ENZIMA

Sustrato Producto final

cofactores

- Cómo se ADP NAD+ NADP+ GS+

sintetizan

- Cómo cargan ATP NADH NADPH GSH

energía glicolisis
vía directa shunt pentosas
Energía Energía reductora
- Para qué meta Reducción Actividad
sirven bólica meta Hb antioxidante
Glicolisis vía directa
Vía de entrada: - Gal Gal-1P G1P
- Glu G6P
- Fru Fru-6P
- Man Man-6P
11 enzimas: 1 dehidrogenasa - 4 kinasas
Balance: Glu 2 piruvato o 2 lactato
2 NAD+ 2 NADH
2 ADP 2 ATP o 2 2,3-DPG
Glicolisis vía pentosas
Vía de entrada: - G6P
8 enzimas: 2 dehidrogenasas
Balance: G6P 2 F6P + GA3P o PRPP
2 NADP+ 2 NADPH
Gen Cromosoma Sub AA PM Estr. Expresión
Hx-I 10p11.21 I 100000 x1 GR +++
-II II 100000
-III III 100000 GR adultos
-IV IV 50000 Hígado,páncreas
GPI 19cen-q13 - 66000 x 2 = Universal
PFK-M 1cenq32 M 779 x 4 = Músculo,GR
-L 21q22.3 L Hígado , GR
-P 10 P Plaqueta,fibroblasto
ALD-A 16q22-24 A 363 39500 x 4 = GR,músculo
-B 9 B 363 Hígado,riñón,intestino
-C 17 C Tejidos nerviosos
TPI 12p13 - 248 53000 x 2 = Universal
G-3PD 12 - Universal
PGK-1 Xq13 1 417 45000 x 1 Células somáticas
-2 2 Espermatogénesis
DPGM 7q22-34 - 258 x1
PGM-B 10 B 253 x 1 GR,hígado,riñón
-M M 254 Músculo
Gen Cromosoma Sub AA PM Estr. Expresión
ENO- 1pter-36.13
-
-
PK-M 15q22 -10 M1 55000 x 4 = Músculo,cerebro
- 9 M2 530 60000 ±Universal
-L 1q21 - 1 L 543 Hígado
- 2 R1 574 63000 x 4 = Eritroblastos
R2 60000 x 4 = Eritrocitos
LDH-A 11 x4=
-B 12p12.1-.2
-C
G-6PD Xq28 - 1 - 515 59256 x 2-4
AK-1 9 1 194 21500 x 1 Citosol
-2 1 2 194 Membr.mitocondrial
-3 9 3 194 Matriz mitocondrial
P´5N-I I 28000 x 1 GR (exclusivo)
-II 17 II Deoxirribonucleotidasa
ADA 20 - 362 40638 x 1 Universal
GCS-H 6p12 x2=
-L
 Fosfofructokinasa
Tetrámero con  combinaciones de 3 subunidades

L 21q22.3 hígado (L4)

adipocitos (gluconeogénesis)
M 1cen q32 músculos (M4) liso y estriado
cerebro (glicolisis)
P 10 plaquetas
fibroblastos

Eritrocito: 5 isoenzimas
L 4 3 2 1 0
M 0 1 2 3 4
 PK - genética
Gen : PKM PKLR
Cromosoma: 15q22 1q21
Exones: 11 12

Salteo exon: 10 9 1 2
Subunidades: PK-M1 PK-M2 PK-L PK-R (L’)(L)
PM: 55000 60000 63000 57500
AA: 530 531 574

Isoenzima: PK-M1 PK-M2 PK-L PK-R1 PK-R2

(Tetrámero) (L’4) (L2L’2)
Expresión músculos uni hígado GR GR
cerebro versal
Subunidad
PK-R Dominio B
AA 160-262
PEP
Mn
K
Dominio A Dominio A
AA 85 - 159 AA 263-431

Dominio N
AA 1 - 84
N Dominio C
AA 432-574
www.pymol.org
CEFA 14
C
Tetrámero
PK-R

CEFA 14
www.pymol.org
 Isoenzimas PK en eritrón

Eritroblastos: 2 homotetrámeros - PK-M2

- PK-R

Reticulocitos
y GR jóvenes: 1 homotetrámero - PK-R1
(L’4)

GR adultos: 1 heterotetrámero - PK-R2

(L2L’2)
Enzimopatías eritrocitarias: generalidades
1) Diferente estructura:
- Monómeros: Hx - PGK - DPGM - AK
ADA - P5´N
- Homodímeros: GPI - TPI - (G-6PD)
- Homotetrámeros: ALD - G-6PD
- Heterotetrámeros: PFK - LDH (≠ gen)
PK (= gen)
2) Cambios postsintéticos:
(Mediados por proteínas codificadas por otros genes)
- Proteolisis PK
- Glicosilación
- Deaminación TPI en Asn 15 y 71
- Oxidación grupos sulfhidrilos
- etc. ¿Hx I – II – II – IV?
Enzimopatías eritrocitarias: generalidades
3) Actividad enzimática

0% 25% 50% (reserva) 100%

l l l l
homocigotas heterocigotas normales

4) Ensamble: coexistencia de monómeros normales (X)

y mutados (Y)
No ensamble X4 YYYY
Ensamble homotrópico X4 Y4
Ensamble heterotrópico X2Y2 X2Y2
Ensamble aleatorio X4 X3 Y X2Y2 XY3 Y4
(1 : 4 : 6 : 4 : 1)
Enzimopatías eritrocitarias: generalidades

5) Efectos sobre glucolisis a distancia

- PK:  2,3-DPG  frena G-6PD y 6PGD

- LDH:  NAD   actividad G-3PD
  G-3P y DHAP (1:20)
- GPI: G-6P F-6P
hiperhemólisis por
stress oxidante severo
Enzimopatías eritrocitarias: generalidades
6) Patogenia del cuadro clínico
-  ATP  2,3-DPG
- TPI - ¿  DHAP?  metabolizado por
-glicerofosfato dehidrogenasa
- adhesión de enzima a membrana (GR)
y microtúbulos (cerebro)
- PK -  ATP  2,3-DPG
-  síntesis NAD 
 actividad G-3PD  freno glicolisis
- P5´N -  CMP y UMP (x 5)
- daño membrana ()
- desplazamiento nucleótidos purínicos
-  shunt pentosas  GSH PRPP (=Pb)
- retroinhibición catabolismo ARN
Enzimopatías eritrocitarias: bases moleculares identificadas
Am J Hemat 1990/34/301-310

Casos Mis Alt. reg. No FS Del Ins Alt. TOTAL

no rel. sense promot. sense emp.
Hx 15 1 1 2
GPI > 40 12 12
PFK > 34 8 1 4 13
ALD 2 1 1
TPI > 25 4 1 5
PGK (Var.func.) 18 5 1 6
DPGM 1 1 1 2
PK > 300 33 3 3 2 2 4 47
G6PD 400000000 af. 71 1 5 1 78
AK 4 1 1
P5N > 42 -
ADA () 4 1 1
 Enzimopatías eritrocitarias: enfoque
1) Herencia
- Autosómica recesiva: la mayoría
- Autosómica dominante: -  actividad ADA
- ¿Enolasa?
- Ligada al cromosoma X: G-6PD – PGK

- Adquiridas: - GS-SG-R   riboflavina

- GSH-P   selenio – Fe
- P5´N  Pb
- Sindromes mielodisplásicos
Enzimopatías eritrocitarias: enfoque
2) Frecuencia
- G6PD Clases II - III
- PK - G6PD Clase I
- GPI - P5N
- TPI - PFK
- HK - PGK
- etc.
 Eritropatías eritrocitarias: enfoque
3) Cuadro clínico
a) Eritrocitario:
- Anemia hemolítica crónica no esferocítica
(AHCNE) + Hiperhemólisis neonatal
- Anemia hemolítica por stress oxidante
- infecciones bacterrianas, virales
- drogas + metabolitos
- habas (Vicia Faba) favismo
- ictericia neonatal
- Poliglobulia  2,3-DPGM
- Seudocianosis  metaHb reductasa a NADH
b) No eritrocitario:
 Eritropatías eritrocitarias: enfoque
3) Cuadro clínico
a) No eritrocitario:
mutaciónNO inestabilidad

- PFK: enf. depósito glucógeno tipo VII

= gen en GR y otros tejidos

( enf McArdledef. fosforilasa)

- fatiga muscular, calambres
- intolerancia ejercicio
- mioglobinuria
- hiperuricemia ( catabol. purinas)
- TPI: - disfunción neurológica franca
- cardiopatía con muerte súbita
- PGK - retardo mental
(♂) - mioglobinuria
- ADA - inmunodeficiencia
- Cb5r - retardo mental y de desarrollo
 Deficiencia HK (OMIM 235700)

17 familias descriptas
3 pacientes con caracterización molecular

1) - 529 Leu  Ser

- ¿?  salteo exon 6 (AHCNE)
2) - 680 Thr  Ser homocigota (AHCNE)
3) - deleción fuera de marco de exones 5 - 8
(muerte intraútero)
 Deficiencia GPI (OMIM 172400)
50 familias descriptas
29 mutaciones identificadas
24 con sentido equivocado
3 sin sentido
2 alteración empalme

- AHCNE con exacerbaciones infecciosas

- Disfunción - neurológica en pocos
- granulocitos casos

Propiedades de las variantes

- Propiedades cinéticas ± conservadas
- Marcada termoinestabilidad
 Deficiencia PFK (OMIM 171850)
Mutaciones gen PFKL ( M4 en GR)
- AHCNE leve sin miopatía
Mutaciones gen PFKM ( L4 en GR)
- AHCNE (2,3-DPG  x bloqueo enzim.)
- mioptía
30 familias (1/3 de origen judío)
15 mutaciones identificadas:
- IVS-5 +1 GA
- c. 2003 - C (exon 22)
(- mutación sin sentido en exon 26
en springer spaniel inglés)
 Deficiencia Aldolasa (OMIM 103850)
5 familias = 6 pacientes
1) AHCNE + retardo mental + alt. dismórficas
(Beutler)
2) 3) AHCNE + exacerbaciones x infecciones
(Miwa) 128 AspGly homocigota (1 pac)
4) AHCNE + miopatía + retardo psicomotor
(Kreuder) 206 GluLys homocigota
5) AHCNE Tf dependiente + muerte a los 4
años por rabdomiolisis (Yao)
- 303 ArgFin
- 338 CysTyr
6) ¿AH? + síntoma miopáticos al nacimiento
(Espósito) 346 GlySer heterocigota
 Deficiencia TPI (OMIM 190450)
14 mutaciones
(74% = 104 GluAsp originado en Europa N)

- AHCNE + hiperbilirrubinemia neonatal

(exsanguinotransfusión)
 DHAP x 20-60
- Disfunción neurológica progresiva
(2 hermanos húngaros con/sin disfunción)
- Susceptibilidad  a infecciones
- Miocardiopatía
 Deficiencia PGK (OMIM 311800)
14 mutaciones identificadas
252 GluAla + empalme aberrante
( ARNm en 90 %)

Cuadro clínico generalmente incompleto:

- AHCNE (± compensada)
- Disfunción SNC
- Miopatía
 Deficiencia 2,3DPGM (OMIM 222800)
2 familias

Eritrocitosis 2ª a  2,3DPG

1) - 89 ArgCys (BPGM Créteil I)

- -N  Fin premturo  péptido truncado
(BPGM Créteil II)

2) 62 ArgGln homocigota
+  AE G6PD
 Deficiencia PK (OMIM 266200)
Prevalencia 51 casos / millón blancos
> 160 mutaciones identificadas
(70 % con sentido equivocado)

- AHCNE (compensada  muerte neonatal

hidropesía fetal)
- reticulocitosis esp. postesplenectomía
-  ATP  2,3-DPG
- expresión isoenzima PK-M2 en casos
severos (permite sobrevida)
 Enzimopatías: estudio de laboratorio
- valores e índices hematimétricos
- morfología eritrocitaria
- reticulocitos, bilirrubina, LDH, haptoglobina
- autohemólisis sin y con glucosa
- pruebas de detección (Ej: Brewer)
- intermediarios glicolíticos
- actividad enzimática
- propiedades cinéticas
- estudio molecular
 O2
Reducción oxígeno
univalente e

Superóxido
dismutasa
del O2
O2 – •
superóxido
Haber-Weiss
Reacción de

2H+ e

Catalasa
H2O2
Peróxido de H
e

peroxidasa
OH

Glutation
-
2 GSH
OH •
hidroxilo
H+ e GS-SG
–
anión
H2O
• radical agua
Glucosa Glu H 2O + ½ O 2 MetaHb
HK
Cys - prevención
 GC Catalasa - reducción
G6P Gly Fe++
NADP+ 2 GSH H2O2 Hb Cb5+++ NADH
G6PD

NADPH Cb5++ NAD+

GS=SG-R GSH-P
F6P

6PG (FAD) (Se)

NADP+ AzMet NADPH
6PGD

ox
Fe+++
NADPH GS=SG 2 H20 Hb AzMet NADP+
F1-6DP

R5P red
Hemicromos reversibles

PRPP Hemicromos irreversibles

G3P Cuerpos de Heinz
G6PD: variantes Velocidad electroforética
Clases OMS rápida normal lenta
I AHCNE

II < 10 % Unión Mediterr.Santamaría

Actividad enzimática

AH x stress
oxidante
Cantón

III 10 - 60 % A- 202 Seattle

A- 680
A- 968
IV 60 - 110 % A B

V > 110 %
G6PD: frecuencia génica
en negros americanos

Variante A 0.11
Variante A- 0.2
200
G6PD: actividad enzimática (%)
AE

110 %
100

60 %

0
60 días 120
Herencia de patología ligada al cromosoma X
Normal Normal Hemicigota Normal

Normal Heterocigota Hemicigota Heterocigota

Normal Homocigota Hemicigota Homocigota

 AE = 50 %

AE = 30 %

AE = 70 %
Lyon – Beutler = mosaicismo
 Deficiencia G-6PD – Cuadro clínico
- Anemia hemolítica crónica no esferocítica (AHCNE)
- Crisis hemolítica por stress oxidante
Clase II: más precoz, más severa, potencialmente mortal
Clase III: más tardía, menos severa, autolimitada
- Infecciones (GR = espectador inocente? Oxido nítrico?)
- bacterianas (neumonía), virales (hepatitis)
- Drogas (o sus metabolitos) = listas
- Favismo (Vicia faba) = vicina divicina
convicina isouramilo
Heterogeneidad: geográfica, familiar, individual
Individuo: mutación, edad, ß-glucosidasa
Habas: cantidad, maduración, preparación
- Ictericia neonatal por hipoconjugación (inmadurez, Gilbert)
por hiperhemólisis (infecciones, drogas)
- Acidosis diabética AE % GR Otros
- Efectos sobre otras células I 0-1 3
leucocitos: predisposición infecciones II 5 30
cristalino: cataratas III 12 >60
Deficiencia G6PD
Deficiencia G6PD – Cuerpos de Heinz
 Deficit G-6PD: metodología diagnóstica
1) Pruebas de detección: mancha fluorescente
prueba de Brewer
prueba de Jacob-Jandl
2) Actividad enzimática: Medir NADPH a 340 nm
Ojo: - hemólisis reciente: edad celular, % reticulocitos
- transfusión reciente
- contaminación neutrófilos
Opciones: esperar 2-3 semanas
comparar con otras enzimas (Hx – TGO)
estudio familiar
3) Movilidad electroforética
4) Propiedades: Km G6P 25o C
Km NADP 25o C
Ki NADPH 25o C
sustratos análogos: 2-deoxi-glucosa-6P
galactosa-6P
deamino-NADP
termoestabilidad a 51o C
actividad a diferentes pH
5) Estudio molecular
 G6PD dimérica
Modelo tridimensional
 Gen Gd (Xq28)

F8C
CBBM
TEL CEN
(GpC)
5´ 3
´ G6P NADP
Exon = II
(1) 205
V
386-387
X515 = 59256 daltons
436 pb (Intron II: 9857 pb) Gen: 18500 pb
(Met)Ala Lys Lys Arg
Acetilada

Dímero

Tetrámero
 Aminoácidos
1 100 200 300 400 500

I
II
III
IV Mutaciones gen G-6PD
Detección G-6PD (-) en dadores de sangre

Innecesario en áreas con alta incidencia de

variantes clase III
(hemólisis potencial equivalente a bolsa en
el límite de su vida útil)

Conveniente en áreas con alta incidencia de

variantes clase II

Imprescindible en exsanguinotransfusión por:

- alto porcentaje de células del dador
- inmadurez fetal
 G6PD y Plasmodium

GR G6PD (-) infectados con Plasmodium:

- > disminución del glutation reducido

- daño de membrana
- > fagocitosis por macrófagos
 Eritrocito vs. Plasmodium
Mecanismo Polimorfismo balanceado Error
protector Favorecido Desfavorecido genético
Banda 3 Heterocigota Homocigota
AA 400-408 del Ovalocitosis SEA Incompatible con vida

G-6PD Heterocigota? Hemicigota? G-6PD clase I

Clase II-III (en variantes no
funcionales incompatible
con la vida)

- talasemia - tal-2/-1 Enfermedad Hb H

Hidropesía fetal
-talasemia Talasemia menor Talasemia mayor Talasemias
o intermedia 3er. exon
Hb S A/S Rasgo S/S Anemia
 6GluVal drepanocítico drepanocítica
Duffy Fy a(-) b(-) (Ruido
(P. vivax) mutacional
de fondo)
Inactivación cromosoma X (5000 genes) = Mosaicismo
Poco después del implante:
- Embrión: al azar
- Tejidos extraembrionarios: inactivación X paterno
Modificación física “irreversible”: metilación
X metacromático: - cuerpos de Barr (células epiteliales)
- palillos de tambor (neutrófilos)
No inactivación de región seudoautosómica de cromos. X (Xp)
- Genes homólogos en cromosoma Y
- Genes no “ en cromosoma Y: descompensación
de dosaje ♀/♂
Fenotipos extremos: - inactivación precoz (≥ 8 células)
- selección +/- ventaja de crecimiento
(≠ en ≠ tejidos)
Ej: HPRT, G-6PD severa
- determinación genética
(gen activo en X inactivo)
 Determinación monoclonalidad
- Homogeneidad:
fenotipo extremo en todos los tejidos (comparar con otros tejidos)
fenotipo balanceado pero con selección +/- en el tejido en estudio
monoclonalidad posible: confirmar con marcador cromosómico
rearreglo genético
- Heterogeneidad: policlonalidad segura

G-6PD: ≠ a nivel movilidad electroforética

≠ a nivel molecular: 1311 T/C = polimorfismo panétnico

16 % (9/54) Europa
40 % (5/20) Africa
5 % (3/59) Asia
45 % /9/20) India
10 % (3/30) América

Monoclonalidad +: miomas, HPN, linfomas, etc.

-: procesos reactivos, Ca colon, TMO
Enzimas glicolíticas: funciones no enzimáticas

- G6PI: factor de motilidad autocrino

(metástasis melanoma)
- HK mitocondrial: inhibe apoptosis
(interactúa con proteína BAD proapoptótica)
- GA3PD: favorece apoptosis
- HK - GA3PD - Enol - LDH: regulan
transcripción de diversos genes y
oncogenes.