (WT) supuesto complejo de productos de glicolato (Figura S1).
FAcD como en el Y219F, la ausencia del grupo hidroxilo en Curiosamente, utilizando concentraciones de sustrato más
el mutante probablemente comprometa la estabilización altas en el remojo buffer observamos un complejo intermedio
electrostática del haluro saliente, con lo que se ralentiza la que contenía dos moléculas de sustrato en un protomero,
catálisis. Mientras que el mutante D110N permite atrapar el mientras que el otro protomero permanecía vacío, lo que es
complejo de Michaelis-Menten effectively, el mutante H280N coherente con la reactividad de la mitad de los sitios. 17 Como se
impide en gran medida un paso de hidrólisis posterior, muestra en la Figura 1A,D, uno de los dos sustratos adopta una
atrapando así el intermediario covalente. En altas posición y orientación que se superpone estrechamente con la
concentraciones de sustrato, es posible con H280N a first del complejo Michaelis- Menten, mientras que la segunda
saturar el sitio activo con un intermediario covalente y molécula de sustrato está a 6 Å de distancia, adyacente a la
observar posteriormente la unión del sustrato exclusivamente a interfaz del dímero y al dominio de la tapa, a lo largo del canal
la bolsa alostérica. Así, al realizar estudios de unión de que conecta el sitio activo con el exterior de la proteína. En
sustratos con D110N y H280N (al saturar el sitio activo con contraste, el protomero vacío revela sólo agua y un ión de
un intermediario covalente), podemos identificar las constantes haluro (Figura 1C). Como se muestra en la Figura 1B, el
de disociación y la cinética de interacción tanto con el sitio sustrato FAc en el sitio activo está ligado con hidrógeno a
activo como con la bolsa alostérica. R111, R114 y W156 mientras que el segundo sustrato se
La cristalografía de rayos X mostró que el sustrato en la bolsa coordina con las cadenas laterales de K152 (F-N: 2.9 Å) y
alostérica está directamente coordinado por Lys 152 y Tyr 141, Y141. Como se examina más adelante, K152 y Y141 están
dentro del canal de unión del sustrato (Figura 1A). La situados en una región que se ha determinado que es
mutación, K152I, anula la unión al segundo sitio y la importante para la comunicación alostérica y ambos están
inhibición del sustrato, como se mostrará. cerca de la espina dorsal de un residuo de dominio de tapa
Sorprendentemente, K152I también result a en un G252 (F-O: 3,2 Å ) .
una caída precipitada de la tasa catalítica incluso en un La reactividad de la mitad de los sitios está
sustrato bajo reforzada por un dominio de tope regulador
concentraciones. Esto sugiere que la bolsa de unión dinámico. El dímero FAcD posee un dominio de top e
alostérica no es simplemente el origen de la inhibición del regulatorio que consiste en residuos
distintos residuos de triptófano dentro del interior hidrofóbico de la bolsaAla250
sustrato, sino que también puede desempeñar un papel en el a Thr259.
de unión En elmientras
del sustrato, estado de
quetierra librecerrado
está más de sustrato,
en ellos
apoyo a la catálisis. En este documento, tratamos de dominios de tapa de ambos protomeros son altamente
comprender cómo la bolsa alostérica sirve para mejorar la D dinámicos y la densidad electrónica DOI:continua está
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catálisis a bajas concentraciones de sustrato, por qué el esencialmente ausente de esta región reguladora. Como se
homodímero actúa exclusivamente a través de la reactividad de destaca en la Figura 2A, el dominio cap parece adoptar u n
la mitad de los sitios, y más ampliamente, cómo las redes configuration ligeramente abierto a la entrada del
Revista de la Sociedad Química Americana
protomero vacío. Estudios anteriores revelaron que la unión
del sustrato a uno de los protomeros desencadena la dinámica
y la pérdida de varias moléculas de agua estrechamente unidas
en el protomero vacío restante. 17 Así pues, el cierre del tapón
regulador en el protomero vacío impide la unión de un
segundo sustrato a este protomero, asegurando así que la
entropía de la enzima aumente al máximo en un punto de la
vía de reacción en el que la dinámica es necesaria para acceder
a estados funcionales posteriores. En concentraciones de sustrato
más elevadas, cuando un segundo sustrato se une a una bolsa
alostérica en el protomero ligado al sustrato, la estructura
cristalina revela un grado aún mayor de cambio de
conformación entre los dominios de la tapa de los protomeros
vacíos y ocupados (Figura 2B). En este caso, la región del
sombrero está completamente abierta en el protomero unido y
se cierra aún más en el protomero vacío. La simulación de
dinámica molecular múltiple (MD) se repite con un tiempo
de simulación agregado de 35 μs apoya la unión FAc
dependiente effects de la dinámica del dominio cap. En las
simulaciones iniciadas a partir de un estado de dos
sustratos/libre de sustrato, la dinámica del dominio de tapa
fluctuations parece estar más restringida y centrada en un
configuration cerrado en el protomero sin sustrato, mientras
que el dominio de tapa del protomero ligado al sustrato exhibe
una mayor amplitud de movimientos (Figura 2C). La
ocupación del sustrato se correlaciona con un aumento de la
dinámica del dominio de la tapa, medida por el cuadrado de la
raíz fluctuations por residuo (región destacada en la figura
2D). El análisis de la distribución de los estados de
conformación del dominio de la tapa muestreados en las
simulaciones revela que la ocupación del sustrato promueve
specific los estados de conformación del dominio de la tapa
(Figura 2E). La unión de dos moléculas de sustrato a un
protomero conduce a la mayor heterogeneidad
conformacional en el dominio de la capa, aunque en nuestras
simulaciones este estado sólo representó el 2 ± 1% de los datos
muestreados. Este estado apoya los estados conformacionales
del dominio del casquete en los que los enlaces transitorios de
hidrógeno pueden hacerse con átomos de sustrato a granel
(protomero izquierdo, Figura 2C), aunque el significance
estadístico de estas interacciones no puede ser quantified de
nuestros datos. Por el contrario, en el protomero sin sustrato,
la dinámica del dominio de la capa se limita esencialmente a la
pequeña amplitud fluctuations en una cuenca estrecha y muy
poblada con una estructura similar al estado cristalográfico.
Los cambios dependientes de la ocupación en el conjunto
conformacional del dominio de la tapa se visualizan a través de
múltiples repeticiones de la simulación (Figura S10). La
dinámica del dominio de la tapa sin sustrato puede estar
sistemáticamente sesgada por la presencia del estado de la tapa
sin sustrato en el protomero adyacente. El análisis de la
dinámica del dominio de la tapa sugiere una base estructural
para la preservación de la reactividad de la mitad de los sitios
basada en la modulación del dominio de la tapa fluctuations y
los estados de conformación mediante la ocupación del
sustrato, con implicaciones causales para la alosteria del
protomero y la inhibición del sustrato. Esto tiene
consecuencias obvias con respecto a la alosteria del
interprotómero, las excursiones dinámicas del dímero y la
inhibición del sustrato.
Las altas concentraciones de sustrato inhiben la
catálisis. Utilizando la RMN 19F o 1H, es posible medir las
concentraciones "en tiempo real" de sustrato (FAc o ClAc,
respectivamente) y de producto (F-) en la reacción catalizada
por el FAcD, como se muestra en la figura 3. El WT-FAcD se
inhibe claramente a concentraciones de sustrato más elevadas
(tanto para los sustratos FAc como para los ClAc). Obsérvese
que el FAcD, que está optimizado para fluoroacetate, hidroliza
Artículo
Figura 3. La cinética enzimática del FAcD revela la inhibición del
sustrato. Los gráficos de las tasas iniciales en función de la
concentración de sustrato revelan la clásica inhibición de sustrato para
el WT-FAcD en presencia de sustratos de FAc o ClAc (mostrados con
guiones negros y rojos, respectivamente). La mutación (K152I) da
lugar a la pérdida de la bolsa de unión al sustrato alostérico y, por
tanto, a la cinética de Michaelis-Menten, como muestran los datos
indicados en el sólido rojo anterior. Obsérvese que los datos de
velocidad de reacción asociados con el WT-FAcD, en presencia de
sustrato FAc, se presentan utilizando la escala del eje y de la izquierda,
mientras que los del WT-FAc D con sustrato ClAc o los del K152I
con sustrato FAc se grafican utilizando la escala de la derecha. Todos
los datos fueron fitted usando la ecuación 1 descrita en la sección de
Discusión.
segundo sustrato a una bolsa alostérica del protomero unido al
sustrato. Como control, empleamos un mutante (K152I) en el
que se elimina un enlace de hidrógeno estabilizador clave entre
el grupo épsilon amino de la cadena lateral de la lisina y el
segundo sustrato. Los espectros de RMN 15N,1H del K152I (
Figura S2) se superponen bien con los del WT-FAcD, lo que
sugiere que esta mutación no significantly altera la estructura
terciaria ni la estabilidad de los pliegues. Como se muestra en la
Figura 3, la velocidad de reacción profile del K152I FAcD
parece seguir ahora una cinética perfecta de Michaelis-Menten,
alcanzando velocidades de reacción máximas en condiciones
de concentraciones de sustrato más altas (Tabla 1). Sin
embargo, esta mutación también da lugar a una pérdida en la
tasa de catálisis de más de un orden de magnitud. Esto sugiere
que en concentraciones más bajas, en las que sólo hay un
sustrato, el K152 debe desempeñar un papel fundamental como
modulador alostérico positivo.
El FAcD une el sustrato débilmente y el correspondiente alto
La tasa de off puede ser un factor que contribuya a la baja
catalítica de efficiency. Se obtuvo una constante de disociación
general del sustrato del FAc con el intermediario Michaelis-
Menten mediante una isoterma de unión de FAc de 19F NMR en
presencia del mutante D110N. El sustrato affinity en ausencia
de la bolsa alostérica (es decir, D110N/K152I) se midió
entonces de manera similar. Por último, el affinity del sustrato
a la bolsa alostérica solo se obtuvo utilizando el mutante
H280N que contiene glicolato (unido covalentemente por un
enlace de éster a la cadena lateral de D110) en el sitio activo.
El análisis del ancho de línea de la RMN 19F en función de la
concentración de FAc proporciona, por tanto, una estimación
de la unión del ligando al sitio activo con kd1 = 0,90 ± 0,17
mM (D110N) y kd1 = 0,93 ± 0,11 mM para el mutante
K152I, lo que sugiere que no hay pérdida de unión affinity para
el K152I (Tabla 2, Figura S3). El mutante H280N también se
saturó por separado con cloroacetato hasta que el intermediario
E covalente se estableció completamente. Después DOI:de la diálisis del
10.1021/jacs.9b03703
J. Am. Química. Soc. XXXX, XXX, XXX-XXX
exceso de cloruro y sustrato, se registraron los espectros de
RMN 19F en función del sustrato FAc
Revista de la Sociedad Química Americana Artículo

Tabla 1. Cinética de estado estable del FAcDa

WT-FAcD + FAc WT-FAcD + ClAc K152I-FAcD + FAc
Vmax (mM/s)8.25 ± 0.81 × 10-2 8.04 ± 0.81 × 10−3 5.81 ± 0.16 × 10−3
mM)86.8 ± 13.7
Km ( 25.6 ± 5.6 18.8 ± 2.7
Ki (mM)363 ± 70 727 ± 260 −
kcat (s-1)1.07 ± 0.11 0.106 ± 0.011 0.077 ± 0.002
kcat/Km (s-1 M-1)12.3 ± 2.3 4.13 ± 1.00 4.12 ± 0.90
aLos
parámetros fueron determinados por fitting los datos de la figura 3 con la ecuación 1. Obsérvese que la condición utilizada aquí para medir la
cinética de reacción (500 mM Tris buffer, pH 8,5) differ de las utilizadas en estudios anteriores de la enzima de tipo silvestre18 , aunque la tendencia
del FAc al ClAc es similar.
Tabla 2. Perturbaciones de desplazamiento químico y que la tasa de ese muestreo puede dictar la tasa catalítica. La
anchos de línea de los picos de RMN del 19F de los estados de dinámica también puede ocurrir en una escala de tiempo más
una y dos bandas localizada y más rápida. En circunstancias ideales, los indicios
W156
CIAc BrAc IAc Glicolaje
de esa dinámica surgen de los factores B asociados a las
estructuras cristalinas de alta resolución, en las que las regiones
CSP1 (Hz) 1060 952 731 1536 del protomero vacío presentan factores B más elevados. 17 La
CSP2 (Hz) 908 NA 392 NA unión del segundo sustrato al mutante Y219F parece restringir
Ancho de línea 1 505 582 607 172 la heterogeneidad conformacional de la enzima, basándose en
(Hz) Ancho de 264 NA 224 NA la distribución de los factores B y en la densidad de electrones
línea 2 (Hz) W185 en regiones de la proteína que se observan dinámicas en el
CIAc BrAc IAc Glicolaje complejo D110N Michaelis-Menten. En particular, la densidad
electrónica que representa el dominio de la tapa es mucho
CSP1 (Hz) 400 473 242 649 mejor defined en las estructuras mutantes del Y219F (Figura
CSP2 (Hz) 298 NA 22 NA 2B).
Ancho de línea 1 (Hz) 178 171 291 110
Se utilizó la espectroscopia de RMN 19F de 5-
Ancho de línea 2 (Hz) 124 NA 145 NA
fluorotryptophan enriquecida con FAcD para caracterizar la
para determinar la constante de disociación con la respuesta al segundo sitio
la unión e inhibición del sustrato con respecto al conforma-
d2 se estimó en 2,2 ± 0,83
bolsa alostérica, k , que
mM (Figura S3). Suponiendo que la tasa de activación del y dinámicas de intercambio. Observamos que en un estudio
segundo bolsillo es simplemente limitada a diffusion, y anterior, 5-fluorotryptophan enriquecido FAcD fue cristal-
teniendo en cuenta el segundo sustrato affinity, se espera que la lizado, confirming una estructura idéntica a la de la enzima sin
tasa del sustrato off sea del orden de 105 s-1. Dado que la tasa etiquetar (raíz- desviación media-cuadrado de 0,14 Å). 17 Los
catalítica se mide como 64,2 ± 6,6 min-1, la tasa de off del espectros de la figura 4 y la figura S5 muestran los resultados
segundo sustrato no es claramente limitante de la tasa con de la titulación de los sustratos (ClAc e IAc), el análogo de
respecto a la salida del producto del sitio activo. Affinity del sustrato (BrAc) y el producto (glicolato) en los espectros de
glicolato (producto) al sitio de unión secundaria es RMN 19F del WT-FAcD. Obsérvese que para cualquiera de los
baja. Las estructuras de cristal con tiempos de remojo de más dos sustratos, los desplazamientos químicos y los anchos de
de 24 h muestran el producto de glicolato en una nueva línea asociados con W156, W185, W264 y W267 se desplazan
orientación, rotada por 68° y flipped. Los oxígenos en una dirección y luego invierten su tendencia a una
carboxílicos siguen coordinados con los dos residuos de concentración correspondiente a donde esperamos observar la
arginina, R111 y R114, pero el grupo hidroxilo ahora interactúa unión de un segundo sustrato (Figura S6). Una tendencia
con la bolsa de unión de halogenuros en lugar de con el R114 similar se observa para W185 cerca del sitio activo (Figura S5
(Figura S4). Esta orientación de menor energía de unión del ). Por el contrario, las titulaciones del análogo del sustrato,
glicolato en el mutante Y219F, que no se observa en la BrAc, y del producto simplemente dan lugar a una tendencia
proteína nativa, bien podría ser una consecuencia de la pérdida monótona tanto en el desplazamiento químico como en el
del hidroxilo de tirosina, lo que lleva a una alteración de la ancho de la línea, consistente con la unión de un solo sitio que
forma y la electrostática profile del sitio activo. Las estructuras desplaza el equilibrio conformacional en la enzima.
determinadas a partir de cristales empapados durante más de 24 La naturaleza bifásica de la respuesta del cambio químico a
h revelaron sólo el producto de glicolaje sin especies de FAc la unión del sustrato se observa también en los espectros de
ocupando la bolsa alostérica. Puede ser que el configuration de RMN 15N,1H a concentraciones de sustrato equivalentes en los
la bolsa catalítica desestabilice alostéricamente la unión de la que se prevé una unión en un segundo lugar (figura S7). La
segunda molécula del sustrato. La falta de unión secundaria en mayoría de los residuos que exhiben tal comportamiento
la bolsa exterior también sugiere que el affinity de glicolato bifásico se localizan en la región de la interfaz del dímero
para este sitio de unión es insufficient para llevar a (Figura S7), que se encuentra muy cerca del sitio de unión
formación de complejos estables. secundaria y ha sido anteriorment e identified como clave
La RMN 19F muestra una reducción de la dinámica para
de intercambio cuando se unen dos sustratos. comunicación alostérica interprotómica. 17 Un
Anteriormente observamos que la enzima libre de sustrato número de
experimenta un intercambio conformacional en una escala de Los residuos que están distantes del segundo sitio de unión
tiempo de milisegundos entre los protomeros y que la también dan lugar al mismo comportamiento bifásico como se
frecuencia asociada a este proceso de intercambio se incrementa muestra en la figura S7A. Esto también es probablemente una
de hecho al añadir el sustrato de ClAc. 17 Además, la unión del consecuencia de la respuesta alostérica de largo alcance a la
IAc, donde se sabe que la kcat es más lenta, también da lugar a unión del segundo sitio. Por último, observamos que en el caso
un aumento de la dinámica, aunque en menor medida, lo que F de dos sustratos unidos, specific regiones enDOI: cada uno de los
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sugiere que esos procesos de intercambio pueden facilitar la protomeros de la estructura cristalina dímero del Y219F son
toma de muestras de estados funcionales clave necesarios para sufficiently distintas que sus correspondientes cambios
la catálisis y químicos de amida se predicen (por SPARTA+) para ser
Revista de la Sociedad Química Americana Artículo

Figura 4. Espectros de RMN 19F de W156 al valorar el producto (glicolato), un análogo de sustrato (BrAc) y sustratos (ClAc e IAc) con WT-FAcD.
Obsérvese que las flechas indican la dirección del desplazamiento químico asociado al aumento de la concentración de ligandos. A continuación se
muestra una ilustración del aumento de la dinámica en first de la unión del sustrato, seguida de una atenuación de la dinámica en la unión del segundo
sitio en los espectros de RMN del IAc 19F. Las regiones borrosas apuntan a zonas de alto desorden, mientras que las superposiciones en rojo indican
regiones en las que los factores B eran anteriormente identified como anormalmente altos.
Sin embargo, observamos un fuerte solapamiento entre las función de la concentración del análogo de sustrato (BrAc)
regiones asimétricas únicas del dímero en la estructura del tanto para la enzima WT como para el mutante K152I. El BrAc
cristal y las regiones que exhiben un comportamiento de muestra una solubilidad pobre y como tal, es difficult para
cambio químico bifásico en los espectros 15N,1H-HSQC. Así, alcanzar las concentraciones de sustrato necesarias para
mientras que la unión de dos moléculas de sustrato al mismo asegurar la saturación del segundo sitio de unión. No obstante,
protomero restringe la dinámica general, las regiones que podemos comparar el alcance del intercambio conformacional
exhiben perturbaciones de cambio químico bifásico y la dinámica del protomero a través de los espectros de RMN
probablemente sean el resultado de una respuesta alostérica de 19F y los cambios en el ancho de la línea en función del
única (comparada con la observada para la unión de un solo análogo del sustrato. Una comparación de WT-FAcD y K152I-
sustrato). FAcD muestra que hay una respuesta mucho más débil en este
La eliminación de la bolsa alostérica mediante la último, lo que sugiere que el intercambio conformacional
eliminación de un único grupo de aminoácidos interprotómero está significantly perjudicado por esta única
desacoplará la respuesta alostérica a la unión al mutación. Curiosamente, el K152I-FAcD libre de sustrato
sustrato en la bolsa del sitio activo. Es constructivo exhibe una dinámica similar a la observada con el WT-FAcD al
considerar la dinámica de intercambio relativo que añadir una cantidad equimolar de sustrato. Sin embargo, la
surgen en el dímero cuando el segundo sitio de la bolsa adición de cualquier cantidad de sustrato análogo al K152I-
alostérica es G FAcD se demostró que perjudica la dinámica que resulta en
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eliminada por medio de la mutación K152I. La figura 5
muestra una serie de espectro s de RMN 19F
de 5-
fluorotryptophan enriquecidos con FAc D como
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Figura 5. Espectros de RMN de 5-fluorotryptophan enriquecidos con FAcD en función de la concentración de sustrato analógico (BrAc). (A)
Espectros de RMN 19F del WT-FAcD en función de la concentración de BrAc. (B) Espectros de RMN 19F del K152I-FAcD en función de la
concentración de BrAc. (C) Vista ampliada del panel A que muestra el cambio en las resonancias asociadas con W156 en el sitio activo. (D) Vista
ampliada del panel B que muestra el cambio en las resonancias asociadas con W156 en el sitio activo. (E) Una ilustración del aumento de la
dinámica en los espectros de RMN K152I-W156 19F. La adición de sustrato a la enzima apo, K152I FAcD, atenúa la dinámica del interprotómero y
cambia el equilibrio conformacional a un estado similar al apo WT FacD.
firmas más características del WT-FAcD sin sustrato. Además, La dinámica conformacional y la catálisis se ven afectadas
las cantidades más elevadas de BrAc dieron lugar a un simultáneamente, pero en concentraciones más bajas parece
estrechamiento de las resonancias que se sabe que interactúan desempeñar un papel clave para mejorar la dinámica y la
con el sitio activo (W156 y W185), lo que indica una menor catálisis. Además, las perturbaciones de los cambios químicos
dinámica de intercambio. Así, mientras que la unión del sustrato no lineales de 15N,1H también apuntan a extensas regiones que
al WT FAcD inicia una transmisión alostérica efficient entre se ven perturbadas conformacionalmente por la unión de un
los protomeros, la eliminación de un solo grupo amino de la segundo sitio, lo que implica que hay una pronunciada
bolsa alostérica da como resultado la atenuación de la respuesta alostérica asociada a este sitio. Aquí, hacemos uso de
transmisión alostérica al unirse al sustrato significant. El la teoría de la transmisión alostérica basada en la rigidez para
análisis de la rigidez computacional revela que la evaluar las consecuencias de la limitación del dímero por un
segunda bolsa de unión al sustrato es un centro segundo sustrato con respecto a la transmisión alostérica del
alostérico para la comunicación entre los Protomers. interprotómero. Utilizando el análisis computacional
Mientras que el FAcD opera a través de la reactividad de la mitad previamente detallado,17 se mide el grado de transmisión de los
de los sitios, el protomero vacío juega un papel en la grados de libertad (regiones de flexibility o rigidez) desde el
facilitación de la dinámica, el intercambio conformacional y la sitio activo (región resaltada en verde en la Figura 6A) de
catálisis. El bolsillo asociado con la unión del segundo sustrato forma escalonada a través de la totalidad del protomero vacío,
es interesante desde la perspectiva de que cuando está H aplicando una pequeña ventana de tresJ. Am. Química.DOI: 10.1021/jacs.9b03703
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ocupado,
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Figura 6. Predicción computacional de la vía alostérica utilizando un algoritmo de transmisión alostática basado en la rigidez. (A) Un mapa en color,
que representa la magnitud de la transmisión alostérica desde el sitio catalítico de un protomero a specific regiones en el protomero vacío. (B)
Magnitud de la transmisión alostérica desde el sitio catalítico del protomero unido al sustrato a specific residuos en el protomero vacío, predichos a
partir de la estructura cristalina de rayos X del mutante Y219F con un sustrato (azul) o dos sustratos (rojo) unidos. C) Perturbaciones de
desplazamiento químico derivadas de la unión de dos sustratos mapeados en la estructura cristalina del mutante D110N unido al sustrato. D)
Correlación entre la intensidad de la transmisión alostérica basada en la rigidez por residuo con las correspondientes perturbaciones de
desplazamiento químico 15N,1H HSQC asociadas a la unión del sustrato al mutante D110N.

residuos (Figura 6A, Figura S9). Esto nos permite establecer un entre la intensidad de la transmisión alostérica basada en la
gráfico de la intensidad de la transmisión alostérica, que rigidez por el residuo y el residuo-specific 15N,1H Las
muestra la amplitud de la diafonía alostérica entre el sitio activo perturbaciones del desplazamiento químico HSQC se muestran
del protomero unido al sustrato y el protomero libre. La en la Figura 6D. También find residuos en el protomero vacío
intensidad de transmisión en cada residuo se traza en la con muy poca transmisión (coloreado en azul en la Figura
estructura de la proteína, lo que revela claramente la hélice de 6A); por ejemplo, los residuos 292-300 y 195-206 exhiben una
interfaz del dímero α6 (residuos 146-160) y los residuos en la transmisión limitada, de acuerdo con la falta de perturbaciones
vecindad (es decir, los residuos 135-165) son cruciales para la de cambio químico observada en el 15N,1H HSQC al titular con
comunicación alostérica del interprotómero con el valor más BrAc.
alto que se produce en I153 (Figura 6B). Esta región también El segundo bolsillo de unión al sustrato facilita un
contiene residuos asociados con la unión de haluros (H155, paso de desolación en el camino antes de la unión al
W156), la bolsa alostérica (Y141, K152) y otros que son sustrato en
adyacentes a la región de la interfaz del dímero. Los segundos el Sitio Activo. La estructura cristalina del Y219F FAcD en
picos de transmisión más altos se producen alrededor de los el
residuos 220-221, que abarcan el Y219 que está implicado en el La presencia de un solo sustrato apunta a una coordinación
enlace de haluros (Figura 6B). Si este análisis de la transmisión precisa tanto del átomo fluorine como de la fracción de
alostérica se repite para la estructura cristalina en la que están acetato a través de los enlaces de hidrógeno specific (Figura 1).
unidos dos sustratos, la intensidad de la transmisión se reduce Esto plantea la pregunta de cómo el sustrato está first
claramente como se muestra en la Figura 6B. En este caso, la desolvido. La estructura cristalina de la enzima con dos
transmisión general se produce con una energía más baja sustratos unidos a un protomero también parece indicar dos
cutoff, que recuerda más a los estados de unión a los entornos sorprendentes de different en términos de
productos o a la apo. Las dos moléculas de sustrato unidas hidrofobicidad. Para examinar el proceso de desolvación,
inhiben la capacidad de la enzima de transmitir el cambio nosotros first evaluamos el potencial de enlace de hidrógeno
alostérico, ya que se requiere más energía para transmitir a del átomo fluorine en disolvente orgánico. La fracción de
través de la vía alostérica. Una explicación razonable para esto CH2F en el sustrato ha sido previamente sugerida para servir
finding es que la red de enlace de hidrógeno subyacente es como un aceptador de enlace de hidrógeno más fuerte, cuando
más fuerte con el sustrato adicional que aprieta la estructura. se compara
hasta 1,5 mMcon las residual.
de agua fracciones20 de CHF2
Aquí, o CF3. 20 La
el equilibrio
La figura 6C indica las regiones del WT-FAcD que exhiben titulación dey,acetofenona,
constante por lo tanto,un aceptador
la energía de libre
enlacededelahidrógeno
unión del
las mayores perturbaciones de desplazamiento químico de fuerte,
hidrógenoa fluoroacetate en CCl4
puede ser medida como
y, por lo se muestra
tanto, en la Figura
aproximada a la
, al valorar el análogo del sustrato, BrAc. Estas regiones
15N 1H 7A, revela unambiente
temperatura cambio de equilibrio
donde asociadolasconmediciones
se realizan las aguas
probablemente se originan por asimetrías inducidas en el enlazadasdecon
cinéticas lashidrógeno
enzimas. Ena lalaacetofenona a 0 °C.
bolsa alostérica de Obsérvese
la enzima,
intermediario de Michaelis-Menten, que en última instancia se que el CCl4
podemos anhidro
confiar en puede contenercristalina asociada con dos
la estructura
promedian a través de un rápido intercambio interprofesional. sustratos unidos para evaluar el enlace de hidrógeno mediante
Estas mismas regiones, en su mayor parte, parecen un ejercicio de acoplamiento computacional. Al confining
superponerse con las regiones que se prevé que estén acoplarse a la bolsa alostérica, fuimos capaces de
implicadas en la transmisión alostérica, resaltadas en rojo en la I DOI: 10.1021/jacs.9b03703
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figura 6A. La correlación
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Figura 7. Enlace de hidrógeno a fluoroacetate en solución y desolación de fluoroacetate en la bolsa alostérica. (A) Espectro de RMN 19F de
fluoroacetate en el CCl4 anhidro en función del aumento de las cantidades de acetofenona. La isotermia de unión, que se realiza a 0 °C para
mejorar la detección del complejo de unión de hidrógeno fidelity, revela un kAeq de 36,1 ± 6,0 mM y una energía libre correspondiente de 1,95 ±
0,33 kcal/mol. (B) Posición de fluoroacetate en la bolsa alostérica del FAcD, revelada por estudios de acoplamiento. La pose de estado ligado
confirms la anterior finding por cristalografía de rayos X y además identifies un enlace de hidrógeno entre D134 y el átomo fluorine, sugiriendo
que la unión del sustrato a la bolsa alostérica resulta en la desolvación de la fracción de CH2F y prepara el sustrato para la unión al sitio activo. El
carboxilato de D134 fue predicho por PDB 2PQR (versión 2.0)22 para tener una pKa entre 5,74 (apo) y 7,34 (un sustrato unido). (C) Ilustración
del ligando libre y ligado alostéricamente que muestra la desolación del fluorine al unirse al sitio alostérico.

confirm la pose del sustrato, y al mismo tiempo identificar un ■ DISCUSIÓN

enlace de hidrógeno entre el átomo fluorine del sustrato y la
cadena lateral D134, como se ilustra en la Figura 7B. Mientras
que el promedio de pKa de la cadena lateral del ácido aspártico
en las proteínas plegadas es de 3,5,21, la pKa de D134 en el
estado apo de FAcD se estima en 5,74 y 7,34 en el intermedio
de Michaelis-Menten. 22 Así pues, en condiciones fisiológicas,
se esperaría que D134 adoptara transitoriamente un estado de
protonación, permitiendo así la unión del hidrógeno al FAc.
Una vez que el sustrato se deposita entonces en el sitio activo,
el aspartato sería effectively cebado para que el hidrógeno se
enlace con el agua, contribuyendo así al proceso de
desolvación. Así pues, la unión a la bolsa alostérica
probablemente implica un paso de desolvación que es clave para
preparar el sustrato para su liberación en el sitio activo y
desencadenar una respuesta alostérica del interprotómero.
J DOI: 10.1021/jacs.9b03703
Reacción de la mitad de los sitios. En este estudio,
el uso
hemosdel hecho
mutante Y219F del FAcD, que reduce la tasa
catalítica hasta tal punto que se puede supervisar el progreso
por
de lacristalografía
reacción de congelación. En altas concentraciones de
sustrato se produjo una estructura identified en la que dos
moléculas de sustrato ocupaban un protomero a lo largo de un
canal que conectaba la superficie de la proteína con el sitio
activo, lo que nos llevó a considerar la cuestión de la
inhibición en el dímero. Curiosamente, incluso en
condiciones en las que la concentración de sustrato es muy
excesiva, sólo un protomero está involucrado en la unión del
sustrato mientras que el segundo permanece vacío, lo que es
coherente con la reactividad de la mitad de los sitios. La unión
del sustrato a uno de los dos protomeros del homodímero
desencadena una respuesta alostérica en la que el dominio de la
tapa reguladora del protomero vacío se cierra, bloqueando el
acceso al sustrato. Estudios previos de cristalografía de rayos X
mostraron que el protomero vacío J. Am. Química. Soc. XXXX, XXX, XXX-XXX
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posteriormente se vuelve más dinámico ya que los factores B en
las regiones distales clave del protomero vacío se incrementan
mientras que
∼30 moléculas de agua unidas en el mismo protomero son
desalojadas simultáneamente. 17 Si bien esa respuesta tendría
ventajas entrópicas clave en cuanto a estimular la reacción
hacia adelante, esto también plantea la cuestión del papel de la
dinámica en la catálisis,
19F
ya que los movimientos del protomero
vacío
De estánela anterior
hecho, su vez RMN
vinculados alostéricamente a los del
Carr-Purcell-Meiboom-Gill
protomeroexperimentos
(CPMG) unido al sustrato.
de dispersión de relajación identified a
750proceso de intercambio conformacional interprotómero en
Hz
la apoenzima, que aumentó en frecuencia en un factor de casi
17
6 al unirse el sustrato. A pesar del aumento de la dinámica del
interprotómero, y el mayor desorden asociado al protomero
vacío, el dominio de la tapa effectively excluye la unión del
sustrato al protomero vacío. Esto se puede ver examinando la
conformación del dominio de la tapa en la serie de enfriamiento
por congelación. Aquí, una vez que un sustrato se une a un
protomero, se puede discernir un estado claramente más
cerrado en el otro protomero vacío. Las simulaciones MD
también revelan una atenuación pronunciada en la dinámica de
los dominios del casquete asociada con el protomero vacío, al
unirse el sustrato.
La unión del segundo sustrato restringe la dinámica
de las proteínas...
ics. Mientras que la unión del sustrato aumenta la dinámica y
el desorden del interprotómero en el protomero vacío, la
adición de un segundo sustrato al mismo protomero tiene el
efecto contrario effect. La cristalografía de rayos X revela que
la unión del segundo sustrato da lugar a cambios estructurales
únicos en el dominio de la tapa y en la vecindad de la hélice 6
(es decir, los residuos 250-260 y 146-160), que se convierten
en más defined en términos de densidad de electrones. Las
distribuciones del factor B obtenidas a partir de la serie de
estructuras empapadas de Y219F muestran una reducción de la
dinámica local, en comparación con las distribuciones del
factor B observadas anteriormente con el mutante D110N
(intermedio de Michaelis-Menten), donde sólo un sustrato está
unido. Las limitaciones estéricas adicionales impuestas por la
unión del segundo sustrato también muestran claramente la
dinámica general influence. Estos resultados se reflejan en el
RMN 19F. Como se muestra en la Figura 4, observamos una
prominente resonancia de RMN 19F asociada a W156 al
saturarse el sitio activo con el sustrato (ClAc o IAc). En este
caso, hacemos uso de WT-FAcD, donde la tasa catalítica es
sufficiently lenta para los sustratos anteriores, que las
respuestas espectrales se pueden registrar sin una gran
acumulación de producto de haluros. El desplazamiento
downfield que se observa en la figura 4 también va
acompañado de un ensanchamiento de la línea significant que
puede atribuirse al intercambio interprotomador, y que puede
observarse en las dispersiones de relajación de la CPMG de la
RMN 19F. 17 A medida que se añade más sustrato en un punto en el
que esperamos que se produzca una segunda unión de
sustratos, la tendencia del cambio químico downfield invierte
ahora su dirección y la ampliación del intercambio disminuye,
lo que indica una atenuación de la dinámica de intercambio
conformacional.
La unión de la segunda molécula de sustrato resulta
K DOI: 10.1021/jacs.9b03703
en la inhibición alostérica. Basándonos en la estructura
cristalina del mutante Y219F que muestra dos sustratos unidos,
proponemos que la unión por un segundo sustrato en un sitio
Artículo
En este caso, la velocidad de reacción inicial observada, V,
viene dada por7
[S]2
k 2[S] + k
4 Ki
V
[E0]=
Km + [S]k1KiKi
+ [S]
2
(1)
donde [E0] representa la concentración total de la enzima, S-E
signifies un complejo alostérico en el que el sustrato no está en
la bolsa del sitio activo, E-S es el intermedio de Michaelis, k2
y k4 son las constantes de la tasa de producto, Km es la
constante de Michaelis, y Ki (=1/KN) es la constante de
equilibrio de inhibición. Como se discute más adelante, tenemos
la hipótesis de que la bolsa alostérica sirve como un sitio de
desolvación en ruta y sólo da lugar a la inhibición en
concentraciones muy altas de sustrato. Effectively, la S-E
también puede establecerse a partir de la E, con lo cual la E-S se
establece después de la desolvación o el sustrato se desprende
de la enzima que da la E+S. En el escenario actual, podríamos
esperar que parte de la inhibición observada pueda surgir
simplemente de una tasa reducida de escape del producto del
sitio activo debido a la obstrucción por el sustrato en el canal.
Sin embargo, las mediciones de RMN en 19F de la unión del FAc
a la construcción del H280N en la que el sitio activo está
ocupado permanentemente por un intermediario covalente
revelan que la constante de disociación, kd2, para la unión del
segundo sitio es del orden de 2,2 ± 0,83 mM. Por lo tanto, la
tasa esperada de off sería órdenes de magnitud más rápida que
la tasa catalítica, que para el Y219F es del orden de min-1. Esto
nos deja con la posibilidad de que la inhibición se establezca
exclusivamente por una respuesta alostérica a la unión del
segundo sustrato que implique cambios tanto
conformacionales como dinámicos. Obsérvese que, a
diferencia de las enzimas como la fosfofructoquinasa y la
acetilcolinesterasa, que se inhiben completamente a altas
concentraciones de sustrato23,24 , la curva de la tasa de FAcD no
cae a cero en el rango de concentraciones de sustrato
explorado. La alta tasa off del segundo sustrato bien puede ser
un factor que contribuya a la débil inhibición observada, ya que
la tasa catalítica se recuperaría entonces durante los períodos
en que sólo la
compensar haypérdida
presencia de E-S.experimentada por el
entrópica
Estudios
debido
protomero previos
unión del sustrato que
a lafirst revelaron y a laelinteracción
protomero del
vacío es una
parte
en el crucial
muestreo de
interprotector... dela maquinaria
los estados catalítica
funcionales de la enzima
posteriores ya que
necesarios
ayudafacilitar
para a la catálisis. En este estudio, observamos que
stiffening por la segunda unión al sustrato y la consiguiente
atenuación de la dinámica y la alosteria interprotomer, dan
lugar a una reducción de la catálisis y, por tanto, a la inhibición
del sustrato. El análisis computacional del mutante Y219F
FAcD indica una vía alostérica, que se muestra en la figura 6A,
que atraviesa los residuos 124-165 y abarca la bolsa alostérica.
Las limitaciones estructurales adicionales y los enlaces de
hidrógeno impuestos por la unión del segundo sitio aumentan
claramente los requisitos de energía para la transmisión de los
grados de libertad y la alosteria interprotómera, lo que agrava
el inhibidor effect como se muestra en la Figura 6B. Incluso
pequeños cambios en el número de hidrógeno
J. Am. Química. Soc. XXXX, XXX, XXX-XXX
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los bonos pueden tener grandes effects sobre los requisitos de
energía para la transmisión en FAcD. Obsérvese que la effect de
la mutación K152I da lugar a un aumento del intercambio
conformacional asociado a la proteína libre de sustrato, según
se juzga por la RMN 19F (Figura 5C,D). Sin embargo, la
adición de sustrato atenúa en gran medida este proceso de
intercambio, lo que da lugar a una firma más inactiva, como la
de W156 y W185, que están en el sitio activo. Esta noción de
"stiffening" de la enzima K152I al añadirle sustrato está
respaldada por las predicciones sobre la intensidad de la
transmisión alostérica (Figura 6B).
Sorprendentemente, los resultados anteriores muestran que la
eliminación de la unión a la segunda bolsa por medio de la
mutación K152I da lugar a una situación en la que las firmas de
tipo activo en la bolsa catalítica se muestrean más fácilmente en
ausencia de sustrato, mientras que las firmas inactivas en la
bolsa catalítica surgen tras la adición de sustrato. Esto habla del
papel de esta lisina distal (K152) como conducto alostérico y,
más en general, de las exquisitas redes alostéricas intra e
interprotómicas dentro de la enzima que facilitan la toma de
muestras de los estados funcionales clave y la catálisis. Papel
de la bolsa alostérica en la catálisis. La inhibición del
sustrato es un fenómeno que se observa en muchas enzimas a
través de una amplia gama de mecanismos. 7,23,25,26
Aquí conformación
mostramos para una enzima homodimérica que actúa a través
de la reactividad de la mitad de los sitios, que la catálisis se
ralentiza en la unión del segundo sitio debido principalmente a
la comunicación alostérica restringida entre los protomeros.
Esto fue quantified por la teoría de la rigidez que identified
Y141 y K152 como centros alostéricos interprotómeros clave
mientras que también sirven para unir un segundo sustrato.
Sorprendentemente, la mutación de uno de esos residuos
(K152I) dio lugar no sólo a la ausencia de unión de un segundo
sitio y de cualquier inhibidor effects sino también a una
disminución del Vmax en más de un orden de magnitud. Esto
sugiere que la bolsa alostérica también puede desempeñar un
papel en la mejora de la catálisis en concentraciones de
sustrato más bajas, en las que se prevé que sólo un sustrato
participe en la catálisis. 19F NMR de fluoroacetate identified un
fuerte enlace de hidrógeno al átomo fluorine en un disolvente
orgánico con bajas concentraciones de agua residual. El agua
debería servir como un donante de enlace de hidrógeno
igualmente aceptable en las condiciones acuosas de acción
enzimática. Sin embargo, los estudios de acoplamiento sugieren
que el FAc se desuelve en la bolsa alostérica, lo que daría lugar
a una transferencia más efficient al sitio activo. Así pues, la
reducción de la catálisis que se observa en el mutante K152I a
bajas concentraciones probablemente perjudica la unión del
sustrato a la bolsa exterior y, por consiguiente, el paso de
desolvación necesario para establecer el intermediario y la
catálisis de Michaelis-Menten. Lo más importante es que, al
transferir el sustrato de la bolsa alostérica al sitio activo, se
prevé que el K152 y los residuos en sus proximidades
desempeñen un papel clave en el interprotómero alostérico
transmisión y dinámica.
Conexión entre la dinámica del interprotómero y la
catálisis. Los desplazamientos químicos de la RMN 19F y los
correspondientes anchos de línea son excelentes informadores
del complejo equilibrio conformacional asociado con el FAcD
y los cambios que se producen al unirse al sustrato o al
análogo del sustrato. Briefly, las sutiles asimetrías asociadas con
los conformadores de las cadenas laterales de las nueve
-118,4, -117,3 ppm), con la salvedad de que esto está provocando,rigidez
cadenas laterales de triptófano en la apoenzima, previamente
detectadas por cristalografía de rayos X, se promedian
completamente a través del intercambio en la escala de tiempo L
de milisegundos. Sin embargo, las mediciones de CPMG de
RMN 19F permiten el estudio de este proceso de intercambio
interprotómero. Nuestras principales conclusiones de la RMN
Artículo
entre dos protomeros en un rápido intercambio. (2) En
condiciones apo- radas, el W156 adopta un solo estado, que
por sí solo representa un promedio entre dos protomers
conformes. La adición del análogo de sustrato BrAc cambia el
equilibrio hacia un intermedio de Michaelis-Menten (-118,4
ppm) aunque con la ampliación de significant debido sólo en
parte a la baja affinity del análogo de sustrato. Sin embargo, un
exceso de significant de BrAc normalmente se esperaría que
invirtiera el effects de intercambio del sustrato de BrAc y
desplazara el equilibrio hacia el intermedio de Michaelis-
Menten. Por lo tanto, la ampliación de la línea que vemos en
las concentraciones de saturación debe deberse a la dinámica
de las proteínas establecida en el intermediario Michaelis-
Menten. Por el contrario, el glicolato, que tiene un affinity
similar a la proteína como BrAc, da lugar a un ensanchamiento
de la línea de intercambio hasta que se alcanzan las
concentraciones de saturación, con lo que se establece el
conformador de producto. (3) La adición de sustratos da
como resultado un pico amplio similar al del análogo de
sustrato, lo que sugiere que tanto el sustrato como el análogo
de sustrato inician la cadena lateral significant y la dinámica de
la proteína en las concentraciones de saturación. A medida que
se agrega ella sustrato,
Sin embargo, el distintiva
característica protomero ligado
de los sustratosadoptaes queuna
asociada con el intermediario
el exceso bruto de sustrato donde observamos el sustrato de Michaelis-
Menten,
La aunque
inhibición se muestra
y la unión simultáneaque
de dos el sustratos
intercambio entre
en realidad
protomeros
reduce aumentadesustancialmente.
la dinámica la cadena lateral y cambia el equilibrio
hacia el del conformador sin sustrato.
Examinando las orientaciones de la cadena lateral de W156
en la estructura cristalina FacD sin sustrato, observamos que
uno de los dos protomeros está preparado para la unión del
sustrato. La estructura cristalina del intermediario de
Michaelis-Menten muestra que W156 en el protomero vacío
está cerca en orientación a la del intermediario covalente, lo
que sugiere que a través del intercambio de protomeros, la
conformación del intermediario covalente es muestreada en el
sitio activo (protomero ligado). Si comparamos el
ensanchamiento de la línea de W156 y W185 con las medidas
de la tasa catalítica de la ClAc, observamos que hay una
correspondencia directa entre el ensanchamiento de la línea y la
tasa catalítica. En conjunto, el
Los datos de RMN 19F y la cristalografía revelan un rango de
estados funcionales e intercambio interprotomático que
facilita el intercambio entre los estados funcionales en el sitio
activo del protomero vinculado. La dinámica juega un papel
en cada paso de la ruta de reacción: (1) es probable que
La dinámica
ocurra una de la tapa reguladora
dinámica rápida enpreserva la reactividad
el protomero vacíode para
la
compensar
mitad entropicalmente la unión del sustrato, (2) la
de los sitios.
■ CONCLUSIONES
dinámic a cooperativaYconectaOBSERVACIONES
los estadosFINALES funcionales,
yEn(3)este estudio, exploramos las facetas mecanicistas de la
inhibición del sustrato y la alosteria interprotomer asociada a
una enzima homodimérica que se somete a la mitad de la
reactividad de los sitios. A concentraciones muy altas de sustrato,
un segundo sustrato se une a lo largo del canal que conduce al
sitio activo en el protomero unido al sustrato. El análisis
espectroscópico muestra una disminución de la actividad
catalítica de la enzima en presencia de altas concentraciones de
sustrato, lo que coincide con una reducción de la dinámica del
interprotómero. El análisis de transmisión alostérica basado en
la rigidez apunta a una red alostérica, que se alinea bien con las
regiones de los espectros NH-HSQC que exhiben cambios de
cambio químico por la adición de sustrato. La unión del
sustrato al sitio activo se muestra mediante el análisis de la
para mejorar
en promedio, la transmisión
el cierre de una región alostérica y, por lo tanto,
de tope regulatorio en ella
dinámica,
DOI: 10.1021/jacs.9b03703
J. Am. Química. Soc. XXXX, XXX, XXX-XXX
Revista de la Sociedad Química Americana
protomero vacío. La adición de un segundo sustrato se muestra
mediante RMN 19F y análisis de rigidez para amortiguar estas
dinámicas. Finalmente, el análisis de la cinética de las enzimas
en el mutante K152I, que impide la unión al segundo sitio y la
inhibición del sustrato, muestra una dramática pérdida en la
tasa catalítica máxima. Por lo tanto, suponemos que la bolsa de
unión al sustrato alostérico es crucial para la catálisis en
concentraciones de sustrato más bajas, en las que sólo un único
sustrato se compromete con la enzima a la vez. Nuestros
estudios sugieren que mientras que el átomo fluorine se
estabiliza por las aguas de hidratación en la fase de masa, la
unión a la bolsa alostérica sirve para desolver el sustrato, con
lo que se deposita en el sitio activo. A medida que la bolsa
alostérica pasa entonces el sustrato de off al sitio activo,
reanuda su función como centro alostérico en la activación de la
dinámica de los interprotómeros y, en consecuencia, la catálisis.
Así pues, la "bolsa alostérica" es probablemente un sitio de
desolvación en ruta y sólo da lugar a la inhibición a
concentraciones muy altas de sustrato. Observamos que este
conducto alostérico interprotómero sólo se establece
plenamente una vez que el sustrato desolvado se coloca en el
sitio activo y la bolsa alostérica está vacía. La mayoría de las
enzimas son oligoméricas. De hecho, el 20% de todos los
homodímeros actúan a través de la reactividad de la mitad de
los sitios, lo que conecta con la idea general del
interprotómero alos- terio. 12,27-29 En muchos casos, la
reactividad de la mitad de los sitios es un mecanismo
conveniente mediante el cual el sitio activo alterna de un
protomero a otro
desencadenada pory,la al hacerlo,
unión del sincroniza la progresión de los
eventos
sustrato. químicos de varios pasos.
13,14,16
En este estudio,
podemos
■ MÉTODOS apreciar ahora un papel para el protomero vacío en la
catálisis y en la respuesta alostérica que es exquisitamente
Expresión y Purification de FAcD. FAcD de Rhodop-
seudomonas palustris se expresó en las células de Escherichia coli
y purified como se publicó en otra parte. 17,30 Para los experimentos de
BL21(DE3)
RMN, las células se cultivaron a 37 °C y se indujeron con 1 mM de
isopropilo β-D-1- tiogalactopiranósido (IPTG) a un OD600 de 1,0-
1,2 y se dejaron para que se expresaran durante la noche. Típicamente,
se añadió 1 g de glifosato por litro de medio M9 para detener la
síntesis aromática. Treinta minutos más tarde, se añadieron al medio
IPTG (0,24 g), tirosina (0,075 g), 5-fluoro DL triptófano (0,070 g)
y fenilalanina (0,075 g). Las células de E. coli fueron peletizadas y el
lisado libre de células fue extraído por sonicación. El lisado fue cargado
en una columna de Ni-affinity, lavado con 50 mM Tris- H2SO4 pH
8.5, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 30 mM imidazol y eluido con el
mismo buffer pero con la concentración de imidazol aumentada a 300
mM. La división del His6-tag se realizó a temperatura ambiente
durante la noche utilizando la proteasa TEV. El FAcD fue además
purified por cromatografía de exclusión de tamaño (columna S200
16/60 HiTrap) usando 50 mM de Tris-H2SO4, pH 8.5, 150 mM de
NaCl como buffer. Para el almacenamiento, purified FAcD fue buffer-
cambiado en 50 mM Tris-H2SO4, pH 8.5 por varias rondas para
eliminar cualquier NaCl restante y luego flash-congelado en nitrógeno
líquido.
Cristalización del FAcD. Se cultivaron cristales individuales de
apo-FAcD en una gota colgante de vapor diffusion establecida usando
una relación 1:1 (v:v) de 0,5 mM de solución de FAcD y una solución
de reserva de 18-20% de PEG3350, 200 mM de CaCl2, y 100 mM de
Tris-HCl de pH 8,5. Los cristales que van desde ∼200 a 500 μm de
longitud crecieron después de 3-5 días. Para recopilar los datos de
diffraction para los complejos FAc y ClAc del Y219F FAcD, los
cristales se empaparon en el licor madre artificial en presencia de 100
mM o fluoroacetate o de cloroacetato durante 2 h. Como los cristales
del FAcD son catalíticamente activos, el complejo de glicolato del
mutante Y219F se obtuvo empapando los cristales en un licor madre
que contenía 100 mM FAc o ClAc y dejándolos incubar durante un
mínimo
Detectorde 24 h antes
Saturno A200deo la
enrecopilación
un ánodo de de datos.
cobre
giratorio Rigaku 007 con el resultado
Diffraction Recopilación de datos. La recolección de datos se
realizó a 100 K ya sea en un ánodo giratorio Rigaku FR-E con óptica M
de espejo y
Artículo
ópticas de espejo y un detector Mar345. Los cristales fueron flash-
congelados en nitrógeno líquido usando paratona N (Hampton
Research, Aliso Viejo, CA, USA) como crioprotector.
Procesamiento de datos de rayos X y Refinement. Los
datos de Diffraction fueron indexados, integrados y escalados
utilizando el paquete de software XDS. 31
Las fases fueron calculadas usando el módulo de reemplazo
molecular del paquete Phaser32 con FAcD de tipo salvaje (PDB ID:
3R3U) como un
modelo de búsqueda. La construcción del modelo y las rondas de
first de refinement fueron
realizado con Wincoot. 33 Las moléculas de agua recogidas
automáticamente se guardaron para su posterior refinement cuando
estaban a menos de 2,3-3,5 Å de un aceptador o donante de hidrógeno
y la densidad electrónica correspondiente era de al menos 1,5 e/Å3.
En rondas posteriores de refinement se utilizó la opción Phenix.refine
del conjunto de programas informáticos Phenix. 34 Los detalles de las
estadísticas cristalográficas y los parámetros de la estructura
refinement se presentan en el cuadro S1.
Espectroscopia de RMN. Los datos cinéticos de las enzimas
se recogieron adquiriendo espectros de RMN de 19F o 1H para "tiempo
real" quantification
de las concentraciones de sustrato (es decir, FAc o ClAc,
respectivamente) y de producto (fluoride ion o glicolato) en función
del tiempo a 25 °C. Para la cinética
análisis, las concentraciones de proteínas fueron típicamente 75 μM
usando 500 mM
Tris-H2SO4, pH 8.5 como buffer. A estas concentraciones, sólo se
necesitaron 16 escaneos, abarcando 32 s por punto de tiempo. Los
espectros de RMN recogidos fueron analizados con MestReNova
(Mestrelab Research S.L., 11.0.4) y los datos cinéticos de las enzimas
fueron fitted con un modelo de inhibición de sustratos utilizando
Prism 6 (GraphPad Software).
Se adquirieron espectros de RMN 19F de 5-fluorotryptophan
enriquecidos con FAcD con 1600 transitorios y un ancho espectral de
22 000 Hz. El
Los espectros de RMN de 19F fueron procesados y analizados con
MestReNova.
Los espectros 15N,1H HSQC se adquirieron típicamente usando 80
incrementos, 25
transitorios, y un ancho espectral de 2340 Hz en la dimensión
indirecta. Los espectros del HSQC fueron procesados con el software
NMRPipe y NMRviewJ. Todos los espectros de RMN se obtuvieron
en un espectrómetro Varian Inova de 600 MHz (Agilent technologies,
Santa Clara, EE.UU.) equipado con una sonda criogénica capaz de
sintonizar HCN o 19F. Las anchuras de pulso de 1H, 15N y 19F π/2 fueron
10,8, 44 y 15 μs.
Las isotermas de unión a las enzimas se obtuvieron adquiriendo
una serie de
Espectros de RMN 19F en función de la concentración de
fluoroacetate, en presencia de la enzima. Las concentraciones de
proteínas fueron de 100-300 μM usando 500 mM de Tris-H2SO4, pH
8,5 como buffer. Se realizaron 512 escaneos para cada punto de
titulación a 30 °C. Se utilizó el sodio fluoride como estándar externo
en D2O para referenciar los cambios de desplazamiento químico. Los
espectros de RMN recogidos fueron analizados con MestReNova
(Mestrelab Research S.L., 11.0.4) y las curvas de unión de las
enzimas fueron fitted con un modelo de unión de dos sitios usando
Prism 6 (GraphPad Software) para obtener una constante de
disociación. El H280N-FAcD fue first saturado con exceso de ClAc
durante la noche a temperatura ambiente para asegurar que todos los
sitios activos estuvieran covalentemente ocupados. Se realizó una
diálisis posterior para expulsar el Cl- libre y el ClAc no reaccionado
antes de que se realizaran los experimentos de unión con el FAc.
La unión del hidrógeno con el fluoracetato se estudió
monitorizando el desplazamiento químico de la RMN de 19F del FAc
en función de la concentración del
aceptador de enlace de hidrógeno, acetofenona, en CCl4,
utilizando una referencia externa (trifluoro-tolueno). CCl4 contiene
trazas dedeH2O
células de simulación con 2, 14, 50 y 100 moléculas de FAc
que serviría como donante de bonos de hidrógeno y acetofenona
competiría entonces con -CH2F por estas aguasDOI:de10.1021/jacs.9b03703
hidratación. La
acetofenona se tituló (en 5 mM FAc) deJ.25 Am.aQuímica.
400 mM. El XXX,
Soc. XXXX, cambio en
XXX-XXX
el desplazamiento químico del FAc en referencia a trifluoro- tolueno
se graficó contra la creciente concentración de acetofenona, como se
describe en otra parte. 20,35
Revista de la Sociedad Química Americana
(incluido el sustrato ligado al FAcD). La célula de simulación del
dodecaedro rómbico final consistí a en el dímero de la
proteína,
∼28 000 moléculas de agua, 136 Na+, y el número necesario de Cl-
para neutralizar la célula del sistema. La proteína fue modelada con
el
amber99sb-ildn force field37 con agua TIP3P38. Compatible con
AMBAR
Los parámetros para fluoroacetate se generaron utilizando el
protocolo de parametrización acpype/ Antechamber39,40 que dio
como resultado las siguientes cargas parciales; CT 0.116700, C
0.877602 , O2-0.835501, F
−0.304700, H1 −0.009300.
Todas las simulaciones de minimización, equilibrio y producción se
realizaron utilizando el sistema GROMACS 4.6.541, en el que toda la
dinámica molecular se llevó a cabo con un paso de tiempo de 2 fs. Cada
sistema se sometió a 2000 pasos de minimización de la energía de
descenso más pronunciado para eliminar los contactos de energía
desfavorables. El equilibrio se realizó en dos bloques sucesivos de
simulación de longitud 5 ns en los conjuntos estadísticos NVT y
NPT, donde la proteína y los átomos pesados FAc fueron restringidos
con una constante de fuerza de 1000 y 500 kJ mol-1 nm-1,
respectivamente. Para las simulaciones de producción, se
construyeron five repeticiones de simulación separadas para el sistema
"2 FAc", y diez repeticiones de simulación separadas para todos los
demás sistemas ("14 FAc", "50 FAc" y "100 FAc"), con velocidades
iniciales aleatorias de todos los átomos a una temperatura de 300 K.
La posición del FAc en la solución también se aleatorizó para cada
repetición de simulación. Estas simulaciones se realizaron en el
conjunto del NPT a una temperatura de 300 K con el termostato
Nose-H́ oover,43 (frecuencia de colisión de 0,5 ps-1) y a una presión de 1
atm con el barostato Parrinello-Rahman44 (constante de
acoplamiento de 2 ps). Las interacciones entre Lennard-Jones se
evaluaron utilizando un grupo basado en cutoff para distancias de
separación de 1,2 nm. Las interacciones de Coulomb fueron
calculadas usando el método Ewald de malla de partículas lisas45,46
con un espacio real cutoff de 1,2 nm y un espaciamiento de cuadrícula
de Fourier de 0,16 nm. La lista de pares no vinculados se actualizó
cada 10 fs. Todos los enlaces covalentes fueron restringidos con
SETTLE47 y P-LINCS48 para el agua y otras moléculas,
respectivamente. Cada repetición de la simulación fue ejecutada para
1000 ns, para un total agregado de 35 μs. Todos los datos de
producción anteriores a 50 ns fueron descartados de cada réplica para
tener en cuenta el equilibrio.
Para el análisis de los datos, todos los dímeros se separaron en
monómeros y los datos de todos los estados de ocupación de los
monómeros se unieron y
submuestreadas en un intervalo de tiempo de 1 ns. La ocupación del
sitio de unión del monómero se determinó calculando la distancia
media de cada
FAc molécula de átomo C al átomo C-α de varios aminoácidos que
se alinean
el bolsillo de encuadernación (defined como residuos 114, 110,
135, 136, 141 y 156). La ocupación activa del sitio fue defined con
una distancia media por debajo de cutoff de 1,2 nm, defined sobre la
base de los mínimos de first en la función de distribución radial. Para
el cálculo de las desviaciones de la raíz media cuadrada fluctuations y
de la raíz media cuadrada, los monómeros se alinearon en first a una
estructura de referencia determinada a partir de la cristalografía de
rayos X utilizando todos los átomos de C-α superiores al residuo 7.
Las fluctuaciones se midieron después de alinear la estructura al
monómero desocupado del modelo estructural original (originalmente
derivado de la estructura Y219F). Posteriormente se hicieron cálculos
de la desviación cuadrática media de la raíz con respecto al
monómero desocupado, así como al monómero ligado a "dos
sustratos", utilizando todos los átomos C-alfa del dominio de la capa
(residuos 250 a 259). El análisis se realizó utilizando MDTraj49 y
todas las representaciones moleculares de las estructuras gráficas de
los cristales y las instantáneas MD de la figura 2 se generaron
utilizando VMD. 50 La representación molecular en el panel 2A se
generó utilizando la estructura cristalina de la estructura de cristal de
coco D110N/FAc (PDB: 5SWN) donde se modeló un único residuo N
faltante en el dominio de la tapa (cadena A, A257), se minimizó la
energía y se simuló briefly utilizando el protocolo de preparación de
la proteína en el software Schrödinger Maestro 11.6.013. 51,52
Predicción computacional de las vías alostéricas.
Artículo
partes (distantes) de la estructura de la proteína. 17 En este trabajo,
analizamos cómo la perturbación de la rigidez del sitio catalítico se
transmite al segundo protomero tanto en presencia como en ausencia
de una mutación crítica (K152I) que se encuentra en la bolsa
alostérica.
Comenzando con una estructura de cristal de rayos X, FIRST
genera una red de restricciones, donde la proteína es modelada en
términos de nodos (átomos) y borde s (es decir, restricciones que
representan enlaces covalentes ,
enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, y con- tactos
hidrofóbicos). Los enlaces de hidrógeno se clasifican en términos de
fuerza general usando
el potencial de modified Mayo57 , con lo cual un enlace de hidrógeno
cutoff valor energético es seleccionado de tal manera que todos los
enlaces más débiles que este cutoff son ignorados. PRIMERO aplica
el algoritmo del juego de guijarros,56 que rápidamente
descompone una red resultante en grupos rígidos y regiones
flexible, permitiendo una evaluación de los grados de libertad no
triviales (DOF) en toda la proteína. Después de generar los
resultados del guijarro
algoritmo de juego (PRIMERO) a un amplio rango de energía
cutoffs, aplicamos el algoritmo RTA para predecir si la perturbación
local de la rigidez en una
sitio catalítico (imitando la unión ligando/sustrato) se propaga a
través de la red de proteínas y lleva a un cambio en la rigidez y el
número de grados de libertad de conformación en las regiones del
otro
protomero, lo que resulta en la transmisión alostérica. De igual
manera, la presencia de alosteria basada en la rigidez significa que un
cambio en la forma
(conformación) en el sitio catalítico (es decir, cambiando
mecánicamente la forma como podría hacerlo la unión) llevaría a la
reorganización y cambio de la forma en partes del otro protomero.
Utilizando el algoritmo RTA,
La predicción de la respuesta alostérica para cada residuo en el
protomero vacío se calcula después de la perturbación de la rigidez del
catalizador
que nos permite obtener un mapa detallado de la red alostérica entre
los dos protomeros.
Usamos PRIMERO y el algoritmo del juego de guijarros para
calcular los grados de libertad conformacional de todas las ventanas
pequeñas que consisten en
tres residuos consecutivos en el protomero vacío, antes y después
de una perturbación de la rigidez del sitio catalítico. Los residuos en
el vacío
monómero que experimentan un cambio en los grados de libertad
internos (es decir, la propagación de la rigidez-transmisión de los
grados de libertad) al perturbar la rigidez del sitio catalítico forman la
vía alostérica
conectando los dos protomers. Los residuos de la figura 6A están
codificados por colores según la cantidad de transmisión de los grados
de libertad.
Cómputo de la alosteria de rigidez-transmisión (RTA). Los
átomos de hidrógeno faltantes fueron añadidos a las estructuras
cristalinas con el WHAT IF
servidor web (http://swift.cmbi.ru.nl/servers/html/htopo.html).
Por cada energía de enlace de hidrógeno cutoff, a partir de 0 kcal/mol
(el cutoff
se reduce en incrementos de 0,01 kcal/mol), el método FIRST
(como se ha descrito anteriormente) se realizó para generar la salida
de la predicción de la rigidez y el algoritmo del juego de guijarros.
Calculamos el número de grados de libertad que pueden
ser
transmitido (retirado) de una ventana de 3 residuos consecutivos (r,
r
+ 2) en el monómero vacío como resultado de la perturbación de
la rigidez de la región de unión al sustrato (residuos 110, 111, 114,
141, 155, 156, 185 y 219). Comenzando por el extremo N-terminal
del protomero vacío, empezando por la ventana (1, 3), luego (2,4),
etc., continuando con el deslizamiento de la ventana de 3 residuos
consecutivos, calculamos la transmisión de grados de libertad para
cada ventana. La perturbación inicial de la rigidez se refiere a la
DOI: 10.1021/jacs.9b03703
J. Am. Química.
inserción de restricciones adicionales (bordes) Soc. XXXX, XXX,
(eliminación de XXX-XXX
grados
de libertad) en la región de unión del sustrato hasta su rigidification.
Cuando se produce la transmisión de los grados de libertad, se refiere a
cualquier cambio posterior en el número de grados de libertad en la
Revista de la Sociedad Química Americana
que puede ser transmitido de A a B (denotado como DOF_AB) fue
finally calculado obteniendo la cuenta DOF_AB = ADOF + BDOF -
ABDOF - 6. Se restó seis para descuidar los triviales seis grados de
libertad correspondientes a los movimientos rígidos del cuerpo.
Cuando DOF_AB era positivo, entonces los sitios A y B estaban
involucrados en la transmisión alostérica basada en la rigidez y el
máximo número de grados de libertad que puede ser transmitido de A
a B es DOF_AB. Esto proporcionó una medida quantifiable de la
comunicación alostérica entre A y B. Para observar la transmisión
alostérica para algunos residuos r, se generó una curva de transmisión
de grados de libertad trazando el promedio de DOF_AB para tres
ventanas consecutivas que contenían r (es decir, (r - 2, r), (r - 1, r +
1) y (r, r + 2)) en función de la energía cutoff. Calculamos la
intensidad de la transmisión alostérica para cada ventana de 3 residuos
consecutivos calculando el área bajo la curva de transmisión de
grados de libertad. La intensidad de la transmisión alostérica para el
residuo r se obtuvo calculando la intensidad media de las tres ventanas
consecutivas que contienen el residuo r (Figura 6A,B). La intensidad
de la transmisión alostérica tuvo en cuenta el número de grados de
libertad que pueden transmitirse, pero también la persistencia de la
transmisión en función de la fuerza de la energía.
Estudios de acoplamiento. Todos los experimentos descritos en
silico fueron realizados en el software Schrödinger Maestro 11.6.013
usando el Glide dentro del Small-Molecule Drug Discovery Suite
2018-4 (Schrödinger, LLC, New York, NY,2018). 51,52 Estos estudios
requirieron los siguientes programas dentro de la suite mencionada:
Epik, Optimized Potentials for Liquid Simulations 3e (OPLS3e)
force-field, Glide, LigPrep, y el Protein Preparation Wizard. Otros
programas utilizados incluyen ChemDraw Professional 17.1. Todas las
poses de los ligandos y las imágenes de la estructura de la proteína
fueron generadas con el Maestro 11.6. La estructura química de
fluoroacetate fue dibujada en Maestro 11.6.013 antes de someterse a
una preparación de ligandos workflow (LigPrep, Schrödinger, LLC,
New York, NY, 2018) usando el OPLS3eforce-field. Esto implicó la
ionización utilizando Epik para generar posibles estados de
protonación a un pH objetivo de 7,0 ± 2,0, desalinizando y
generando tautómeros (si es aplicable). El compuesto fue entonces
energéticamente minimizado y la estructura tridimensional resultante
utilizada para especificar los centros quirales. La pequeña molécula
preparada fluoroacetate fuepuntuación
examinada
clasificado en función de la decontra el FAcD, dentro de un
cubo de 10 ×(kcal
10 Å usando el acoplamiento de precisión estándar
acoplamiento mol-1).
(SP)
■ workflow. Se generaron las 30 mejores poses de unión y
CONTENIDO ASOCIADO
*Información de apoyo
La información de apoyo está disponible gratuitamente en el
sitio web de Publicaciones de la AEC en el DOI:
10.1021/jacs.9b03703.
Estadísticas de la recopilación y estructura de datos
cristalográficos refinement, mapa de densidad
electrónica 2Fo-Fc del sitio activo del Y219F en varios
puntos del ciclo catalítico, superposición de 15N,Espectros
de RMN de 1H de apo-WT-FAcD (negro) y apo-K152I
(rojo), isotermas de unión de RMN de 19F, glicolato del
producto unido al sitio activo en el mutante del Y219F
después de un remojo de 24 h, espectros de RMN de 19F
de FAcD enriquecido con 5F-Trp titulado con ligandos
different, 19F Cambios de desplazamiento químico de
RMN del W156 en función de la concentración de
ligandos para el FAcD D110N, espectros HSQC
15N,1H del FAcD en función de la concentración de
ClAc, análisis SPARTA+ de differences entre el Y219F
empapado y las estructuras de tipo silvestre, cálculos de
transmisión del grado de libertad para different regiones
de misión transitoria, representación molecular del
dominio de la tapa reguladora fluctuations de los
simulacros de dinámica molecular. (PDF)
■ INFORMACIÓN DEL AUTOR
Autores corresponsales
*scott.prosser@utoronto.ca
Artículo
*emil.pai@utoronto.ca
ORCID
Pedram Mehrabi: 0000-0003-3211-6959
Emil F. Pai: 0000-0002-1162-7242
R. Scott Prosser: 0000-0001-9351-178X
Contribuciones de los autores
▽These los autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
Contribuciones de los autores
Las
contribuciones de estos autores son de igual importancia.
Notas
Los autores declaran que no hay interés en financial.
■ RECONOCIMIENTOS
Agradecemos a A. Dong (Consorcio de Genómica
Estructural, Toronto) por su ayuda en la recogida de datos de
rayos X diffraction. También agradecemos a Yasir Raouf por su
ayuda en los estudios de acoplamiento. Este trabajo fue
apoyado por los Institutos Canadienses de Salud Programa de
Entrenamiento en Investigación en Plegamiento de Proteínas y
Dinámica de Interacción y una Beca de Graduados de Ontario
(T.H.K.), un premio del Fondo Fiduciario de Oportunidades
para Estudiantes de Ontario (P.M.), CREST/JST (A.S.), las
becas Discovery del Consejo de Investigaciones de Ciencias
Naturales e Ingeniería del Canadá 418679 (R.S.P.) y RGPIN-
2015-04877 (E.F.P.), la beca de los Institutos Canadienses de
Investigación sobre la Salud MOP-130461 (R.P.) y el
Programa de Cátedras de Investigación del Canadá (E.F.P.).
Los cálculos de dinámica molecular se realizaron en la
supercomputadora GPC en el SciNet HPC Consortium.
SciNet está financiado por la Fundación Canadiense para la
Innovación bajo los auspicios de Compute Canada, el
Gobierno de Ontario, el Fondo de Investigación de Ontario -
Excelencia en la Investigación y la Universidad de Toronto.
Las coordenadas y los factores de estructura se han
depositado en el Banco de Datos de Proteínas con los números
de adhesión 6QKS, 6QKW, 6QKT y 6QKU para la apo-forma
■
del REFERENCIAS
mutante Y219F del FAcD, el complejo Y219F-FAc, el
complejo
(1)Tawfik, Y219F-glicolato
D. S. Accuracy-Rate y Tradeoffs:
el complejo
¿Cómo Y219F-ClAc,
cumplen las
respectivamente.
enzimas con las demandas de selectividad y eficiencia catalítica? Curr.
Opinión. Chem. Biol. 2014, 21, 73-80.
(2)Eisenmesser, E. Z.; Millet, O.; Labeikovsky, W.; Korzhnev, D. M.;
Wolf-Watz, M.; Bosco, D. A.; Skalicky, J. J.; Kay, L. E.; Kern, D. La
dinámica intrínseca de una enzima subyace a la catálisis. Nature 2005,
438 (7064), 117−121.
(3)Boehr, D. D.; Dyson, H. J.; Wright, P. E. Una perspectiva de RMN
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