Investigador: Maija Ruklisha

Biosíntesis de L-Valina durante los cultivos discontinuos y (Process Biochemistry)

alimentados por lotes de Corynebacterium glutamicum: relación entre
cambios en la tasa de crecimiento bacteriano y el metabolismo Presentación:
intracelular Fernanda Landeros Rivera

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Introducción

La cantidad producida de
aminoácidos de cadena ramificada
(como la L-isoleucina, L-leucina y
Corynebacterium glutamicum es la L-valina) es baja y no satisface la
bacteria más utilizada para la demanda del mercado.
producción industrial de
aminoácidos.

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Introducción

La razón radica en los

complicados mecanismos de
control de síntesis.

Por ello, para garantizar la sobreproducción de dichos

Figura 1. aminoácidos por células bacterianas se requiere la construcción
Corynebacterium glutamicum de mutantes con los genotipos deseados.

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Objetivos

Dilucidar algunos C. glutamicum ATCC 13032 recombinantes por su capacidad para

producir L-valina, así como para caracterizar la relación entre cambios dinámicos en su
tasa de crecimiento celular, la actividad de enzimas clave involucradas en el
metabolismo central y la vía de síntesis de L-valina durante los cultivos discontinuos y
alimentados.

Determinar la tasa óptima de crecimiento celular y parámetros del metabolismo

intracelular óptimo para elevar la tasa específica de células de síntesis de L-valina y su
experimental rendimiento por recombinantes de C. glutamicum.

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Materiales y métodos

Microorganismos y
condiciones de cultivo

• Cepas: C. glutamicum ATCC 13032, auxótrofo para L-isoleucina resistente al cloranfenicol, auxótrofo para L-
isoleucina resistente a la kanamicina. *Todas las cepas tenían autotrofía para leutina.
• Los cultivos se realizaron a 30ºC. Complejo de infusión cerebro y corazón.
• Biorreactor de tipo Mini MBR (Suiza) con un volumen de trabajo de 1,81. Presión parcial de oxígeno.
• PH 7.0 del cultivo celular.

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Materiales y métodos

Parámetros fisiológicos y Procesamiento de datos

bioquímicos

• Se llevó a cabo el cálculo de la • Para determinar los parámetros cinéticos,

concentración de biomasa celular (cdm), se realizaron al menos 3 corridas con 3 a 6
así como el rendimiento experimental de réplicas para cada estimación de la media.
masa celular y L-valina.
• La desviación estándar de la media se
• Ensayos de enzimas. calculó mediante Microsoft Excel.
• Ensayos de concentraciones de compuestos
intracelulares.

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Resultados

Crecimiento y síntesis de L-valina por C. glutamicum recombinantes

Se demostró que el máximo crecimiento C. glutamicum ATCC 13032M puede alcanzar la tasa
máxima de esta cepa, fue 1.9- o 1.5 veces mayor.
Asimismo, la actividad máxima de síntesis de L-valina puede ser alcanzada por C.
glutamicum ATCC 13032, pues de esta cepa fue 5.7 o 1.4 veces mayor.

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Resultados

Relación entre cambios de tasa de crecimiento en C. glutamicum, síntesis de L- valina y metabolismo

intracelular

Modificaciones genéticas en un tipo salvaje C. glutamicum ATCC 13032 provocaron cambios

simultáneos en la tasa de crecimiento celular y en la tasa específica de células de producción
de L-valina.
Se podría sugerir que el aumento en la sobreproducción de L-valina por recombinantes está
conectada con la disminución de la tasa de crecimiento o sus cambios asociados en el
metabolismo de bacterias.

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Figura 2. Cinética de (A) tasa de crecimiento celular; (B) la célula específica de L-valina
tasa de síntesis; (C) actividad de acetoxidroxiácido sintasa y (D) L-valina intra-
concentración celular en células de C. glutamicum durante los cultivos por lotes. 9
Resultados

Además:

• Se demostró que la suplementación con L-isoleucina al cultivo celular en el biorreactor dio

como resultado una tasa de crecimiento celular mantenimiento a un nivel bastante similar al
del "inicio“.
• No hubo diferencia significativa entre la concentración de piruvato intracelular y actividad
AHAS en células recogidas después de 6 h de ambos cultivos.

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Discusión

• Una transición en la tasa de crecimiento microbiano

por debajo del máximo durante los lotes y los
cultivos alimentados en el estudio fue demostrado
ser un parámetro óptimo de fisiología celular para
aumentar la actividad de AHAS y la sobreproducción
de L-valina por recombinantes de C. glutamicum
ATCC 13032.
• Así pues, la tasa de crecimiento durante los cultivos
por lotes podría ser una consecuencia de un aumento
en la disponibilidad intracelular de piruvato.
Además, AHAS en esta bacteria de ha caracterizado
por una baja afinidad para piruvato
• Como todas las cepas utilizadas tenían auxotrofía
para L-isoleucina, la razón de la baja regulación de
la tasa de crecimiento celular durante los cultivos
por lotes podrían ser aminoácidos extracelulares
limitación de concentración o su limitación
intracelular causada por L-isoleucina captación de
inhibición por L-valina acumulada.

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Conclusión

La transición en el crecimiento bacteriano de la tasa por debajo del máximo podría ser un parámetro
óptimo de fisiología celular, un aumento en la concentración de piruvato intracelular, AHAS y actividad
de G-6-PDH en las células, parámetros de bioquímica intracelular óptima para lograr una actividad
razonable de síntesis de L-valina por recombinantes de C. glutamicum durante los cultivos discontinuos
y alimentados.

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