TRANSFORMACIÓN

Fred Griffith 1928, sus estudios los realizó en

Streptococcus pneumoniae

Conclusión: Las células R

“absorbieron” “algo” de las células S
“principio transformante”
El Principio transformante es DNA
 TRANSFORMACIÓN
CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA
INTRODUCCIÓN DE UN DNA EXÓGENO

Puede ser

NATURAL (se han encontrado

aproximadamente 40 especies
que pueden realizar este
proceso)

ARTIFICIAL (INDUCIDA)
 TRANSFORMACIÓN
¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias
proteícas intervienen en el proceso de transformación
Algunas hipótesis que no son excluyentes…..

I. Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener

resistencia a antibióticos)

II. Para la reparación de DNA

III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono,

nitrógeno y fósforo
 SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS
TRANSFORMACIÓN vs CONJUGACIÓN

¿existe DNA libre en

todos los ambientes, es
estable?
TRANSFORMACIÓN NATURAL,
las bacterias más estudiadas son

GRAM + GRAM -
Streptococcus pneumoniae Neisseria gonorrhoeae
Bacillus subtilis Haemophilus influenzae

El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS

ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente

Unión
ETAPA 2: Procesamiento del DNA
Importe
Recombinación
Etapa 1: Desarrollo de un estado competente
¿Qué es una célula competente?
Estado fisiológico inducible

Factores que inducen el estado de competencia en la

transformación natural:
Limitación en los nutrientes
La transcripción de
Mitomicina C los genes com se
inducen durante el
Alta densidad celular estado de
Temperatura, pH competencia
Velocidad de transferencia: 90-100 nucleótidos/segundo a 30°C
La transcripción de los genes com se inducen
durante el estado de competencia
Transporte DNA en Gram + ANTES se debe formar el
pseudopili que atraviesa la
pared celular

1. Unión del DNA a la superficie por

interacción con proteínas (++) del
pseudopili
2. Unión a receptor: ComEA (no es
secuencia específica)
3. Fragmentar y degradar la cadena
que no se transporta
4. Se ha encontrado una
endonucleasa en membrana

ComEC: canal en la membrana

ComFA: unión a ATP
Transporte DNA en Gram + El pili debe cruzar la
membrana interna, el espacio
periplásmico y la membrana
externa

Se ha sugerido que el
reconocimiento es secuencia
específica: (5´GCCGTCTGAA-3´)
Pili tipo IV:
Sistema de secreción tipo II
Una vez que ingresó el DNA de cadena
sencilla ¿qué ocurre dentro de la célula?

¿DE MANERA NATURAL es fácil intercambiar plásmidos entre

bacterias por transformación?
¿es más fácil por conjugación?
 TRANSFORMACIÓN
ARTIFICIAL
El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli

Es una técnica fundamental en biología molecular:

clonación y generar organismos transgénicos
TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL
CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para

transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,
PLÁSMIDOS
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA:
OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
KANAMICINA

Escherichia coli Medio LB + KANAMICINA

 En la transformación artificial
¿cómo se induce el estado
competente de una bacteria?

1. Tratamiento químico
2. Electroporación
 Preparar células competentes de E. coli
E. coli

A= 0.6 – 0.8 a 600 nm

3 mL medio
Luria
Incubar toda la
noche a 37°C
 Preparar células competentes de E. coli
3 mL NaCl 5 mL CaCl2

5000 r.p.m. Resuspender Resuspender

5 min
4°C
CÉLULAS
COMPETENTES

2500 r.p.m 7
Incubar 20 min
min
LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE
TÉRMICO

42°C Inmediatamente en
1 hr hielo
70 s

Incubar a 37°C
con agitación
por 45 min

1 mL medio
SOC
 CÉLULAS COMPETENTES

PLÁSMIDO: DNA
EXÓGENO

Buffer TE, CaCl2 y

PLÁSMIDO
Al final de la transformación
Utilizaremos el plásmido pET-TEM

Sitio múltiple de
restricción
Gen que confiere resistencia
a kanamicina: kanamicina
fosfotransferasa

Origen de
replicación
Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:
La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas
generalmente codificadas por plásmidos.
La inactivación de los aminoglucósidos se hace por:
1.Adenilación de grupos hidroxilo.
2.Fosforilación de grupos hidroxilo.
3.Acetilación de grupos amino.
ENZIMA INACTIVADORA AMINOGLUCÓSIDO
INACTIVADO:
Gentamicina adeniltransferasa Gentamicinas, Sisomicina,
Kanamicinas, Tobramicina.
Gentamicina acetiltransferasa Netilmicina, Tobramicina,
Gentamicinas, Sisomicina.
Kanamicina acetiltransferasa Netilmicina, Amikacina,
Neomicina, Kanamicinas,
  Tobramicina, Gentamicinas,
Sisomicina.
Neomicina, Kanamicina Gentamicina A, Neomicina,
fosfotransferasa Kanamicina
MECANISMO PROPUESTO PARA LA ENTRADA
DE DNA EXÓGENO EN BACTERIAS
COMPETENTES DE E. coli

ANIMACIÓ
N
Células
Células
no
transformantes
transformantes

Medio Luiria + KANAMICINA

 ESQUEMA GENERAL
SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que
adquieran resistencia a un antibiótico

SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de

Lisis alcalina

SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un
gel de agarosa teñido con bromuro de etidio